Name: זיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי בתגובה חיסונית באורז עם בדיקת כימילומינסנציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: למדו שיטת כימילומינסנציה מבוססת L-012 לזיהוי בזמן אמת של ROS ברקמות אורז בתגובה חיסונית. פרוטוקול זה מאפשר מחקר מהימן של תהליכי חמצון בתאי צמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן שנחאי למדעי הטבע (מספר מענק: 21ZR1429300/BS1500016), אוניברסיטת שנגחאי ג'יאו טונג (תוכנית Agri-X, מספר מענק: AF1500088/002), מרכז החדשנות השיתופית של שנחאי של זרעים חקלאיים (מספר מענק: ZXWH2150201/001) לג'יאנגבו פאן, ועל ידי פרויקט שיתוף הפעולה הרפואי-הנדסי של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנגחאי (מספר מענק: 21X010301734) לקאן לי.

הערה: הפרוטוקול חל על רקמות צמחים שונות. נדן אורז ודיסקיות עלים שימשו בפרוטוקול זה לזיהוי ROS עם אליציטוט PAMP. מכיוון שהבדלים נובעים בעיקר משיטת הדגימה, רק ההליכים הנפוצים מתוארים להלן, כאשר שלבים ספציפיים מוזכרים במידת הצורך.
1. תרבות צמחים
<ol><li>לעקר את זרעי האורז dehusked עם 70% אתנול במשך 1 דקות, ולאחר מכן עם 40% hypochlorite נתרן (NaClO) במשך 1 שעה. לאחר מכן, שטפו את הזרעים 5x במים סטריליים כדי להסיר שאריות כלור.</li>
	<li>צלחת את הזרעים aseptly על 1/2 MS בינוני (2.37 גרם / ליטר Murashige ו Skoog (MS) בינוני, 30 גרם / ליטר סוכרוז, 2.1 גרם / ליטר phytagel, pH 5.7, autoclaved).<ol><li>בשיטת נדן האורז, ישירות צלחת את הזרעים בכלי זכוכית סטרילי עם MS בינוני.</li>
		<li>בשיטת דיסק העלים, ציפו את הזרעים על צלחות טרשת נפוצה במשך 5-7 ימים ושתלו אותם במטריצת גדילה או באדמה (איור 1A).</li>
	</ol></li>
	<li>לגדל את השתילים בחדר צמיחה עם 12 שעות אור / 12 שעות כהה.</li>
</ol>2. הכנת רקמות וטיפול מקדים
<ol><li>נדן אורז<ol><li>חתכו את הנדן משתילי אורז בני 10 ימים למקטעים של 3 מ"מ עם סכין גילוח חד או להב כירורגי לטיפול מקדים יום אחד לפני בדיקת ROS (איור 1B).</li>
		<li>הניחו חמישה מקטעי נדן בבאר נפרדת של צלחת מיקרוטיטר בת 96 בארות המכילה 100 μL של ddH 2 O למשך 10-12 שעות, בחושך בטמפרטורה של 25°C, מה שמאפשר לדליפת יונים הקשורה לפציעה ולתגובות ההגנה לשכך (איור 2). הערה: הקפדה על חיתוכים אנכיים כדי להבטיח שטח פנים חיתוך עקבי החשוף לפתרון האליציטוט היא צעד חשוב להשגת תוצאות הניתנות לשחזור ברמה גבוהה. הזיזו את המקטעים בעדינות. אל תבצע חתכים או פצעים נוספים במקטעים, שעלולים להוות מקור לשונות נתונים. כעיקרון, כל בדיקה חייבת להכיל לפחות חמישה עותקים משוכפלים מכיוון שהשונות של ערך ה- ROS גדולה. ככל שקיימים יותר עותקים משוכפלים, כך הנתונים אמינים יותר.</li>
	</ol></li>
