Name: סינתזה של הידרוגלים מטריצה חוץ-תאית סחוס דה-תאי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: למד שיטה לסינתזת הידרוג'לים ממטריצה חוץ-תאית סחוס דה-תאי (DC-ECM) המשמרים מבנה ביולוגי ומציגים אימונוגניות נמוכה. הטכניקה משלבת טיפול תרמי, עיכול אנזימטי וצלבית UV ליצירת פתרונות רפואיים מתקדמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי תוכנית הרפואה וטכנולוגיית הבריאות של מחוז ג'ג'יאנג (2019KY050), תוכנית המדע והטכנולוגיה של הרפואה הסינית המסורתית של מחוז ג'ג'יאנג (2019ZA026), תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית במחוז ג'ג'יאנג (מענק מס '2020C03043), תוכנית המדע והטכנולוגיה של הרפואה הסינית המסורתית של מחוז ג'ג'יאנג (2021ZQ021), והקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג של סין (LQ22H060007).

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים טונגדה במחוז ג'ג'יאנג.
1. הכנת הידרוג'ל DC-ECM
הערה: במחקר זה, הסחוס התקבל מפרקי הברכיים של חזירי באמה מיניאטוריים בני 12 חודשים, תוך הימנעות מאיסוף רקמת עצם.
<ol><li>קח את הסחוס שנאסף, לחסום ולקצוץ אותו לתוך 1-2 מ"מ3 חתיכות עם אזמל.</li>
	<li>מניחים 20 גרם של הסחוס הטחון בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, ומוסיפים 20 מ"ל של חיץ Tris-HCl היפוטוני (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) כדי לטבול את הרקמה לחלוטין. מכניסים את צינור הצנטריפוגה למקפיא של -80°C למשך 3 שעות ולאחר מכן לתנור של 37°C למשך 3 שעות. חזרו על שלב ההקפאה והחימום שש פעמים. בשלב זה, מאגר Tris-HCl היפוטוני אינו זקוק להחלפה.</li>
	<li>נערו את צינור הצנטריפוגה למשך 30 שניות באמצעות מערבל מערבולות במהירות של 1,000 סל"ד. הניחו מסננת נירוסטה (גודל נקבוביות: ~ 250 מיקרומטר) על צינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל.</li>
	<li>מרוקנים באיטיות את הסחוס נטול התאים לתוך מסננת הנירוסטה, שוטפים את הרקמה שלוש פעמים עם PBS סטרילי, ואוספים את הסחוס.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של תמיסת טריפסין (0.25% טריפסין ב- PBS), והנח את הצינור על שייקר ב 37 ° C למשך 24 שעות. במהלך תקופה זו, להחליף את טריפסין כל 4 שעות. מסננים את המתלה באמצעות מסננת הנירוסטה, ושומרים על הרקמה. טריפסין ניתן לטפל בן לילה במהלך אחד מתהליכי העיכול, וזה לא ישפיע על העיכול הסופי.</li>
	<li>לשטוף את הרקמה טריפסינית עם חיץ hypertonic (1.5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6).</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של תמיסת נוקלאז (50 U/mL deoxyribonuclease ו-1 U/mL ribonuclease ב-10 mM Tris-HCl, pH 7.5), והנח את הצינור על שייקר ב-37°C למשך 4 שעות.</li>
	<li>הסר את תמיסת הנוקלאז, שטוף את הסחוס שלוש פעמים עם PBS סטרילי, והוסף תמיסת Tris-HCl היפוטונית. הניחו את צינור הצנטריפוגה על שייקר, ושטפו במשך 20 שעות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>הסר את תמיסת Tris-HCl ההיפוטונית, שטוף את הסחוס שלוש פעמים עם PBS סטרילי, והוסף תמיסת טריטון X-100 1% כדי לטבול את הרקמה למשך 24 שעות.</li>
	<li>הסר את תמיסת Triton X-100, ושטוף ביסודיות את הסחוס decellularized עם מים מזוקקים במשך 3 ימים, החלפת המים המזוקקים כל 12 שעות.</li>
	<li>השרו את הסחוס בתמיסת חומצה פראצטית (0.1% PAA ב-4% אתנול) למשך 4 שעות. מוציאים את תמיסת החומצה הפרצטית ושוטפים את הסחוס שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים.</li>
	<li>הניחו את מסננת הנירוסטה (גודל נקבוביות: ~ 250 מיקרומטר) על צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. מרוקנים לאט לאט את הסחוס הדה-צלולרי לתוך מסננת הנירוסטה, ואוספים את הסחוס. בדוק את מידת הדה-צלולריזציה ואת שימור המטריצה של הסחוס על ידי הערכת תכולת ה- DNA, הקולגן והגליקוזאמינוגליקן (GAG).</li>
