Name: פיתוח מהיר של מעגלי זיהוי מצב התא עם Poly-Transfection (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: למד לפתח מעגלי זיהוי מצב תאים במהירות באמצעות Poly-Transfection. שיטה זו מאפשרת בדיקה יעילה של רכיבים גנטיים מרובים בבאר אחת, תוך שימוש בציטומטריית זרימה למדידת הפלט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לחברי מעבדת וייס לשעבר שהובילו או תרמו לפיתוח שיטת הפולי-טרנספקציה ויישומה על מסווגי תאים: ג'רמי גאם, בר דיאנדרת' וג'ין הא; חברי מעבדה נוספים של וייס שתרמו לפיתוח/אופטימיזציה נוספים של השיטה: וונלונג שו, ליי וואנג וכריסטיאן קובה-סמאניגו; פרופ' ג'וש לאונרד וחברי הקבוצה, כולל פטריק דונהיו והיילי אדלשטיין, על בדיקת פולי-טרנספקציה ומתן משוב; ופרופ' ניקה שכיבה, שהזמינה את כתב היד הזה ונתנה משוב. ברצוננו להודות גם למכונים הלאומיים לבריאות [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; הקרן הלאומית למדע [1745645]; מענק תמיכה (ליבה) של מרכז הסרטן [P30CCA14051, בחלקו] מה- NCI, ומהמכונים הלאומיים לבריאות [P50GM098792] למימון עבודה זו.