	<li>דיסק עלה<ol><li>חותכים את דיסקיות העלים (בקוטר 4 מ"מ) מצמחי אורז בני 4-6 שבועות באמצעות ניקוב ביופסיה עם בוכנה. חתכו תמיד דיסקיות עלים מהשליש האמצעי של העלה השני (ממוספר מלמעלה) של העלה הראשי כדי לצמצם את השונות בנתונים (איור 1C).</li>
		<li>הניחו דיסקית עלה אחת בבאר בודדת של צלחת מיקרוטיטר בעלת 96 בארות המכילה 100 μL של ddH 2 O למשך10-12 שעות לטיפול מקדים, מה שמאפשר לתגובות הקשורות לפציעה לשכוך מאחר שהן עלולות להפריע להשראת ROS על-ידי PAMPs (איור 2). הערה: הפעל את דיסקיות העלים בעדינות. אין לבצע חתכים או פצעים נוספים על הדיסקים בניסוי, דבר שעלול לגרום לשינויים בנתונים. השראת ROS מתרחשת בעיקר מתאי הקצה החתוך, שכן פני השטח של רקמות האורז (עלים או נדן), מכוסים בשכבות הידרופוביות. רק התאים של הקצוות החתוכים נמצאים במגע עם פתרון האליציטוט (עיין בסעיף הדיון).</li>
		<li>שמור את כל דיסקות העלים צפות, כאשר פני השטח האבקסיאליים פונים כלפי מעלה, בבארות של צלחת מיקרוטיטר לטיפול מקדים במים כדי למנוע שינויים הקשורים לצד העלים.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig01.jpg"> איור 1: מצב הגידול והשלבים של שתילי אורז לדגימת נדן וחלקים מנדן האורז ועלי האורז ששימשו בבדיקה. (A) שתילי אורז הגדלים על 1/2 MS בינוני בתנאים סטריליים במשך 10 ימים ניתן לדגום עבור בדיקת ROS. זרעי אורז מעוקרים גודלו בתרבית בינונית של 1/2 MS וגודלו בפוטופריוד בהיר של 12 שעות / 12 שעות כהות בבקבוקון זכוכית שקוף, בקוטר 8.5 ס"מ ובגובה 15 ס"מ. (B) תרשים סכמטי של חלקי הדגימה של נדני עלים. נדני עלים נחתכו משתילי אורז בני 10 ימים. מיקומי נדן העלים היו מעל השורשים ומתחת לעלה הראשון. (C) תרשים סכמטי של מיקום הדגימה של דיסקיות עלים. ניתן לחתוך את דיסקיות העלים מהשליש האמצעי של העלה השני (ספירה מלמעלה) של המעבד הראשי של צמחי אורז בריאים בכל שלב צמיחה. קיצורים: ROS = מיני חמצן תגובתי; MS = Murashige ו Skoog. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64776/64776fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig02.jpg"> איור 2: תרשים סכמטי של מערך הלוחות למדידת ייצור ROS עם קווים שונים של Oryza sativa. טיפול מקדים ובדיקה של רקמות אורז באמצעות צלחת 96 באר. קו 1, קו 2 וקו 3 (עד שמונה קווים על צלחת אחת) יכולים להיות כל חומר מעניין, זנים שונים, מוטנטים או קווים טרנסגניים. הרקמות עוררו באמצעות תמיסות אליציטוט עם PAMP (PAMP, לבן) או ללא PAMP (ddH2O, אפור) כדי למדוד תגובת ROS. יש לציין כי ככל שהדגימות ייבדקו יותר, כך מרווח הזמן בין הקריאות ארוך יותר. קיצורים: ROS = מיני חמצן תגובתי; PAMP = תבנית מולקולרית הקשורה לפתוגן; ddH2O = מים מזוקקים כפול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64776/64776fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
3. הכנת פתרון האליציטוט