	<li>הכניסו את הסחוס נטול התאים לקערת שחיקה, הוסיפו חנקן נוזלי וטחנו את הסחוס נטול התאים ליצירת אבקה. קח 2 גרם של אבקת סחוס decellularized, להוסיף 80 מ"ל של 0.5 M חומצה אצטית ו 20 מ"ג של pepsin, ולעכל במשך 24 שעות. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות; השליכו את המשקעים, ואספו את תמיסת הסופרנאטנט (תמיסת DC-ECM).</li>
	<li>דקנט 1 מ"ל של פתרון DC-ECM לכל באר לתוך לוחות 6 באר. מניחים את צלחות 6 באר בליופיליזר. הקפיא את פתרון DC-ECM. ברגע שהטמפרטורה במייבש ההקפאה יורדת ל -40 מעלות צלזיוס, הפעל את משאבת הוואקום, ושמור על מידת הוואקום ב -10 Pa למשך 22 שעות.</li>
	<li>הוציאו את תמיסת DC-ECM המיובשת בהקפאה, הניחו אותה בצינורות צנטריפוגות ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. תקופת האחסון המינימלית של פתרון DC-ECM מיובש בהקפאה עולה על חצי שנה.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים כדי להמיס 20 מ"ג של תמיסת DC-ECM מיובשת בהקפאה בצינור הצנטריפוגה. נערו במשך דקה אחת באמצעות מערבול מערבולת במהירות של 1,000 סל"ד ב-RT. הוסיפו 1 מ"ג ויטמין B2 (0.1% w/v) לתמיסת DC-ECM, דגרו ב-37°C למשך 60 דקות, והקרינו באור UV (370 ננומטר, 3.5 mW/cm2) למשך 3 דקות ליצירת הידרוג'ל (DC-ECM hydrogel).</li>
</ol>2. איתור סחוס דה-צלולרי
<ol><li>זיהוי תכולת DNA של סחוס דה-סלולרי הערה: חלץ את הדנ"א באמצעות ערכת הדם והרקמות של DNEasy.<ol><li>ראשית, יש ליטול 20 מ"ג סחוס DC-ECM בצינור צנטריפוגה. הוסף 180 μL של Buffer GTL ו 20 μL של Proteinase K על ידי תנודת מערבולת, ודגר על הסחוס ב 56 ° C במשך 4 שעות עד שהוא מומס לחלוטין.</li>
		<li>נערו את צינור הצנטריפוגה למשך 15 שניות באמצעות מערבל מערבולות במהירות של 1,000 סל"ד ב-RT. לאחר מכן, להוסיף 200 μL של Buffer GL ואתנול נטול מים, ולערבב היטב על ידי רטט מערבולת. צנטריפוגה את הדגימות במשך דקה אחת במהירות של 6,000 x גרם ב 4 ° C.</li>
		<li>הוסף 500 μL של Buffer GW1 לעמודת הספיחה, וצנטריפוגה את הדגימות למשך דקה אחת במהירות של 12,000 x גרם ב 4 ° C. הוסף 500 μL של Buffer GW2 לעמודת הספיחה, וצנטריפוגה ב- 20,000 x g ב- 4 ° C למשך דקה אחת. לבסוף, הוסף 50 μL של מים מעוקרים לעמודת הספיחה, וצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 6,000 x גרם ב 4 ° C כדי לאסוף את תמיסת ה- DNA. קבע את תכולת ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהוי תכולת קולגן בסחוס נטול תאים<ol><li>כדי לזהות את תכולת הקולגן בסחוס נטול תאים, השתמשו בהידרוקסיפרולין כסמן חומצת אמינו של קולגן. להחמיץ, 5 מ"ג של סחוס decellularized עם 5 מ"ל של 6 M חומצה הידרוכלורית ב 100 ° C במשך 20 דקות, ולאחר מכן לנטרל אותו עם 5 מ"ל של 6 M תמיסת נתרן הידרוקסיד.</li>
		<li>חשב את התוכן של hydroxyproline על ידי מדידת ספיגת המדגם ב 570 ננומטר עם ספקטרופוטומטר. קבל רגרסיה ליניארית של ספיגת ריכוז באמצעות דגימת הידרוקסיפרולין סטנדרטית.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהוי תוכן GAG בסחוס הדה-תאי הערה: תוכן ה- GAG בסחוס DC-ECM זוהה באמצעות ערכת זיהוי כמותי קולורימטרי של GAG רקמות. כל הריאגנטים להלן זמינים בערכה.<ol><li>קח 200 מ"ג של אבקת סחוס DC-ECM, ולהוסיף 500 μL של מגיב A על ידי תנודת מערבולת. לדגור את הדגימה ב 4 ° C במשך 16 שעות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות.</li>
		<li>קח 50 מ"ל של תמיסת דגימה, והוסף 50 μL של תמיסת מלח גבוהה (מגיב B) ו 50 μL של תמיסת חומצה (מגיב C) על ידי תנודת מערבולת. לדגור על הדגימה במשך 10 דקות.</li>
		<li>הוסף 750 μL של תמיסת צבע (מגיב D) על ידי תנודת מערבולת, ודגר על הדגימה במשך 30 דקות בתנאים חשוכים. צנטריפוגה את הדגימה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות, ולאחר מכן להשליך את supernatant.</li>
		<li>מוסיפים 1 μL של תמיסת ניקוי (מגיב E), ומערבבים היטב. צנטריפוגו את הדגימה במהירות של 14,000 x גרם למשך 10 דקות, והשליכו את הסופרנטנט.</li>