הערה: טבלה 1 וטבלה 2 משמשות כהפניות משמעותיות לפרוטוקול זה. טבלה 1 מציגה קנה מידה של מגיבים עבור תגובות, וטבלה 2 מציגה אריתמטיקה של יחס דנ"א עבור דוגמה לפולי-טרנספקציה המתוארת בפרוטוקול (המחצית העליונה) ולניסוי המשך אפשרי (המחצית התחתונה).
1. הכנת תאים לטרנספקציה
<ol><li>יש לוודא כי תרבית תאי הכליה העוברית האנושית (HEK293) היא 60%-80% חופפת לפני תחילת הפרוטוקול. כדי לעשות זאת, זרע 1 x 106 תאים בתרבית רקמה 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי יומיים לפני, לדגור ב 37 ° C עם 5% CO2. הערה: למרות שהפרוטוקול שלנו מתמקד בתאי HEK293, ניתן להחליף סוגי תאים אחרים.</li>
	<li>הכן את המדיה והתאים לטרנספקציות כמתואר להלן.<ol><li>יש לחמם מראש לפחות 20 מ"ל של תמיסה של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA; ראו טבלת חומרים) עד 37°C. לחמם מראש לפחות 2.4 מ"ל של טריפסין ו 2.4 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS) ל 37 ° C גם כן. טרום חם מופחת סרום בינוני ~ 16 ° C. הערה: כל עבודת תרבית רקמות צריכה להתבצע בזהירות בארון בטיחות ביולוגית.</li>
	</ol></li>
	<li>השהה מחדש את התאים בתמיסת DMEM כמתואר להלן.<ol><li>לשאוף ולהיפטר מהתקשורת הנוכחית. יש לפזר 2 מ"ל PBS על תרבית התאים HEK293 כדי לשטוף את התאים. לשאוף ולהיפטר PBS.</li>
		<li>יש לפזר 2 מ"ל טריפסין על תרבית התאים HEK293. מניחים את צלחת הפטרי באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות או עד שהתאים כבר לא נצמדים לצלחת. החזירו את הצלחת לארון הבטיחות הביולוגית ודללו את תמיסת התא על ידי ניפוק 8 מ"ל של תמיסת DMEM לצלחת.</li>
		<li>מערבבים את התמיסה על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה מספר פעמים. שואפים את כל המדיה ומניחים אותה בצינור חרוטי של 15 מ"ל.</li>
	</ol></li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 3 דקות כדי להניע אותם. לשאוף את התקשורת (נזהר לא לשאוף את התאים) ולהשליך אותה. להשעות מחדש את התאים ב 5 מ"ל של תמיסת DMEM, ערבוב על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה.</li>
	<li>הערך את ריכוז התאים הנוכחי באמצעות מונה תאים אוטומטי (המופיע בטבלת החומרים). זרעו שש בארות (בדוגמה זו) בצלחת בת 24 בארות עם 1 x 105 תאים (לצפיפות זריעה של 50,000 תאים לסמ"ק2).</li>
	<li>הוסף את תמיסת ה- DMEM עד 500 μL (הוסף תחילה תמיסת DMEM לבארות), ולאחר מכן תייג באר אחת לכל טיפול באופן הבא: ללא בקרת צבע, בקרת mKO2, בקרת TagBFP, בקרת NeonGreen, בקרת כל הצבעים ופולי-טרנספקציה 1. בארות הבקרה TagBFP, mKO2 ו-NeonGreen הן בקרות צבע יחיד עבור כל החלבונים הפלואורסצנטיים הכלולים בפולי-טרנספקציה.</li>
</ol>2. ביצוע טרנספקציה
<ol><li>הכינו צינורות לכל צבר DNA. הניחו בצד צינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל ותייגו את הצינורות כך: ללא בקרת צבע, בקרת mKO2, בקרת TagBFP, בקרת NeonGreen, כל בקרת הצבע, תערובת פולי-טרנספקציה 1 ומיקס פולי-טרנספקציה 2.<ol><li>הוסף 36 μL של מדיום סרום מופחת לבקרת ללא צבע, בקרת mKO2, בקרת TagBFP, בקרת NeonGreen וכל צינורות בקרת הצבע. הוסף 18 μL של מדיום סרום מופחת לכל אחת מתערובת poly-transfection 1 ו- poly-transfection mix 2 tubes. הערה: ההנחה היא שריכוזי הפלסמיד הם 150 ננוגרם/מיקרוליטר.</li>
		<li>הוסף 600 ng של פלסמיד מילוי לצינור הבקרה ללא צבע. הוסף 300 ng של mKO2 ו- 300 ng של פלסמיד מילוי לצינור בקרת הצבע mKO2. הוסף 300 ng של TagBFP ו- 300 ng של פלסמיד מילוי לצינור בקרת הצבע TagBFP.</li>
		<li>הוסף 300 ng של פלסמיד NeonGreen מכונן ו 300 ng של פלסמיד מילוי לצינור בקרת צבע NeonGreen. הוסף 100 ng כל אחד של mKO2, TagBFP ו- NeonGreen המכונן, כמו גם 300 ng של פלסמיד מילוי, לצינור הבקרה של כל הצבעים.</li>
		<li>הוסף 150 ng של mKO2 לשפופרת Poly-transfection Mix 1. הוסף 75 ng של כתב NeonGreen פלסמיד ו 75 ng של פלסמיד מילוי לתערובת poly-transfection 1 צינור.</li>
		<li>הוסף 150 ng של TagBFP לצינור poly-transfection mix 2. הוסף 75 ng של פלסמיד L7ae ו 75 ng של פלסמיד מילוי לתערובת poly-transfection תערובת 2 צינור.</li>
	</ol></li>
	<li>צור את תערובת האב של הטרנספקציה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל על-ידי שילוב של 216 מיקרוליטר של תווך סרום מופחת עם 9.48 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה (ראה טבלה 1 עבור יחסי ריאגנטים וקנה מידה של תגובה). מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה, ומניחים בצד.</li>
	<li>הוסף 1.58 μL של מגיב משפר לכל אחד מפקדי ללא צבע, בקרת צבע יחידה וכל צינורות בקרת הצבע. הוסף 79 μL של מגיב משפר לכל אחד צינורות תערובת poly-transfection. מערבבים כל צינור בנפרד על ידי פיפטינג נמרץ.</li>
	<li>הוסף את תערובת האב של הטרנספקציה לכל צינור המכיל DNA.<ol><li>הוסף 37.58 μL של תערובת מאסטר טרנספקציה לכל אחד מפקדי ללא צבע, בקרת צבע יחידה וכל צינורות בקרת הצבע. מערבבים כל צינור בנפרד על ידי פיפטינג נמרץ.</li>
		<li>הוסף 18.79 μL של תערובת מאסטר transfection לכל אחד מצינורות תערובת poly-transfection. מערבבים כל צינור בנפרד על ידי פיפטינג נמרץ.</li>
	</ol></li>
	<li>מוציאים את תערובות הטרנספקציה לתוך הבארות.<ol><li>פיפטה 65.97 μL של כל תערובת transfection עבור צבע ללא צבע, צבע יחיד, וכל פקדי צבע לתוך הבארות המתאימות.</li>
		<li>פיפטה 32.98 μL של פולי-טרנספקציה מערבבים 1 לתוך באר הפולי-טרנספקציה ומערבלים את הצלחת במהירות אך בעדינות בתבנית הספרה שמונה הדוקה לאורך משטח שטוח כדי לפזר את הקומפלקסים ביעילות. לאחר מכן, פיפטה 32.98 μL של poly-transfection לערבב 2 לתוך אותה באר poly-transfection ולערבל את הצלחת באותו אופן.</li>
	</ol></li>
	<li>מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C, עם 5% CO2 וללא טלטול, לתקופה של 48 שעות. הערה: כדי להגדיל את כדאיות התא, ניתן להחליף את המדיה התאית כל 6 שעות לאחר הטרנספקציה (אם כי זה לא תמיד הכרחי, ועם תאי HEK293 ונגזרותיו, יש להיזהר לא לנתק את התאים מהצלחת בעת שינוי המדיה).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מגיב</td>
			<td colspan="3">כמות</td>
			<td colspan="3">שינוי גודל</td>
		</tr><tr><td>מדיום מופחת בסרום לתערובת DNA</td>
			<td colspan="3">36 μL לכל צינור בקרה, 18 μL לכל צינור poly-transfection</td>
			<td colspan="3">0.05 μL DNA מופחת בסרום בינוני/טבעי לכל צינור, עם נפח נוסף של 10-20% לטיפול בצנרת</td>
		</tr><tr><td>דנ א</td>
			<td colspan="3">300-600 ננוגרם לכל צינור</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>P3000</td>