<ol><li>יש להמיס אבקת L-012 בתמיסה מימית של 20 מילימטר (6.23 מ"ג/מ"ל) עם ddH2O ליצירת תמיסת המלאי. לאחר מכן, דלל את תמיסת המלאי עם מאגר 50 mM Tris HCl (pH 7.5) כדי להפוך את פתרון העבודה בריכוז הסופי של 500 μM L-012. שמור את תמיסת המלאי קפואה ומדוללת לתמיסת העבודה לפני השימוש.</li>
	<li>הכינו את תמיסת האליציטוט המכילה PAMP, L-012 ופרוקסידז חזרת (HRP; 10 מ"ג/מ"ל ב-ddH2O). לקבלת תמיסת אליסיטציה של 10 מ"ל, יש לערבב 9.4 מ"ל של תמיסת Tris HCl (pH 7.5) של 50 mM, 400 μL של תמיסת L-012, 100 μL של HRP ו-100 μL של flg22 (PAMP; 10 mM ב-ddH2O). עבור הבקרה השלילית, הוסף 100 μL של ddH2O במקום PAMP. הערה: שמור את תמיסות האליציטוט המוכנות בטמפרטורת החדר כדי למנוע לחץ קר על רקמות האורז. PAMPs אחרים יכולים לשמש גם לטיפול לפי הצורך, כגון כיטין (20 ng / mL בריכוז הסופי). מכיוון ש- L-012 רגיש לאור, כסה את כל הצינורות המכילים תמיסת L-012 ברדיד אלומיניום.</li>
</ol>4. הפעלת התוכנה והגדרת הפרוטוקול עם קורא המיקרו-צלחות המופנה (ראה טבלת חומרים)
הערה: לוקח קצת זמן להגדיר את הפרמטרים של תוכנת קורא microplate. מומלץ להכין את המכונה והפרוטוקול (קליק אחד כדי להמשיך) לפני הוספת פתרון האליציטוט.
<ol><li>הפעל את התוכנה. לחץ על הלחצן ניסויים כדי ליצור פרוטוקול חדש או להשתמש בפרוטוקול קיים.</li>
	<li>לחץ על Procedure בחלון המוקפץ כדי להגדיר את הצלחת. בחר את הבארות מהצלחת שיש לנטר.</li>
	<li>לחץ על Start Kinetic כדי להגדיר את זמן הריצה הכולל ואת מרווח הזמן לקריאה. הגדר את זמן ההפעלה ל- 35 דקות או יותר, בהתאם לדרישות הניסוי. כדי להשיג קריאות בתדירות גבוהה ככל האפשר, בחר מרווח זמן מינימלי. עבור זמן שילוב, בחר 1 s או יותר, בהתאם לעוצמת האות. הערה: מרווח הקריאה תלוי במספר הדגימות ובמשך שילוב האותות.</li>
	<li>לחץ על אמת | אישור כדי לאשר את ההגדרות.</li>
	<li>לחץ על זהה את הצלחת החדשה בחלון המוקפץ והמתן עד שהתוכנה תבקש את תיבת הדו-שיח של צלחת הטעינה. הניחו את הצלחת לבדיקה על המנשא.</li>
	<li>עצרו כאן כדי להמתין להקמת מערכת האליציטוט (בסעיף הבא). ברגע שמערכת האליציטוט מוכנה, לחץ על הפעל כדי להתחיל בקריאה.</li>
</ol>5. הקמת מערכת אליסיטציה ומדידת ייצור ROS בזמן אמת
<ol><li>בזהירות להסיר את ddH2O מן הבארות המכילות את הרקמות שטופלו מראש, הימנעות כל נזק רקמות או התייבשות.</li>
	<li>השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 200 μL של פתרון elicitation לבארות המכילות את הרקמות.</li>
	<li>נערו בעדינות כדי לערבב. לחץ על הפעל כדי להתחיל בזיהוי. הערה: עם טיפול PAMP, רקמות הצמח מגיבות ומייצרות ROS מהר מאוד. לכן, מוצע לטפל תחילה בבקרה השלילית ללא PAMP כדי לקצר את זמן הניתוח, כאשר ישנם טיפולים מרובים. לפעול במהירות האפשרית כדי להפחית את עיכוב האליסיטציה בין הטיפולים. ככל שהזמן בין הוספת פתרון האליציטוט לתחילת הגילוי קצר יותר, כך לכידת נתוני ניסוי חשובים תהיה טובה יותר.</li>
</ol>