		<li>מוסיפים 1 μL של תמיסת דיסוציאציה (מגיב F) לדגימה, ומערבבים היטב. יש לדגור על הדגימה במשך 30 דקות בתנאי חושך. לבסוף, לקבוע את תוכן GAG באמצעות ספקטרופוטומטר ב 600 ננומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) של הסחוס הדה-תאי<ol><li>השווה בין הסחוס הדה-צלולרי לבין רקמת הסחוס הרגילה. יש להניח את הדגימה בתמיסת גלוטראלדהיד 2.5%, לדגור בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה ולאחר מכן לשטוף עם PBS שלוש פעמים.</li>
		<li>תקן את הדגימה ב- 1% OsO4 למשך שעה ולאחר מכן שטוף שלוש פעמים עם PBS.</li>
		<li>יש לייבש את הדגימה על ידי טבילה רציפה באתנול 50%, 70%, 90% ו-100%, כמו גם 100% אצטון למשך 15 דקות כל אחד. הניחו את הדגימה בתמיסה מעורבת של הקסמתילדיסילאזאן ואתנול (1:1) למשך 15 דקות, ולאחר מכן טבלו בהקסמתילדיסילאזאן טהור למשך 15 דקות.</li>
		<li>הניחו את הדגימה במייבש HCP-2, ולאחר מכן יבשו באמצעות חנקן נוזלי. לאחר מכן, צפו את הדגימה המיובשת במלואה בשכבה דקה של פלדיום זהב באמצעות ציפוי מרזב, וצפו באמצעות SEM. ציפוי המרזב בוצע בהספק של 120 W למשך 5 דקות. הניסוי בוצע בתנאים הבאים: מתח עבודה של 15 קילו וולט, ודרגת ואקום נמוכה מ-5 x 10-5 Pa.</li>
		<li>עבור ניתוח TEM, מקם את הדגימה בתערובת של אצטון נטול מים ושרף (1: 1) במשך 1 שעות, ואחריו תערובת של אצטון נטול מים ושרף (1: 3) במשך 3 שעות. לאחר מכן, הניחו את הדגימה בשרף למשך הלילה.<ol><li>מניחים את הדגימה בכמוסות מלאות בינוניות, ומחממים ב-70°C למשך 9 שעות.</li>
			<li>לאחר ההטבעה, חותכים את הדגימה לפרוסות דקות של 70 ננומטר באמצעות מיקרוטום דק במיוחד, ומניחים על רשת נחושת.</li>
			<li>יש למרוח 20 μL של תמיסת צביעת אורניל אצטט על רשת הנחושת, ולהכתים למשך 15 דקות ב-RT. הסירו את תמיסת הכתמים על ידי שטיפה עדינה של הרשת פעמיים במים מזוקקים.</li>
			<li>לאחר מכן, שפכו 20 μL של תמיסת צביעת עופרת ציטראט על רשת הנחושת, והכתימו למשך 15 דקות ב- RT. שטפו את הרשת שלוש פעמים במים מזוקקים.</li>
			<li>הניחו את רשת הנחושת על צלחת פטרי נקייה מרופדת בנייר פילטר. לאחר הייבוש באוויר, צלמו את המקטעים באמצעות TEM. הגשושית הופעלה בכוח יורד של 500 nN, נסרק בקצב של 1 הרץ, והיה לה קבוע אלסטי (ערך k) של 40 Nm-1. רדיוס קצה הגשושית נמדד כ-8 ננומטר.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Vega, S. L., Kwon, M. Y., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+hydrogels+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Recent advances in hydrogels for cartilage tissue engineering.</a> European Cells & Materials. 33, 59-75 (2017).</li>
<li>Yang, J., Zhang, Y. S., Yue, K., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-laden+hydrogels+for+osteochondral+and+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cell-laden hydrogels for osteochondral and cartilage tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 57, 1-25 (2017).</li>
<li>Bejleri, D., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix+materials+for+cardiac+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix materials for cardiac repair and regeneration.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (5), e1801217(2019).</li>
<li>Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix%3A+New+promising+and+challenging+biomaterials+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine.</a> Biomaterials. 289, 121786(2022).</li>
<li>Barbulescu, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix+scaffolds+for+cardiovascular+tissue+engineering%3A+Current+techniques+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix scaffolds for cardiovascular tissue engineering: Current techniques and challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (21), 13040(2022).</li>