			<td colspan="3">1.58 μL לכל צינור בקרה, 0.79 μL לכל צינור poly-transfection</td>
			<td colspan="3">0.0022 μL P3000/ng DNA לכל צינור, עם תוספת של 10-20%</td>
		</tr><tr><td>מדיום סרום מופחת לתערובת מאסטר Lipo</td>
			<td colspan="3">36 μL לכל צינור בקרה, 18 μL לכל צינור poly-transfection</td>
			<td colspan="3">0.05 μL הפחית את הדנ"א הבינוני/טבעי הכולל בסרום, עם נפח נוסף של 10-20% כדי להסביר את הפיפטינג</td>
		</tr><tr><td>מגיב טרנספקציה ומשפר</td>
			<td colspan="3">1.58 μL לכל צינור בקרה, 0.79 μL לכל צינור poly-transfection</td>
			<td colspan="3">0.0022 μL Lipofectamine 3000/ng DNA, עם 10-20% תוספת</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: קנה מידה מגיב עבור טרנספקציות. הטבלה מציינת את היחס הנכון של מגיב שיש לכלול עבור כמות הדנ"א הכלולה בבאר יחידה. זה יכול לשמש כדי לשנות את קנה המידה של תגובות ביעילות וליצור תערובות אב. כמויות של מגיב הוגדלו כדי לכלול עודף של 20%.
3. הכנת תאים לציטומטריית זרימה
<ol><li>מראש לחמם לפחות 4.2 מ"ל של פתרון DMEM ל 37 ° C. טרום חם לפחות 4.2 מ"ל של טריפסין ו 4.2 מ"ל של PBS עד 37 ° C. שמור על תמיסת חיץ מיון תאים המופעלת על ידי פלואורסצנטיות (FACS) ב- 4 ° צלזיוס עד שהיא מוכנה לשימוש.</li>
	<li>השהה מחדש את התאים בתמיסת החיץ FACS (PBS בתוספת 1% BSA, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA] ו-0.1% נתרן אזיד [NaN3], כדי להפחית גושים; ראה טבלת חומרים) כמתואר להלן.<ol><li>לשאוף ולהשליך את המדיה הנוכחית בכל באר. יש לפזר 5 מ"ל של PBS לתוך כל באר כדי לשטוף את התאים. לשאוף ולהיפטר PBS.</li>
		<li>יש להוציא 5 מ"ל טריפסין לכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, או עד שהתאים כבר לא נצמדים למנה. החזר את הצלחת לארון הבטיחות הביולוגית ודלל את תמיסות התאים על ידי חלוקת 5 מ"ל של תמיסת DMEM לכל באר.</li>
		<li>עבור כל באר, לערבב את הפתרון על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים. עבור כל באר, לשאוף את כל התקשורת ומניחים אותו בצינור חרוטי 15 מ"ל.</li>
	</ol></li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 3 דקות כדי להניע אותם. לשאוף את התקשורת, להיזהר לא לשאוף את התאים ולהשליך אותו. בכל צינור, להשהות מחדש את התאים ב 5 מ"ל של תמיסת חיץ FACS, ערבוב על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה.</li>
	<li>מעבירים כל תמיסת תרחיף תאים דרך מסננת (להסרת גושים) לצינורות חרוטיים ציטומטריית זרימה נפרדים. שמור צינורות אלה על קרח לא יותר מ 1 שעה, ולבצע ציטומטריה זרימה בהקדם האפשרי.</li>
</ol>4. ביצוע ציטומטריית זרימה
הערה: הפעלת ציטומטר זרימה דורשת הכשרה מתאימה וידע במשימות הדרושות. מכיוון שתוכנה וציוד עשויים להשתנות ויש להדריך משתמשים באופן כללי, סעיף זה מתייחס לפעולות ספציפיות שכדאי לבצע.
<ol><li>ראשית, בדקו את התאים הנגועים בבקרת פלסמיד המילוי (ללא בקרת צבע) כדי לבחור מאפייני תאים ולהימנע מחריגות (כולל אגרגטים, פסולת וכו '). אמנם ישנם שילובים רבים של פרמטרים להבחנה בין תאים, אך השתמש בשלוש האפשרויות הכלליות הבאות כדרך טובה להמחיש תכונות מבחינות.<ol><li>הסתכל על אזור הפיזור הצדדי (יומן רישום או קנה מידה ליניארי לפי העדפה/סוג תא) לעומת אזור הפיזור קדימה (קנה מידה ליניארי).</li>
		<li>הסתכלו על גובה הפיזור הצדדי (סולם היומן) לעומת רוחב הפיזור הצדדי (קנה מידה ליניארי).</li>
		<li>הסתכל על רוחב הפיזור קדימה (קנה מידה ליניארי) לעומת גובה הפיזור קדימה (קנה מידה ליניארי).</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר מכן, התבונן בפקדי הצבע היחיד. השתמש בבקרת כל הצבעים כדי לכוונן את מתחי המכשיר, כך שהאותות מכל חלבון פלואורסצנטי מנורמלים ליחידות שרירותיות שוות ערך (a.u.) של פלואורסצנטיות. לאחר מכן, הפעל את פקדי הצבע היחיד עבור כל חלבון פלואורסצנטי, המשמשים לקביעת מטריצת הפיצוי, ומאפשרים תיקון דימום. הערה: באופן אידיאלי, הטווח הדינמי המלא של ערכי הפלואורסצנטיות אמור להיות גלוי. נורמליזציה נוספת של אותות חלבון פלואורסצנטי יכולה להיעשות באמצעות המרה ליחידות סטנדרטיות (למשל, מולקולות של פלואורסצאין שווה ערך [MEFLs; ראו Beal et al.15]). כדי לאפשר המרת MEFL במהלך ניתוח, הפעל חרוזי כיול קשת. כיול כזה שימושי גם להפחתת שונות האות ממכשיר למכשיר ומהשתנות האות היומיומית16.</li>
	<li>הפעל את צינור הדגימה poly-transfection. הערה: במידת האפשר, מומלץ להריץ תאים בגודל 1,000 x 10^ (^ = תערובות), מכיוון שיש לחלק את הפולי-טרנספקציות בממדים גבוהים יותר לפחים נוספים במהלך הניתוח, וכל סל זקוק למספיק תאים (באופן אידיאלי >10) כדי לבצע השוואות מובהקות סטטיסטית.</li>
</ol>5. ביצוע ניתוח לאחר הניסוי
<ol><li>בתחילה, השתמש בנתונים מהפקדים (ואם רלוונטי, החרוזים) כדי להבטיח תוצאות מדויקות. השתמש באחד מכלי התוכנה הזמינים כדי לבצע gating תאים חיים (באמצעות שערים שתוארו לעיל), פיצוי ותיקון autofluorescence. הערה: בדרך כלל אנו משתמשים בקוד MATLAB מותאם אישית (לדוגמה, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis או Cytoflow17), הכולל גם ממשק משתמש גרפי וגם ספריית Python המתאימה לשלב העיבוד המוקדם ולניתוח פולי-טרנספקציה.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שיטת</td>
			<td>מורכב</td>
			<td>ng סמן פלואורסצנטי</td>
			<td>ng L7ae (שבר)</td>
			<td>ng כתב (שבר)</td>
			<td>ng מילוי DNA (שבר)</td>
			<td>סה"כ (ng)</td>
		</tr><tr><td>פולי-טרנספקציה 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>1</td>
			<td>150</td>
			<td>75 (½)</td>
			<td></td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>2</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>פולי-טרנספקציה 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>1</td>
			<td>150</td>
			<td>25 (1/6)</td>
			<td></td>
			<td>125 (5/6)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>2</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
			<td>125 (5/6)</td>
			<td>25(1/6)</td>
			<td>300</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: כמויות דנ"א עבור פולי-טרנספקציה שהודגמו בפרוטוקול, וניסוי מעקב לדוגמה עם יחסי פלסמיד מכווננים. החצי העליון של הטבלה מראה את הרכב הפלסמידים המשמשים בניסוי פולי-טרנספקציה פשוט. המחצית התחתונה מציגה את הרכבו של ניסוי מעודכן המתאים את יחסי הפלסמיד לתת-דגימה טובה יותר של מרחב ריכוז היפותטי, שבו אפנן ביטוי הגנים נמצא ביחס אופטימלי יותר של 1:5 ביחס למדווח שלו, מה שמניב יותר תאים נגועים לדגום סביב יחס זה.