<ol><li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li>
<li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+are+good%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li>
<li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS%2C+calcium%2C+and+electric+signals%3A+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li>
<li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+gene+network+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li>
<li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+burst+of+plant+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li>
<li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li>
<li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li>
<li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+burst+oxidases%3A+the+engines+of+ROS+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li>
<li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li>
<li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li>
<li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li>
<li>Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li>
<li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe%2C+L-012%2C+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li>
<li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648(2015).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

מטרת מחקר זה הייתה לבסס שיטה יעילה ביותר לכימות ייצור מוקדם של ROS בתגובה ל-PAMP ברקמות אורז. שיטה זו מספקת הליך סטנדרטי לקביעה בזמן אמת של אפופלסט ROS המיוצר מרקמות אורז מטופלות. שיטה זו פשוטה בתפעול, נמוכה בעלות, ברורה בהרכב, ובלתי תלויה בערכות מסחריות. באמצעות שיטה זו, חוקרים יכולים לחקור את הייצור בזמן אמת של אפופלסט ROS כאשר צמחים נתונים לעקה ביוטית או אביוטית.
בפרוטוקול זה, L-012 נבחר כמגיב כימילומינסנציה מכיוון שהוא כימיקל לא רעיל. Luminol נמצא בשימוש נרחב במבחני chemiluminescence כדי ל...

מיני חמצן תגובתי (ROS) כוללים סדרה של נגזרות חמצן פעילות מבחינה כימית, כולל רדיקלים של אניון סופראוקסיד (O2-) ונגזרותיו, רדיקלים הידרוקסילים (OH-), מי חמצן, ותוצרים של חמצן סינגלט או תגובות חיזור חמצון, המיוצרים באופן קבוע בפלסטידים ובכלורופלסטים, מיטוכונדריה, פרוקסיזומים ומקומות תת-תאיים אחרים1 . ROS ממלא תפקידים חשובים בתהליכים ביולוגיים רבים והם חיוניים לכל הצמחים 2,3,4. הספקטרום הרחב של תפקודי ROS משתנה מוויסות גדילה והתפתחות ועד לתפיסה של עקה אביוטית וביוטית 5,6,7,8.
במערכת החיסון של הצמח, קולטנים מקומיים של קרום הפלזמה של תאי הצמח - מה שמכונה קולטני זיהוי תבניות (PRR) - תופסים כימיקלים שמקורם בפתוגן - תבניות מולקולריות הקשורות לפתוגנים (PAMPs). זיהוי זה מעורר סדרה של תגובות חיסוניות מהירות, כולל זרם סידן, התפרצות ROS ומפל MAPK; לכן, שכבת חסינות זו נקראת PAMP-triggered immunity (PTI). התפרצות ROS היא תגובת PTI בולטת, שקביעתה מיושמת באופן נרחב במחקרים הקשורים ל- PTI 9,10. ייצור ROS המופעל על ידי PAMPs מיוחס לחלבונים ממשפחת NADPH oxidase (הומולוג של קרום הפלזמה), או RBOH (Respiratory burst oxidase homolog), אשר מעבירים אלקטרונים מ-NADPH ציטוסולי או NADH לחמצן חוץ-תאי כדי לייצר סופראוקסיד (O 2-) אשר מומר באופן ספונטני למי חמצן (H 2 O 2) על ידי סופראוקסיד דיסמוטאז8 . פרץ ROS המופעל על ידי PAMP הוא מהיר למדי, מופיע רק כמה דקות לאחר טיפול PAMP ומגיע לשיא של ~ 10-12 דקות. הרוב המכריע של מולקולות ROS מכילות מי חמצן (H 2 O2), אשר ניתן לזהות בקלות ובהתמדה באמצעות בדיקת כימילומינסנציה.
בכימילומינסנציה, מגיב הכימילומינסנציה מגיב עם חמצן פעיל, תחת פעולה של זרז, כדי לייצר את מתווכי המצב הנרגש. לאחר מכן, האלקטרונים במכפלה חוזרים למצב הקרקע באמצעות מעבר לא קרינתי ופולטים פוטונים. ריאגנטים כימילומינסנטיים נפוצים כוללים luminol ו- L-012, כאשר luminol שולט ביישום11,12,13. עם זאת, חוקרים נוספים בוחרים ב- L-012 כדי לזהות ייצור ROS, מכיוון של- L-012 יש יעילות פליטת אור גבוהה בהרבה בתנאי pH ניטרליים או כמעט ניטרליים בהשוואה ללומינול.
מאמר זה מתאר שיטת כימילומינסנציה אופטימלית, המבוססת על L-012, לזיהוי בזמן אמת של ייצור ROS לאחר חיסול PAMPs בדיסקים ובמעטפת של רקמות-עלי אורז (Oryza sativa). השיטה המסופקת כאן היא פשוטה, יציבה וסטנדרטית, והיא ניתנת להתאמה גבוהה כדי לענות על צרכים ניסיוניים שונים. הנתונים המתקבלים בשיטה זו ניתנים לשחזור גבוה בתנאים מבוקרים היטב.