<li>Zhang, W., Du, A., Liu, S., Lv, M., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+in+decellularized+extracellular+matrix-derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">Research progress in decellularized extracellular matrix-derived hydrogels.</a> Regenerative Therapy. 18, 88-96 (2021).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+decellularized+extracellular+matrix+scaffolds+for+articular+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Cell-derived decellularized extracellular matrix scaffolds for articular cartilage repair.</a> International Journal of Artificial Organs. 44 (4), 269-281 (2021).</li>
<li>Li, T., Javed, R., Ao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenogeneic+decellularized+extracellular+matrix-based+biomaterials+for+peripheral+nerve+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials for peripheral nerve repair and regeneration.</a> Current Neuropharmacology. 19 (12), 2152-2163 (2021).</li>
<li>Xia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+cartilage+as+a+prospective+scaffold+for+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+%26+Engineering+C-Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">Decellularized cartilage as a prospective scaffold for cartilage repair.</a> Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 101, 588-595 (2019).</li>
<li>Chen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desktop-stereolithography+3D+printing+of+a+radially+oriented+extracellular+matrix%2Fmesenchymal+stem+cell+exosome+bioink+for+osteochondral+defect+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration.</a> Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).</li>
<li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+delivery+in+tissue-specific+hydrogel+enabled+meniscal+repair+in+an+orthotopic+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cell delivery in tissue-specific hydrogel enabled meniscal repair in an orthotopic rat model.</a> Biomaterials. 132, 59-71 (2017).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensified+stiffness+and+photodynamic+provocation+in+a+collagen-based+composite+hydrogel+drive+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Intensified stiffness and photodynamic provocation in a collagen-based composite hydrogel drive chondrogenesis.</a> Advanced Science. 6 (16), 1900099(2019).</li>
<li>Young, J. L., Holle, A. W., Spatz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P.Nanoscale+and+mechanical+properties+of+the+physiological+cell-ECM+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">P.Nanoscale and mechanical properties of the physiological cell-ECM microenvironment.</a> Experimental Cell Research. 343 (1), 3-6 (2016).</li>
<li>Abdolghafoorian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+heart+valve+decellularization+on+xenograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Clinical+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effect of heart valve decellularization on xenograft rejection.</a> Experimental and Clinical Transplantation. 15 (3), 329-336 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מספק גישה שיטתית להכנת הידרוג'לים מטריקס חוץ-תאיים של סחוס דה-צלולרי המחקים באופן הדוק את ה-ECM המקורי של רקמת הסחוס. הפרוטוקול כולל שילוב של הפרעה פיזיקלית, כימית ואנזימטית לסילוק חומר תאי תוך שמירה על המבנה וההרכב של ECM. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול כוללים התאמת זמן ושיטות הדה-צלולריזציה והבטחת דה-צלולריזציה מלאה.
בהשוואה לשיטות קיימות אחרות להנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, פרוטוקול זה מציע מספר יתרונות. להידרוג'ל DC-ECM פעילות ביולוגית מצוינת, מבנה מרחבי ופונקציית אינדוקציה ביולו...