<ol><li>Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+circuits+and+cellular+decision-making+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).</li>
<li>Sayeg, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+designed+microRNA-based+genetic+classifiers+target+specific+neurons+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).</li>
<li>Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Input+RNAi-based+logic+circuit+for+identification+of+specific+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells.</a> Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).</li>
<li>Nissim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+RNA-based+immunomodulatory+gene+circuits+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy.</a> Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).</li>
<li>Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+dual-promoter+integrator+for+targeting+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells.</a> Molecular Systems Biology. 6, 444(2010).</li>
<li>Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+regulatory+effect+size+of+cis-acting+genetic+variation+using+allelic+fold+change%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change.</a> Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).</li>
<li>Prochazka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete-to-analog+signal+pluripotent+stem+cells+conversion+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
<li>Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modularity%2C+context-dependence%2C+and+insulation+in+engineered+biological+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits.</a> Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).</li>
<li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design%3A+Engineering+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li>
<li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%27poly-transfection%27+method+for+rapid%2C+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106(2019).</li>
<li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+and+tunable+signal+processing+in+mammalian+cells+via+engineered+covalent+modification+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles.</a> Nature Communications. 13 (1), 1720(2022).</li>
<li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690(2020).</li>
<li>DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERSIST+platform+provides+programmable+RNA+regulation+using+CRISPR+endoRNases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases.</a> Nature Communications. 13 (1), 2582(2022).</li>
<li>Frei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+mitigation+of+gene+expression+burden+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 4641(2020).</li>
<li>Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+fast%2C+high-precision+characterization+of+synthetic+biology+devices.+Computer+Science+and+Artificial+Intelligence+Laboratory+Technical+Report%5BTitle%5D)+AND+%22Massachusetts+institute+of+technology%22%5BJournal%5D)">A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report.</a> Massachusetts institute of technology. , Cambridge. MIT-CSAIL-TR-2012-008 (2012).</li>
<li>Beal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+measurement+precision+requirements+for+effective+engineering+of+genetic+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).</li>
<li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoflow%3A+A+Python+toolbox+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+gene+expression+with+synthetic+upstream+open+reading+frames%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).</li>
<li>Michaels, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+tuning+of+gene+expression+levels+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 818(2019).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li>
<li>Wroblewska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+synthetic+circuits+with+RNA+binding+proteins+for+RNA-only+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).</li>
<li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).</li>
<li>Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-21+as+a+key+regulator+of+oncogenic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">miR-21 as a key regulator of oncogenic processes.</a> Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).</li>
<li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+mining+of+prokaryotic+repressors+for+orthogonal+logic+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).</li>
<li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+transfer+of+prokaryotic+sensors+and+circuits+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).</li>
</ol>