<table><tbody><tr><td>צלחת מיקרוטיטר 96 בארות</td><td>WHB</td><td>WHB-96-01</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>Innochem</td><td>A43543</td><td></td></tr><tr><td>flg22</td><td>סנגון ביוטק</td><td>p20973</td><td>PAMP</td></tr><tr><td>Gen5</td><td>תוכנת BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-012</td><td>FUJIFILM</td><td>120-04891</td><td>8-אמינו-5-כלורו-7-פניל-2,3-דיהידרופירידו [3,4-d] פירידזין-1,4-דיון, CAS #:143556-24-5</td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>MS בינוני</td><td>Solarbio</td><td>M8521</td><td></td></tr><tr><td>NaCLO</td><td>Aladdin</td><td>S101636</td><td></td></tr><tr><td>פרוקסידאז מחזרת (HRP)</td><td>Sigma</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Sampler</td><td>Miltex&nbsp;</td><td>15110-40</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A502792</td><td></td></tr><tr><td>טריס</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A610195</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי בתגובה חיסונית באורז עם בדיקת כימילומינסנציה

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

מיני חמצן תגובתי (ROS) ממלאים תפקידים חיוניים במגוון תהליכים ביולוגיים, כולל חישה של עקה אביוטית וביוטית. עם זיהום פתוגן או אתגר עם כימיקלים הקשורים לפתוגן (דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגנים [PAMPs]), מערך של תגובות חיסוניות, כולל התפרצות ROS, מושרות במהירות בצמחים, אשר נקרא PAMP-triggered immunity (PTI). התפרצות ROS היא תגובת PTI בולטת, אשר מזרזת על ידי קבוצה של NADPH oxidases מקומי של קרום פלזמה - חלבונים ממשפחת RBOH. הרוב המכריע של ROS מורכב מי חמצן (H 2 O2), אשר ניתןלזהות בקלות ובהתמדה על ידי שיטת chemiluminescence מבוסס luminol. כימילומינסנציה היא תגובה המייצרת פוטונים שבה לומינול, או הנגזרת שלו (כגון L-012), עובר תגובת חמצון-חיזור עם ROS תחת פעולה של זרז. מאמר זה מתאר שיטה כימילומינסנציה אופטימלית מבוססת L-012 לזיהוי ייצור אפופלסט ROS בזמן אמת עם אליציטוט PAMP ברקמות אורז. השיטה קלה, יציבה, סטנדרטית וניתנת לשחזור בתנאים מבוקרים היטב.