הנדסת רקמת סחוס היא תחום המתפתח במהירות המבקש לחדש רקמת סחוס פגועה או חולה1. אחד האתגרים המרכזיים בתחום זה הוא פיתוח פיגומים ביומימטיים שיכולים לתמוך בגדילה ובהתמיינות של כונדרוציטים, התאים האחראים לייצור סחוס2. ECM של רקמת הסחוס משחק תפקיד קריטי בוויסות ההתנהגות של chondrocytes. DC-ECM הוא פיגום יעיל ליישומי הנדסת רקמות3.
מספר טכניקות פותחו לייצור DC-ECM מרקמת סחוס, כולל שיטות כימיות, אנזימטיות ופיזיקליות. עם זאת, שיטות אלה גורמות לעתים קרובות לייצור הידרוג'לים ECM שאינם ביומימטיים מספיק, מה שמגביל את הפוטנציאל שלהם לשימוש ביישומי הנדסת רקמות 4,5. לכן, יש צורך בשיטה יעילה יותר לייצור הידרוג'לים DC-ECM.
הפיתוח של טכניקה זו חשוב מכיוון שהיא יכולה לקדם את תחום הנדסת הרקמות על ידי מתן גישה חדשה ליצירת פיגומים ביומימטיים שיכולים לתמוך בהתחדשות רקמות ותיקונן. יתר על כן, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לייצור הידרוג'ל ECM מרקמות אחרות, ובכך להרחיב את היישומים הפוטנציאליים שלה.
בגוף הספרות הרחב יותר, יש עניין גובר בשימוש ב- DC-ECM כפיגום ליישומי הנדסת רקמות6. מחקרים רבים הוכיחו את יעילותם של הידרוג'לים DC-ECM בקידום גדילת תאים והתמיינותם ברקמות שונות, כולל סחוס 7,8. לכן, פיתוח פרוטוקול לייצור הידרוג'ל DC-ECM המחקה באופן הדוק את ה-ECM הטבעי של רקמת הסחוס הוא תרומה משמעותית לתחום.
הפרוטוקול המוצג במאמר זה עונה על צורך זה על ידי מתן שיטה חדשנית לייצור הידרוג'לים DC-ECM המחקים באופן הדוק את ה- ECM הטבעי של רקמת הסחוס. הפרוטוקול כולל דה-צלולריזציה של רקמת הסחוס, בידוד ה-ECM המתקבל ויצירת הידרוג'ל על ידי קישור צולב של ה-ECM עם פולימר תואם ביולוגית. ההידרוג'ל שהתקבל הראה תוצאות מבטיחות בתמיכה בצמיחה ובהתמיינות של כונדרוציטים.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl, pH7.6</td><td>Beyotime</td><td>ST776-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH8.0</td><td>Beyotime</td><td>ST780-500 mL-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; מקפיא C</td><td>Eppendorf</td><td>F440340034</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease</td><td>Aladdin</td><td>D128600-80KU</td><td></td></tr><tr><td>DNAasy Blood & ערכת רקמות</td><td>Qiagen</td><td>מס' 69506</td><td></td></tr><tr><td>ערכת זיהוי כמותי קולורימטרי GAG</td><td>שנחאי Haling</td><td>HL19236.2</td><td></td></tr><tr><td>HCP-2 מייבש &nbsp;</td><td>היטאצ'י</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>תרמו פישר</td><td>N/A</td><td>ספקטרופוטומטר</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>ריבונוקלאז</td><td>אלאדין</td><td>R341325-100 מ"ג</td><td></td></tr><tr><td>Sigma500</td><td>ZIESS</td><td>N/A</td><td>מיקרוסקופ אלקטרונים סורק</td></tr><tr><td>ספקטרה S</td><td>תרמו פישר</td><td>N/A</td><td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור</td></tr><tr><td>מסננת נירוסטה</td><td>SHXB-Z-1</td><td>שנחאי Xinbu</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Beyotime</td><td>P0096-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15050065</td><td></td></tr><tr><td>מנורת אולטרה סגול</td><td>Omnicure 2000</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>ויטמין B2</td><td>Gibco</td><td>R4500-5G</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>שנחאי Qiasen</td><td>78HW-1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