ר.ו. הוא מייסד שותף של Strand Therapeutics ו-Replay Bio; ר.ו. ור.ג. הגישו פטנט זמני הקשור למסווג סוג תא.

שיטות אב טיפוס מהירות כגון תכנון בעזרת מחשב (CAD), breadboarding והדפסה תלת-ממדית חוללו מהפכה בתחומי המכניקה, החשמל וההנדסה האזרחית. היכולת לחפש במהירות פתרונות אפשריים רבים לאתגר נתון מאיצה מאוד את ההתקדמות בתחום. אנו מאמינים כי פולי-טרנספקציה היא טכנולוגיה מקבילה להנדסה ביולוגית, המאפשרת אב טיפוס מהיר של מעגלים גנטיים. בנוסף, טכנולוגיות אב טיפוס מהירות אחרות דורשות איטרציה רציפה מעשית של פתרונות אפשריים מרובים, בעוד שפולי-טרנספקציה מסוגלת לחקור פתרונות רבים בו זמנית. פולי-טרנספקציה מאפשרת לבדוק מספר רב של שילובים של יח...

תחום הביולוגיה הסינתטית של יונקים התקדם במהירות, מפיתוח חלקים פשוטים של חישה ותגובה בקווי תאים בתרבית ועד אופטימיזציה של רשתות גנים מורכבות כדי להתמודד עם אתגרים בעולם האמיתי באבחון ובטיפול1. מעגלים מתוחכמים אלה מסוגלים לחוש קלט ביולוגי מפרופילי מיקרו-רנ"א, דרך ציטוקינים ועד תרופות של מולקולות קטנות, וליישם מעגלי עיבוד לוגיים הכוללים טרנזיסטורים, מסנני פסים, מתגי החלפה ומתנדים. הם גם הראו תוצאות מבטיחות במודלים של בעלי חיים של מחלות כמו סרטן, דלקת פרקים, סוכרת, ועודרבים 1,2,3,4,5. עם זאת, ככל שהמורכבות של מעגל גדלה, אופטימיזציה של הרמות של כל אחד ממרכיביו הופכת מאתגרת יותר ויותר.
סוג אחד שימושי במיוחד של מעגל גנטי הוא מסווג תאים, אשר ניתן לתכנת לחוש ולהגיב למצבים תאיים. ייצור סלקטיבי של תפוקות חלבון או RNA במצבים תאיים ספציפיים הוא כלי רב עוצמה להנחיה ותכנות התמיינות של תאים ואורגנואידים, לזהות ולהשמיד תאים חולים ו / או סוגי תאים לא רצויים, ולווסת את תפקודם של תאים טיפוליים 1,2,3,4,5 . עם זאת, יצירת מעגלים בתאי יונקים שיכולים לסווג במדויק מצבי תאים ממספר מיני רנ"א תאיים ו/או חלבונים הייתה מאתגרת ביותר.
אחד השלבים הגוזלים זמן רב ביותר בפיתוח מעגל סיווג תאים הוא לייעל את רמות הביטוי היחסי של גנים המרכיבים רכיבים בודדים, כגון חיישנים וגורמי עיבוד, בתוך המעגל. כדי להאיץ את אופטימיזציה של מעגלים ולאפשר בנייה של מעגלים מתוחכמים יותר, עבודה אחרונה השתמשה במידול מתמטי של מעגלים מסווגי תאים ומרכיביהם כדי לחזות הרכבים וטופולוגיות אופטימליים 6,7. בעוד שזה הראה תוצאות חזקות עד כה, ניתוח מתמטי מוגבל על ידי הצורך לאפיין באופן שיטתי את התנהגות הקלט-פלט של גנים המרכיבים במעגל, אשר גוזל זמן. יתר על כן, מספר עצום של בעיות תלויות הקשר יכולות להופיע במעגלים גנטיים מורכבים, ולגרום להתנהגות של מעגל מלא להתריס נגד תחזיות המבוססות על אפיונים של חלקים בודדים 8,9.
כדי לפתח ולבדוק במהירות רבה יותר מעגלים מורכבים של יונקים כגון מסווגי מצב תאים, המעבדה שלנו פיתחה טכניקה הנקראת poly-transfection10, אבולוציה של פרוטוקולי טרנספקציה משותפת של פלסמיד. בטרנספקציה משותפת, מיני דנ"א פלסמידים מרובים מורכבים יחד עם מגיב שומנים או פולימר טעון חיובית, ואז מועברים לתאים באופן מתואם (איור 1A). בפולי-טרנספקציה, פלסמידים מורכבים בנפרד עם המגיב, כך שהדנ"א מכל קומפלקס טרנספקציה מועבר לתאים באופן דה-קורלציה (איור 1B). באמצעות שיטה זו, תאים בתוך האוכלוסייה הנגועה נחשפים לשילובים רבים של יחסים של שני מטעני דנ"א או יותר הנושאים רכיבי מעגל שונים.
כדי למדוד את היחסים בין רכיבי המעגלים המועברים לכל תא, כל קומפלקס טרנספקציה בתוך פולי-טרנספקציה מכיל כתב פלואורסצנטי מבוטא באופן קונסטיטוטיבי המשמש כפרוקסי לקליטה תאית של המכלול. דנ"א מילוי שאינו מכיל יסודות הפעילים בתוך תא יונק משמש לכוונון הכמות היחסית של רכיבי הכתב הפלואורסצנטי והמעגלים המועברים לתא בקומפלקס טרנספקציה יחיד ונדון ביתר פירוט בדיון. דוגמה לדנ"א מילוי המשמש במעבדת וייס הוא פלסמיד המכיל רצף טרמינטור, אך ללא פרומוטור, רצף קידוד וכו'. לאחר מכן ניתן להשוות תאים עם יחסים שונים של רכיבי מעגל כדי למצוא יחסים אופטימליים לתפקוד מעגל הגנים. זה בתורו מניב תחזיות שימושיות לבחירת מקדמים ורכיבי מעגל אחרים כדי להשיג רמות ביטוי גנים אופטימליות בעת שילוב רכיבי מעגל לווקטור יחיד לאינטגרציה גנטית (למשל, לנטיוירוס, טרנספוזון או משטח נחיתה). לכן, במקום לבחור יחסים בין רכיבי מעגל בהתבסס על אינטואיציה או באמצעות תהליך ניסוי וטעייה הגוזל זמן, פולי-טרנספקציה מעריכה מגוון רחב של סטויכיומטריה בין חלקים גנטיים בתגובה חד-סירית.
במעבדה שלנו, פולי-טרנספקציה אפשרה אופטימיזציה של מעגלים גנטיים רבים, כולל מסווגי תאים, בקרי משוב והזנה, ומוטיבים דו-יציבים. שיטה פשוטה אך רבת עוצמה זו מאיצה באופן משמעותי את מחזורי התכנון של מעגלים גנטיים מורכבים בתאי יונקים. פולי-טרנספקציה שימשה מאז לאפיון מספר מעגלים גנטיים כדי לחשוף את פונקציות העברת הקלט-פלט הרב-ממדיות שלהם ברזולוציה גבוהה 10, לייעל טופולוגיית מעגל חלופית עבור סיווג מצב התא11, ולהאיץ פרויקטים שונים שפורסמו12,13 ומתמשכים.
כאן אנו מתארים ומתארים את זרימת העבודה לשימוש בפולי-טרנספקציה כדי למטב במהירות מעגל גנטי (איור 2). הפרוטוקול מראה כיצד להפיק נתוני פולי-טרנספקציה באיכות גבוהה ולהימנע ממספר שגיאות נפוצות בפרוטוקול הפולי-טרנספקציה ובניתוח הנתונים (איור 3). לאחר מכן הוא מדגים כיצד להשתמש בפולי-טרנספקציה כדי לאפיין רכיבי מעגלים פשוטים, ותוך כדי כך, למדוד תוצאות פולי-טרנספקציה כנגד קו-טרנספקציה (איור 4). לבסוף, התוצאות של פולי-טרנספקציה מראות אופטימיזציה של מעגל מסווג הסרטן (איור 5).