כאן, אנו לוקחים חומר אורז כדוגמה כדי לקבוע את ROS המיוצר עם טיפול flg22. הדור של ROS לאחר אליציטוט הוא חולף. באורז, העלייה בייצור ROS זוהתה לראשונה תוך 1-2 דקות, הגיעה לשיא של 10-12 דקות, וחזרה לקו הבסיס תוך ~30-35 דקות (איור 3). בהשוואה למבחן הביקורת, שבו PAMP נעדר בתמיסת האליסיטציה וכתוצאה מכך לא היה אינדוקציה ברורה של ROS, פרץ ROS ספציפי נגרם רק כאשר תמיסת האליציטוט הכילה flg22, או PAMP אחר, כגון כיטין. בינתיים, ניתן לחשב את הסכום הכולל של ROS מהעקומה (איור 4...

במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי אפופלסטי (ROS) ברקמות אורז בתגובה חיסונית מולקולרית המופעלת על ידי תבניות מולקולריות הקשורות לפתוגן. שיטה זו פשוטה, סטנדרטית ומייצרת תוצאות הניתנות לשחזור בתנאים מבוקרים.

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה כימילומינסנציה אופטימלית מבוססת L-012 לזיהוי ייצור ROS בזמן אמת עם אליציטוט PAMP ברקמות אורז. שיטה זו קלה, סטנדרטית וניתנת לשחזור בתנאים מבוקרים היטב. מי שתדגים את ההליך הזה תהיה און יינג, דוקטורנטית מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, לעקר את זרעי אורז dehusked עם 70% אתנול במשך דקה אחת, ולאחר מכן עם 40% hypochlorite נתרן במשך שעה אחת. שטפו את הזרעים חמש פעמים במים סטריליים כדי להסיר שאריות כלור. בשיטת נדן האורז, ישירות צלחת את הזרעים בכלי זכוכית סטרילי עם Murashige ו Skoog או MS בינוני.כדי לצלחת את הזרעים בשיטת דיסק העלים, צלחת אותם על לוחות MS במשך חמישה עד שבעה ימים ולאחר מכן להשתיל אותם על מטריצת הצמיחה או הקרקע. לגדל את השתילים בחדר צמיחה עם 12 שעות אור ו 12 שעות צילום כהה. חותכים את הנדן משתילי אורז בני 10 ימים לשלושה מקטעים מילימטריים עם סכין גילוח חד או להב כירורגי לטיפול מקדים יום לפני בדיקת ROS.מניחים חמישה קטעי נדן בבאר בודדת של צלחת מיקרוטיטר 96 באר המכילה 100 מיקרוליטר מים מזוקקים כפול למשך 10 עד 12 שעות. חותכים את דיסקיות העלים מצמחי אורז בני ארבעה עד שישה שבועות באמצעות ניקוב ביופסיה עם בוכנה. חתכו תמיד את דיסקיות העלים מהשליש האמצעי של העלה השני של העלה הראשי כדי להפחית את השונות בנתונים.לאחר מכן, הניחו דיסק עלה אחד בבאר בודדת של צלחת מיקרוטיטר 96 באר המכילה 100 מיקרוליטר מים מזוקקים כפול למשך 10 עד 12 שעות לטיפול מקדים. שמור את כל דיסקיות העלים צפות ופונות כלפי מעלה בבארות של צלחת מיקרוטיטר לטיפול מקדים במים כדי למנוע שינויים הקשורים לצד העלה. הכן תמיסת אליסיטציה על ידי שילוב של 9.4 מיליליטר של 50 מיקרומולר Tris Hcl, 400 מיקרוליטר של תמיסת L012, 100 מיקרוליטר של פרוקסידז צנון סוס ו -100 מיקרוליטר של Flg22.