סינתזה של הידרוג'לים מטריצה חוץ-תאית סחוס דה-תאי

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

הידרוג'לים של מטריצה חוץ-תאית לסחוס דה-תאי (DC-ECM) הם ביו-חומרים מבטיחים להנדסת רקמות ולרפואה רגנרטיבית בשל התאימות הביולוגית שלהם ויכולתם לחקות תכונות רקמות טבעיות. פרוטוקול זה נועד לייצר הידרוג'לים DC-ECM המחקים באופן הדוק את ה- ECM המקורי של רקמת הסחוס. הפרוטוקול כולל שילוב של שיבוש פיזיקלי וכימי ועיכול אנזימטי לסילוק החומר התאי תוך שמירה על המבנה וההרכב של ה-ECM. DC-ECM מקושר באמצעות חומר כימי ליצירת הידרוג'ל יציב ופעיל ביולוגית. להידרוג'ל DC-ECM פעילות ביולוגית מצוינת, מבנה מרחבי ופונקציית אינדוקציה ביולוגית, כמו גם אימונוגניות נמוכה. מאפיינים אלה מועילים בקידום הידבקות תאים, התרבות, התמיינות ונדידה וליצירת מיקרו-סביבה מעולה לצמיחת תאים. פרוטוקול זה מספק משאב רב ערך לחוקרים וקלינאים בתחום הנדסת הרקמות. הידרוג'לים ביומימטיים יכולים לשפר את הפיתוח של אסטרטגיות יעילות להנדסת רקמות לתיקון והתחדשות סחוס.

כדי להכין הידרוג'ל סחוס DC-ECM טוב יותר, למדנו וסקרנו את הספרות הקודמת והשווינו את פרוטוקולי הדה-צלולריזציה השונים במונחים של יחס דה-צלולריזציה, אימונוגניות ופונקציונליות מכנית9.
על בסיס זה, הכנו את הידרוג'ל הסחוס DC-ECM וחקרנו את ההשפעה של ביו-דיו אקסוזום אקסוזום של מטריצת מיצוי רדיאלית/תאי גזע מזנכימליים בטיפול במומים אוסטאוכונדרליים. התוצאות הראו כי הידרוג'ל הסחוס DC-ECM היה בעל אימונוגניות נמוכה ויכול לשפר את נדידת התאים ולקדם תיקון סחוס10.</...

מאמר זה מציג שיטה חדשה לסינתזה של הידרוג'לים חוץ-תאיים של מטריצה חוץ-תאית של סחוס דה-צלולרי (DC-ECM). להידרוג'ל DC-ECM יש תאימות ביולוגית מצוינת והם מספקים מיקרו-סביבה מעולה לצמיחת תאים. לכן, הם יכולים להיות פיגומים תאים אידיאליים ומערכות העברה ביולוגיות.