<table><tbody><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים של קורנינג פלקון</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 24 בארות</td><td>כל חברה לבחירה</td><td></td> <td>(לא פירוגני, סטרילי, RNase, DNase, DNA וללא פירוגן)</td></tr> <tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>כל חברה לבחירה</td><td></td><td>מסוגלת לחשוף צינורות פלקון 15 מ"ל ל -300 rcf</td></tr><tr><td>Countess 3 מונה תאים אוטומטי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות תא ספירת תאים של רוזנת</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Cytoflow</td><td>חבילת</td><td></td> תוכנה לא מסחרית <td>https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>השתמש במדיה הנכונה עבור סוג התא שלך</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>תאי HEK</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>השתמש בסוג התא הרלוונטי לניסויים שלך. תאי HEK נוטים לעבור ביעילות רבה.</td></tr><tr><td>תאי HeLa</td><td>ATCC</td><td>CRL-12401</td><td>השתמש בסוג התא הרלוונטי לניסויים שלך.</td></tr><tr><td>משפר Lipofectamine 3000 ו- P3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000001</td><td>השתמש במגיב הנכון לסוג התא שלך; מגיב טרנספקציה ומשפר</td></tr><tr><td>LSRFציטומטר זרימה</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה, 1.5 מ"ל</td><td>כל חברה לבחירה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>סרום מופחת בינוני</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי כיול קשת</td><td>Spherotech</td><td>URCP-100-2H</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>VWR</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח מהיר של מעגלי זיהוי מצב התא עם poly-transfection

Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection

מעגלים גנטיים של יונקים הוכיחו את הפוטנציאל לחוש ולטפל במגוון רחב של מצבי מחלה, אך אופטימיזציה של רמות רכיבי המעגלים נותרה מאתגרת ודורשת עבודה. כדי להאיץ את התהליך הזה, המעבדה שלנו פיתחה פולי-טרנספקציה, הרחבה בעלת תפוקה גבוהה של טרנספקציה מסורתית של יונקים. בפולי-טרנספקציה, כל תא באוכלוסייה הנגועה מבצע למעשה ניסוי שונה, בודק את התנהגות המעגל במספרי העתקי דנ"א שונים ומאפשר למשתמשים לנתח מספר רב של סטויכיומטריה בתגובה חד-סירית. עד כה הודגמו פולי-טרנספקציות הממטבות את היחסים של מעגלים תלת-רכיביים בבאר תאים אחת; באופן עקרוני, אותה שיטה יכולה לשמש לפיתוח מעגלים גדולים עוד יותר. ניתן ליישם בקלות תוצאות פולי-טרנספקציה כדי למצוא יחסים אופטימליים בין דנ"א לטרנספקט משותף עבור מעגלים חולפים או כדי לבחור רמות ביטוי עבור רכיבי מעגלים ליצירת קווי תאים יציבים.
כאן, אנו מדגימים את השימוש בפולי-טרנספקציה כדי לייעל מעגל בן שלושה רכיבים. הפרוטוקול מתחיל בעקרונות תכנון ניסיוני ומסביר כיצד פולי-טרנספקציה מתבססת על שיטות מסורתיות של קו-טרנספקציה. לאחר מכן, poly-transfection של תאים מתבצעת ואחריו cytometry זרימה כמה ימים מאוחר יותר. לבסוף, הנתונים מנותחים על ידי בחינת פרוסות של נתוני ציטומטריית זרימה של תא בודד המתאימים לתת-קבוצות של תאים עם יחסי רכיבים מסוימים. במעבדה, פולי-טרנספקציה שימשה לאופטימיזציה של מסווגי תאים, בקרי משוב והזנה, מוטיבים דו-יציבים ורבים אחרים. שיטה פשוטה אך רבת עוצמה זו מאיצה את מחזורי התכנון של מעגלים גנטיים מורכבים בתאי יונקים.

באיור 1 אנו משווים קו-טרנספקציה לפולי-טרנספקציה. בטרנספקציה משותפת, כל הפלסמידים מועברים באותה תערובת טרנספקציה, והתוצאה היא מתאם גבוה בין כמות כל פלסמיד שכל תא בודד מקבל (איור 1A). בעוד שמספר הפלסמידים הכולל המועבר לכל תא משתנה באופן משמעותי, הפלואורסצנטיות של שני חלבוני הדיווח בתאים בודדים באוכלוסייה מתואמת היטב, מה שמצביע על כך ששני הפלסמידים מועברים יחד ביחס קבוע למדי. תאים נגועים עשויים לספוג קומפלקסים מעטים או רבים, אך מכיוון שלכל קומפלקס יש כמויות מתואמות...

מעגלים גנטיים מורכבים גוזלים זמן רב כדי לתכנן, לבדוק ולמטב. כדי להקל על תהליך זה, תאי יונקים נדבקים באופן המאפשר בדיקה של סטויכיומטריה מרובים של רכיבי מעגל בבאר אחת. פרוטוקול זה מתאר את השלבים לתכנון ניסויים, טרנספקציה וניתוח נתונים.