הוסף 200 מיקרוליטר של פתרון אליסיטציה לבארות. הפעל את התוכנה ולחץ על כפתור הניסויים כדי ליצור פרוטוקול חדש או להשתמש בפרוטוקול קיים. לחץ על הליך בחלון הקופץ כדי להגדיר את הצלחת ובחר את הבארות מהצלחת שיש לפקח עליה.לחץ על התחל קינטי והגדר את זמן הריצה ל- 30 דקות או יותר, בהתאם לדרישות הניסוי. בחר מרווח זמן מינימלי כדי לקבל את הקריאות בתדירות גבוהה ככל האפשר. ועבור זמן אינטגרציה, בחר שנייה אחת או יותר בהתאם לעוצמת האות.לחץ על אימות, ואחריו בסדר כדי לאשר את ההגדרות, ואז לחץ על זהה את הצלחת החדשה בחלון הקופץ והמתן עד שהתוכנה תבקש את תיבת הדו-שיח של צלחת הטעינה. הסר בזהירות את המים המזוקקים הכפולים מהבארות המכילות את הרקמות שטופלו מראש, תוך הימנעות מכל נזק לרקמות או התייבשות. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 200 מיקרוליטר של פתרון אליסיטציה לבארות המכילות את הרקמות.הניחו את הצלחת לבדיקה על המנשא והתחילו בזיהוי. כדי לגרום ל-ROS על ידי Flg22, נעשה שימוש בדיסקי עלים ובנדנים באורך שלושה מילימטר. דור ROS מנוטר במשך 35 דקות.העמודות מציינות את אמצעי סטיות התקן המחושבות מחמש חזרות טכניות. באורז, העלייה בייצור ROS זוהתה לראשונה תוך דקה או שתיים, הגיעה לשיא תוך 10 עד 12 דקות וחזרה לקו הבסיס תוך 30 עד 35 דקות. הסכום הכולל של ROS חושב מהעקומה.כדי להשיג את הסכום הכולל של ערכי ROS, החל את הנוסחה על ערכות הנתונים המתאימות כדי לחשב את ה- ROS שנוצר בכל מרווח זמן, שניתן לשלב על-ידי החלת סכום הנוסחה לחישוב הסכום הכולל שנוצר. חור בודד או שני חצאים של דיסקית עלה הוכנסו לבארות של צלחת מיקרוטיטר באר 96 שטופלה ב-100 מיקרוליטר מים מזוקקים כפול במשך 10 עד 12 שעות ולאחר מכן טופלה ב-Flg22 להשראת ROS. ערכי הקריאה משני חצאי הדיסק גבוהים בהרבה מאלה של דיסק העלה כולו.בממוצע, הערכים הכוללים של שני חצאי דגימות הדיסק הם כמעט פי 1.6 מאשר מכל דיסק הדף, שהוא פרופורציונלי לאורך הקצה, לא לאזור הדגימות. תוצאה זו תומכת בכך ש-ROS נוצרים בעיקר בתאים באתר הפצע. כאשר מנסים לבצע הליך זה, יש לנתח עם הרקמות בעדינות ולא לבצע חתכים מיותרים שעלולים להוות מקור לשינויים בנתונים.שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל תהליכים פיזיולוגיים אחרים המייצרים ROS ברקמות הצמח.

real-time-detection-reactive-oxygen-species-production-immune

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מציעים שיטות פשוטות כדי לבחון ולהעריך את הנוכחות של מינים חמצן תגובתי בתאים.

הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) סרטן

שיטה יעילה כדי להשיג תובנות לדמיין את האינדוקציה אוטוקריני הנגזרות ROS של האנדותל Ca2 + איתות מתואר. שיטה זו מנצלת את מדידת ROS נגזר אוטוקריני מופעלות Ca2 + לגיוס בתאי האנדותל בכלי הדם במודל שיתוף תרבות.