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

הפרוטוקול שלנו משמעותי מכיוון שהוא מאפשר יצירת מחלות בהידרוג'לים הדומים מאוד לאופי רקמת הסחוס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לייצר מחלות בהידרוג'לים עם פעילות ביולוגית ניכרת במבנה מרחבי, אימונוגניות נמוכה ותפקוד תעשייתי ביולוגי. כדי להתחיל, קוצצים את הסחוס שנאסף באמצעות אזמל לחתיכות בגודל של מילימטר מעוקב אחד עד שניים.בצינור צנטריפוגה של 50 מ"מ, שוקעים 20 גרם של הסחוס הטחון ב -20 מיליליטר של חיץ טריס-הידרוכלוריד היפוטוני. מניחים את הצינור על 80 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות, ולאחר מכן בתנור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. מערבלים את צינור הצנטריפוגה למשך 30 שניות ב-1000 סל"ד.לאחר מכן סננו את הסחוס נטול התאים באמצעות מסננת פלסטיק המונחת על צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. שטפו את הסחוס שלוש פעמים עם PBS סטרילי לפני איסופו. הוסיפו 10 מיליליטר של תמיסת טריפסין לסחוס שנאסף ודגרו עליו על שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, החליפו את הטריפסין כל ארבע שעות.לאחר סינון המתלים, לשטוף את הסחוס טריפסיני עם חיץ hypertonic. לאחר שימור הסחוס, מוסיפים 10 מיליליטר של תמיסת נוקלאז ומניחים אותו על שייקר בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר שטיפה עם PBS סטרילי, להוסיף תמיסת Tris-hydrochloride היפרטונית לסחוס ולהניח אותו על שייקר כפי שהודגם.לאחר השטיפה עם PBS סטרילי, לטבול את הרקמה בתמיסת 1% Triton X-100 למשך 24 שעות. לאחר הסרת Triton X-100, שטפו את הסחוס נטול התאים במים מזוקקים במשך שלושה ימים, והחליפו את המים כל 12 שעות. לאחר שלושה ימים, מוסיפים תמיסת חומצה פראצטית לסחוס ומשרים אותה למשך ארבע שעות.לאחר שנשטף עם PBS, לאסוף את הסחוס באמצעות מסננת פלסטיק כפי שהודגם בעבר. בעזרת חנקן נוזלי, להכין אבקת סחוס decellularized. מוסיפים 80 מיליליטר של 0.5 חומצה אצטית מולרית ו-20 מיליגרם פפסין לשני גרם אבקת סחוס, ומעכלים את התערובת במשך 24 שעות בחום של 37 מעלות.לאחר העיכול, צנטריפוגו את המתלה ב 400 G במשך 10 דקות ולאסוף את supernatant, אשר נקרא עכשיו פתרון DC-ECM לאחסון פתרון DC-ECM, להוסיף מיליליטר אחד של הפתרון לכל באר של צלחת שש בארות ומניחים אותו בליופיליזר. לאחר ייבוש התמיסה בהקפאה, העבירו אותה לצינור צנטריפוגה. ליצירת הידרוג'ל, יש להמיס 20 מיליגרם של תמיסת DC-ECM מיובשת בהקפאה במיליליטר אחד של מים מזוקקים סטריליים.לאחר ערבוב, להוסיף מיליגרם אחד של ויטמין B2 לתמיסת DC-ECM. לאחר הדגירה, להקרין אותו עם אור UV במשך שלוש דקות. הוסיפו את החיץ GTL ופרוטאינאז K ל-20 מיליגרם אבקת סחוס DC-ECM, וערבבו היטב באמצעות תנודות מערבולת.להמסה מלאה של הסחוס, דוגרים על התערובת בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר מערבולת, להוסיף 200 מיקרוליטר של GTL חיץ ואחריו אתנול נטול מים. לאחר המערבולת, צנטריפוגו את הדגימה ב 6000 G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן לאסוף ולכמת את הדנ"א כפי שמתואר בכתב היד. לניתוח קולגן, יש להחמיץ, חמישה מיליגרם אבקת DC-ECM בחומצה הידרוכלורית בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן נטרלו אותו עם חמישה מיליליטר של שישה תמיסת נתרן הידרוקסיד מולרית.חשב את תכולת ההידרוקסיפרולין של הדגימה המנוטרלת באמצעות ספיגה של 570 ננומטר כנגד תקן הידרוקסיפרולין. הוסף 500 מיקרוליטר של מגיב A ל 200 מיליגרם של אבקת DC-ECM לאחר ערבוב. לדגור על הדגימה בארבע מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.לאחר צנטריפוגה, לאסוף 50 מיקרוליטר של פתרון הדגימה ולהוסיף 50 מיקרוליטר של מגיב B, ואחריו מגיב C.לאחר הדגירה של הדגימה במשך 10 דקות, להוסיף 750 מיקרוליטר של מגיב D לדגור במשך 30 דקות בחושך. לאחר הצנטריפוגה, מוסיפים מיקרוליטר אחד של מגיב E לגלולה ומערבבים היטב לפני הצנטריפוגה. לאחר מכן נתק את הדגימה לפני מדידת תוכן GAG.בסחוס DC-ECM שהוכן, תכולת ה- DNA בוטלה באופן משמעותי. עם זאת, תכולת הקולגן והגליקאנו נשמרה בהשוואה לסחוס הטבעי. ניתוח SEM ו- TEM הדגים את מבנה העל של DC-ECM מוכן.ההידרוג'ל המוכן בצינור ההפוך לא זרם לתחתית, ובכך הדגים ג'לציה. יתר על כן, בהשוואה לתמיסת DC-ECM בלבד, תוספת של ויטמין B2 הפחיתה את זמן הג'לציה עקב ההצלבה המושרה במהלך היווצרות הידרוג'ל DC-ECM. צמיגות ההידרוג'ל DC-ECM הייתה גבוהה יותר צמיגות התמיסה וקצבי גזירה מוגברים הפחיתו את צמיגות התמיסה.יתר על כן, מודולוס האחסון הגבוה של תמיסת DC-ECM והידרוג'ל הצביע על כך שלשניהם יש תכונות ג'ל ולא נוזלי. ניתוח SEM הראה כי גודל הנקבוביות של תמיסת DC-ECM ירד משמעותית בצורת הידרוג'ל לאחר crosslinking וייבוש בהקפאה. הפרוטוקול כולל שילוב של שיבוש פיזיקלי וכימי ועיכול אנזימטי לסילוק חומר תאי תוך שמירה על המבנה והשיחה של ה-ECM.

synthesis-of-decellularized-cartilage-extracellular-matrix-hydrogels

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

ביוסינתזה של מטריקס סחוסים ידי כונדרוציטים יכולה להיות מושפעת על ידי יישום של גירויים מכאניים. שיטה זו מתארת ​​את הטכניקה של החלת זני דחיסה דינמיים לכונדרוציטים גלומים במבני 3D וההערכה של Induced שינויים בחילוף חומרי chondrocyte.