פיתוח מהיר של מעגלי זיהוי מצב התא עם Poly-Transfection

Mammalian genetic circuits have demonstrated the potential to sense and treat a wide range of disease states, but optimization of the levels of circuit ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר להבין בקלות ובמהירות את היחסים בין חלקים ביולוגיים. אנו יכולים לבחון את ההתנהגות של שילובים מטריים רבים של חלקים בבאר אחת. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לאפיין את היחסים המורכבים בין רכיבי המעגל באופן מקיף יותר עם יעילות ניסויית גבוהה יותר מאשר גישות קונבנציונליות.שיטה זו ישימה לביולוגיה סינתטית ולכל שאלה ביולוגית, חקירת שינויים התנהגותיים בתא בתגובה לרמות שונות של גנים נגועים שבהם ניתן למדוד את התפוקה באמצעות ציטומטריית זרימה. התחל להכין צינורות עבור כל צבר DNA על ידי הקצאת צינורות מיקרו צנטריפוגות 1.5 מיליליטר המסומנים ללא בקרת צבע, בקרת mKO2, בקרת TagBFP, בקרת ירוק ניאון, כל בקרת צבע, תערובת פולי-טרנספקציה אחת ומיקס פולי-טרנספקציה שתיים. הוסף 36 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לבקרת ללא צבע, בקרת mKO2, בקרת TagBFP, בקרת ירוק ניאון וכל צינורות בקרת הצבע, ולאחר מכן הוסף 18 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לכל פולי-טרנספקציה מערבב אחד ופולי-טרנספקציה מערבבים שני צינורות.לאחר מכן, הוסף 600 ננוגרם של פלסמיד מילוי לצינור הבקרה ללא צבע, 300 ננוגרם של mKO2 ו -300 ננוגרם של פלסמיד מילוי לצינור בקרת הצבע mKO2 והוסף 300 ננוגרם של TagBFP ו -300 ננוגרם של פלסמיד מילוי לצינור בקרת הצבע TagBFP. לצינור בקרת הצבע הירוק ניאון, הוסף 300 ננוגרם של ירוק ניאון מכונן ו- 300 ננוגרם של פלסמיד מילוי, ולאחר מכן הוסף 100 ננוגרם של כל mKO2, TagBFP, ירוק ניאון מכונן ו- 300 ננוגרם של פלסמיד מילוי לצינור הבקרה של כל הצבעים. לתערובת פולי-טרנספקציה צינור אחד, הוסף 150 ננוגרם של mKO2, 75 ננוגרם של פלסמיד ירוק ניאון כתב ו 75 ננוגרם של פלסמיד מילוי.לתערובת הפולי-טרנספקציה יש להוסיף 150 ננוגרם של TagBFP, 75 ננוגרם של פלסמיד L7Ae ו-75 ננוגרם של פלסמיד מילוי. לאחר שתסיים, צור את תערובת האב של טרנספקציה בצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר על ידי שילוב של 216 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת עם 9.48 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה. מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה לפני שמניחים אותו בצד.הוסף 1.58 מיקרוליטר של מגיב משפר ללא בקרת צבע, בקרת צבע יחידה וכל צינורות בקרת הצבע והוסף 79 מיקרוליטר של מגיב משפר לכל צינורות תערובת פולי-טרנספקציה. מערבבים כל צינור בנפרד על ידי פיפטינג נמרץ. הוסף 37.58 מיקרוליטר של תערובת מאסטר transfection לבקרת ללא צבע, בקרת צבע יחידה וכל צינורות בקרת הצבע וערבב על ידי pipeting נמרצות.לאחר מכן, להוסיף 18.79 מיקרוליטר של תערובת מאסטר transfection לכל צינורות תערובת transfection פולי ולערבב כל צינור היטב עם pipetting נמרץ. מוציאים את תערובות הטרנספקציה לתוך הבארות על ידי פיפטינג 65.97 מיקרוליטר של כל תערובת טרנספקציה עבור ללא צבע, צבע יחיד וכל פקדי הצבע לתוך הבארות המתאימות, ולאחר מכן להעביר 32.98 מיקרוליטר של תערובת פולי-טרנספקציה אחד לתוך באר poly-transfection ולהפיץ את הקומפלקסים ביעילות על ידי ערבול הצלחת במהירות אך בעדינות הדוק, פיגור תבנית לאורך משטח שטוח, ואז פיפטה 32.98 מיקרוליטר של פולי-טרנספקציה מערבבים שניים לאותה באר פולי-טרנספקציה ומערבלים את הצלחת באותה צורה. לדגור על תאים במשך יומיים.בצע ציטומטריית זרימה כדי לקרוא את הפלואורסצנטיות של סמני הטרנספקציה ומדווח הפלט עבור כל תא. טרנספקציה משותפת המבוצעת היטב, שונה מהפולי-טרנספקציה המוצגת בסרטון, מראה מתאם הדוק בין TagBFP ו- EYFP, המבטא פלסמידים שנמסרו במשותף. לעומת זאת, קו-טרנספקציה שבוצעה בצורה גרועה מראה מתאם גרוע בין שני הפלסמידים.פולי-טרנספקציה שבוצעה היטב הראתה כיסוי טוב של המרחב הדו-ממדי ופיצוי טוב של כל דימום ספקטרלי בין חלבונים פלואורסצנטיים. קשה היה לחלק נתוני פולי-טרנספקציה עם מספר נמוך של תאים חיים למספיק פחים עם מספר מספיק של תאים בכל סל לניתוח. פולי-טרנספקציה עם יעילות טרנספקציה ירודה הביאה לכיסוי דליל של המרחב הדו-ממדי לניתוח.יחס הדנ"א האפקטיבי על ביטוי הפלט נבדק על ידי הצבת חלבון מדכא, L7Ae עם mKO2, וחלבון פלט, ירוק ניאון עם TagBFP, בתערובות טרנספקציה נפרדות. לאחר מכן נוטר ביטוי ירוק ניאון ברמות שונות של mKO2 ו- TagBFP. תוצאות קו-טרנספקציה ופולי-טרנספקציה הושוו עבור מעגל זה.תוצאות של 11 טרנספקציות משותפות בודדות ששילבו את חלקי הדנ"א שהוצגו קודם לכן נאספו למערך נתונים יחיד והושוו לנתוני הפולי-טרנספקציה. השוואה בין עקומות תגובת המינון של L7Ae המדכא את מדווח הפלט הראתה כי רמת התפוקה החציונית לסל הייתה דומה מאוד בין נתוני הטרנספקציה המשותפת ונתוני הפולי-טרנספקציה. יישום מוצלח של poly-transfection הודגם עבור אופטימיזציה של מסווג סוג התא.המיקרו-רנ"א-21 הקיים בתאי HeLa ובתאים שאינם HEK פועל להפיל את הביטוי של BM3R1 מכיוון ש-BM3R1 מדכא את ייצור פלט המעגל mKO2. כאשר מיקרו-רנ"א 21 נמצא בתא, ביטוי mKO2 יופעל. כמות Gal4-VP16 מכווננת את ביטוי mKO2 ברמות נמוכות של BM3R1.כל רכיב מעגל הועבר במשותף עם סמן פלואורסצנטי שונה. פולי-טרנספקציה זו מכמתת כמה מכל רכיב מעגל קיבל כל תא. mKO2 מיוצר ב-MIR21, ומייצר תאי HeLa אך לא בתאי HEK.פלט mKO2 נותח לאחר העברת רכיבי מעגל אלה בתערובות טרנספקציה נפרדות עם כתבים פלואורסצנטיים נפרדים כדי לציין את הכמות של כל רכיב מעגל המתקבל על ידי תא מסוים. תת-דגימה זו חזתה כי ביחס זה, למעגל המשותף הייתה ספציפיות של 91%, רגישות של 62% ודיוק של 77%, בעת סיווג תאי HEK293 לעומת תאי HeLa. נקודת הכאב הנפוצה ביותר בפרוטוקול זה היא היעדר מתאם הדוק בתוך כל תערובת טרנספקציה.לכן זכרו לערבב במרץ את צינורות הטרנספקציה מיד לאחר הוספת מגיב ההמרפר, ולאחר מכן היו עדינים עם ערבוב ופיפטציה של צינורות הטרנספקציה לאחר הוספת תערובת הטרנספקציה המכילה את השומנים. ניתן להחליף את המרכיבים הגנטיים בהליך זה בכל מרכיב גנטי אחר כדי לענות על שאלות לגבי תפקודם בסביבות שונות. שיטה זו פיתחה במהירות מעגלים גנטיים, כגון מסווגי תאים, בקרי משוב והזנה, מוטיבים דו-יציבים ועוד רבים.