ויזואליזציה של כלי דם Ca 2 + איתות מופעלות על ידי ROS נגזר אוטוקריני

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת התפרצות חמצונית בעלי ארבידופסיס לאחר חיסול מערכת החיסון. דיסקיות עלים, חתוכות מעלי צמחים, מודגרות בפפטידים חיידקיים המתפקדים כתבניות מולקולריות הקשורות לחיידקים או MAMPs. עם גילוי MAMPs, תאים צמחיים לגרום לייצור של ROS חוץ-תאי, אשר מזוהה באמצעות מבחן chemiluminescence.

בדיקה לגילוי פרץ חמצוני בדיסקיות עלי ארבידופסיס בעת האצה חיסונית

סרטון זה מדגים בדיקה לזיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) ברקמות אורז לאחר אליציטוט תבנית מולקולרית קשורה לפתוגנים (PAMP). מקטעי נדן חתוכים ודיסקי עלים נחשפים לפפטיד שמקורו בשוטונים חיידקיים המתפקד כ-PAMP. עם זיהוי הפפטיד באמצעות קולטני זיהוי תבניות (PRR) על תאי הצמח, מתרחש ייצור מהיר וחולף של ROS, אשר מזוהה באמצעות בדיקת כימילומינסנציה.

בדיקה לאיתור ייצור מיני חמצן תגובתי ברקמת אורז עם התעוררות חיסונית

מתאמנים את סט של פרוטוקולים למדידה של מיני חמצן תגובתי (ROS) שניתן ליישם במודלים סלולריים אמבה ויונקים שונים למחקרים איכותיים וכמותיים.

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

נייר זה מתאר שתי שיטות לכמת את התגובות ההגנה באריידאופזיס thaliana בעקבות החשיפה elicitors החיסונית: פרץ חמצוני חולף, ואת עיכוב צמיחת שתיל.

תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות סה כ חמצן הסלולר מינים (ROS) באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA). שיטה זו יכולה להמחיש לוקליזציה של רוס הסלולר בתאי חסיד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית ועוצמה ROS מכמת עם קורא צלחת הקרינה. פרוטוקול זה הוא פשוט, יעיל וחסכוני.

גילוי של מינים החמצן תגובתי כוללת בתאי חסיד על ידי 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון di, מכתים

Escherichia coli הוא הגורם המוביל לדלקת קרום המוח חיידקית גראם שלילית יילודים. במהלך הזיהום החיידקי, מיני חמצן תגובתי המיוצר על ידי נויטרופילים לשחק תפקיד bactericidal גדול. כאן אנו מציגים שיטה לגילוי מינים חמצן תגובתי נויטרופילים בתגובה דלקת קרום המוח E. coli.

כימות בזמן אמת של מינים חמצן תגובתי נויטרופילים נגועים מנינגיטי Escherichia קולי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בדיקה כימוטקסיס משופר. מטרת פרוטוקול זה היא להפחית את הצעדים והעלויות של שיטות כימוטקסיס חיידקיות מסורתיות ולשמש משאב בעל ערך להבנת אינטראקציות בין צמחים למיקרובים.

בדיקת כימוטקסיס משופרת לזיהוי מהיר של כימותרפים ריזובקטריאליים באקסודות שורש

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית לכימות מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) באמצעות דיהידרואתידיום (DHE) כבדיקת צבע פלואורסצנטי באמצעות גישת סינון בתפוקה גבוהה. הפרוטוקול מתאר את השיטות להערכה כמותית של מיני חמצן תגובתי תוך-תאי (ROS) בשלושת קווי תאי הקרצינומה ההפטוצלולרית השונים.

הערכת סינון בתפוקה גבוהה של ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) באמצעות צבע פלואורסצנטי Dihydroethidium (DHE)

למדו שיטת כימילומינסנציה מבוססת L-012 לזיהוי בזמן אמת של ROS ברקמות אורז בתגובה חיסונית. פרוטוקול זה מאפשר מחקר מהימן של תהליכי חמצון בתאי צמחים.

זיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי בתגובה חיסונית באורז עם בדיקת כימילומינסנציה

גלה סרטונים נוספים