גירוי מכאני של הידרוג Chondrocyte-agarose

Bioprinter שימש ליצירה הידרוג דוגמת המבוסס על תבנית עולה. עובש poloxamer היה backfilled עם הידרוג'ל שני ולאחר מכן eluted, ומשאיר חללים שהיו מלאים בידרוג'ל שלישי. שיטה זו משתמשת elution המהיר וטוב של printability poloxamer לייצר ארכיטקטורות מורכבות מbiopolymers.

הדפסת תבניות היפוך Thermoresponsive ליצירת בדוגמת הידרוג דו רכיבים-תרבות תאי 3D

תיקון סחוס מייצג אתגר רפואי שלא נענה וגישות מבוססות תאים להנדסת סחוס מפרקי אנושי הן פתרון מבטיח. כאן, אנו מתארים הידרוג'לים ביומימטיים תלת מימדיים (תלת מימדיים) ככלי אידיאלי להתרחבות והתבגרות של כונדרוציטים מפרקיים אנושיים.

3D Hydrogel פיגומים למפרקים הכונדרוציטים תרבות וסחוס דור

זוהי שיטה ליצור פיגום תרבית תאים 3-ממדי תאי מטריקס ריאתי. ריאות שלמים מעובדות לתוך הידרוג שיכול לתמוך בצמיחה של תאים בשלושה ממדים.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

פרוטוקול זה מתאר את decellularization מלא של שריר הלב האנושי תוך שמירה על מרכיביו מטריצה חוץ-תאית. עיבוד נוסף של התוצאות מטריצה חוץ-תאית בייצור של microparticles ו הידרוג וההספק עצמית של cytoprotective.

עיבוד של רקמת הלב האנושי כלפי עצמי בהרכבת הידרוג במבחנה ויישומים In Vivo מטריצה חוץ-תאית

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבדות של הכליה קורטקס חוץ-תאית מטריקס-derived הידרוג כדי לשמור על הכליה יליד מטריצה חוץ-תאית (ECM) הרכב הביוכימי מבניים. תהליך ייצור ויישומיה מתוארים. לבסוף, נדון פרספקטיבה על שימוש זה הידרוג לתמיכה ספציפית כליות הסלולר ורקמות רגנרציה ומחזור בביו-הנדסה.

בדיית כליות קורטקס חוץ-תאית מטריקס-Derived הידרוג

פיגומים הסחוס, נגזר decellularized יכול לשמש בדומה לפיגום כדי לתקן סחוס מדריך וכאמצעי לחדש רקמות osteochondral. מאמר זה מתאר את התהליך decellularization בפירוט ומספק הצעות להשתמש פיגומים אלו בהגדרות במבחנה.

ייצור של מטריקס הסחוס, נגזר Decellularized פיגומים

המטרה של פרוטוקול זה הוא ייצור של סיבי מטריצה חוץ-תאית כל ממוקד עבור תיקון הפצע אשר מתאימים להערכה פרה כחלק שתל משובי לגרדום. סיבים אלו המיוצר על ידי התרבות של fibroblasts על ממברנות הולופייבר, שחולצו על ידי פירוק הממברנות.

ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר

לטיפול בעצם באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית על ידי השתלת רקמת סחוס מלאכותית המיוצרת מתאי גזע מזנכימליים יש פוטנציאל לעקוף את החסרונות של טיפולים קונבנציונליים. הידרוג'ל חומצה היאלורונית יעיל בהגדלת שתלי סחוס ממוינים באופן אחיד, כמו גם ביצירת עצם משולבת עם כלי דם בין שתלים מאוחים in vivo.

היווצרות עצם משולבת באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית in vivo באמצעות תאי גזע מזנכימליים

הפרוטוקול מבהיר שתי מתודולוגיות דה-צלולריזציה נפרדות המיושמות על רקמות ריאה מקומיות של בקר, ומספק תיאור מקיף של האפיונים שלהן.

פיתוח ואפיון הידרוג'לים מטריקס חוץ-תאיים ריאתיים דה-צלולריים

למד שיטה לסינתזת הידרוג'לים ממטריצה חוץ-תאית סחוס דה-תאי (DC-ECM) המשמרים מבנה ביולוגי ומציגים אימונוגניות נמוכה. הטכניקה משלבת טיפול תרמי, עיכול אנזימטי וצלבית UV ליצירת פתרונות רפואיים מתקדמים.

סינתזה של הידרוג'לים מטריצה חוץ-תאית סחוס דה-תאי

גלה סרטונים נוספים