rapid-development-cell-state-identification-circuits-with-poly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מדגימים כיצד ללמוד את ההשפעה של מוטציה נקודה אחת על התפקוד של ערוץ יון.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

תפוקה גבוהה, פלטפורמה אוטומטית של פיתוח וייצור קו התא לייצור חלבונים ותרופות מתואר. יישום סדרן BD Cell Aria FACS, CloneSelect Imager וטקאן חופש מערכת EVO טיפול הנוזל הוכיחה יכולת עיבוד גדל באופן משמעותי בפיתוח קו התא עם איכות הקו השתפרה התא reproducibility גבוהה.

פלטפורמה תפוקה גבוהה אוטומטיות לפיתוח קווי ייצור עבור Cell Therapeutics חלבון

אנו מתארים שיטת הדמיה לחיות תאים המספקת תובנה דינמיקת חלבון במהלך תהליך תא T ההפעלה. אנו מדגימים את השימוש בשילוב של הפצת assay תא T, מיקרוסקופיה confocal וניתוח הדמיה להניב תוצאות כמותיות לעקוב איתות היווצרות מורכבת לאורך כל הפעלת תא T.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

מאז גילוי גן החלבון הפלואורסצנטי הירוק, חלבונים פלואורסצנטיים השפיעו על הביולוגיה המולקולרית של התא. פרוטוקול זה מתאר כיצד ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים מובחנים באמצעות הנדסה גנטית משמש לברקוד תאים בודדים. ההליך מאפשר מעקב אחר אוכלוסיות שונות בתערובת תאים, שהיא אידיאלית עבור יישומים מרובים.

Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed

תעלות יוני לימוד באמצעות מערכת להביע heterologously הפכו טכניקת ליבה במחקר ביו. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה יעילה זמן כדי להשיג ביטוי ערוץ יון תחת פיקוח הדוק על ידי ביצוע transfection חולף בשליטת האמרגן מושרה.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה optogenetic כדי לווסת מיטוגן המופעל חלבון קינאז (MAPK) פעילות במהלך התמיינות תאים והתפתחות עובריים Xenopus . שיטה זו מאפשרת הפעלה הפיכה של המסלול איתות MAPK בתרבית תאים יונקים ועל אורגניזמים חיים תאיים, כמו עוברי Xenopus , עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em&gt; קסנופוס</em&gt; התפתחות עובריים

אנו מתארים את ההנדסה של פולימראז T7 RNA חדשני הקשור לדנ"א כדי לווסת את תגובות התמלול במבחנה. אנו דנים בצעדים לסינתזה ואפיון חלבונים, מאמתים רגולציה של תמלול הוכחת הרעיון, ודנים ביישומיה במחשוב מולקולרי, אבחון ועיבוד מידע מולקולרי.

RNA פולימראז קשור DNA לתכנות תמלול במבחנה וחישוב מולקולרי

שליטה אמינה בתאי יונקים מגיבים לאור דורשת סטנדרטיזציה של שיטות אופטוגנטיות. לקראת מטרה זו, מחקר זה מתאר צינור של בניית מעגלי גנים, הנדסת תאים, פעולת ציוד אופטוגנטי, ובדיקות אימות כדי לתקנן את המחקר של ביטוי גנים המושרה באור באמצעות מעגל גנים אופטוגנטי משוב שלילי כמקרה מבחן.

הנדסה אמינה ושליטה במעגלי גנים אופטוגנטיים יציבים בתאי יונקים

חלקים גנטיים מאופיינים היטב נחוצים לתכנון מעגלים גנטיים חדשים. כאן אנו מתארים שיטה חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לאפיון מהיר של חלקים גנטיים. השיטה שלנו מפחיתה עלויות וזמן על ידי שילוב ליזטים נטולי תאים, DNA ליניארי למניעת שיבוט וטיפול בנוזלים אקוסטיים כדי להגדיל את התפוקה ולהפחית את נפחי התגובה.

אפיון מהיר של חלקים גנטיים עם מערכות נטולות תאים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לפולי-טרנספקציה הפוכה של תאי גזע עובריים של עכברים במהלך תרבית עם מדיה 2i ו-LIF. שיטה זו מניבה כדאיות ויעילות גבוהות יותר מאשר פרוטוקולי העברה קדימה מסורתיים, תוך שהיא מאפשרת גם אופטימיזציה של יחסי פלסמיד בסיר אחד.

טכניקת פולי-טרנספקציה הפוכה אופטימלית מבוססת תאי גזע עובריים של עכבר לחקירה מהירה של יחסי חומצות גרעין

למד לפתח מעגלי זיהוי מצב תאים במהירות באמצעות Poly-Transfection. שיטה זו מאפשרת בדיקה יעילה של רכיבים גנטיים מרובים בבאר אחת, תוך שימוש בציטומטריית זרימה למדידת הפלט.

פיתוח מהיר של מעגלי זיהוי מצב התא עם Poly-Transfection

גלה סרטונים נוספים