Name: מצב מגע מיקרוסקופ כוח אטומי כטכניקה מהירה לתצפית מורפולוגית וניתוח נזק לתאי חיידקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: למדו שימוש במיקרוסקופ כוח אטומי במצב מגע לניתוח מורפולוגי של חיידקים כולל Staphylococcus aureus ו-Pseudomonas hunanensis. השיטה מאפשרת זיהוי שינויים מבניים ונזק תאי ביעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

רמירו מוניז-דיאז מודה ל-CONACyT על המלגה.

1. בידוד וזיהוי חיידקים
<ol><li>בידוד זן אנדופיטי מריסטמים של פקעת שום:<ol><li>הניחו 2 מ"מ של שברי מריסטמים מפקעות שום קלופות, מחוטאות וחתוכות בעבר על אגר סויה טריפטיקייס (TSA) כמצע צמיחה עשיר, ודגרו בטמפרטורה של 25°C למשך יום אחד.</li>
		<li>בהתבסס על ההבדלים המורפולוגיים של מושבות החיידקים - צורה, גודל, צבע, קצה, אור מועבר, אור מוחזר, מרקם, עקביות וייצור פיגמנטים - מתארים את המורפוטיפים השונים שנצפו, ומטהרים על ידי פסים צולבים מושבה מייצגת של כל מורפוטיפ.</li>
		<li>שמרו על כל זני החיידקים המטוהרים בגליצרול 30% בטמפרטורה של -80°C.</li>
		<li>זהה זן שנבחר באופן אקראי (9AP) על ידי ריצוף rDNA 16S. לחלץ את הדנ"א בשיטה של הופמן ווינסטון8.</li>
		<li>להגביר את rRNA 16S על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) עם 100 ng של DNA, 1x פולימראז חוצץ, 4 mM MgCl2, 0.4 mM dNTPs, 10 pmol כל אחד של 27F/1492r אוליגונוקלאוטידים אוניברסליים, ו 1 U של DNA פולימראז9. השתמש בתנאי המחזור התרמי הבאים: 95 °C למשך 5 דקות עבור denaturalization הראשוני; ואחריו 35 מחזורים של דקה אחת ב 94 ° C כטמפרטורת denaturalization, 1 דקות ב 56 ° C כטמפרטורת הכלאה, ו 1 דקות ב 72 ° C כטמפרטורת הארכה; ולאחר מכן 10 דקות ב 72 ° C כהארכה סופית.</li>
		<li>רצף נימי המוצר PCR באמצעות אותם אוליגונוקלאוטידים; השתמש בשיטת Dideoxy-Terminal עם ערכת התקנת מטריצה לריצוף נימי10, ובצע אלקטרופורזה במערכת רב-נימי אוטומטית11.</li>
		<li>ערוך ידנית את הרצפים, השווה את הרצף עם ספריית GenBank באמצעות חיפוש BLAST, וזהה באופן טנטטיבי את הזן עם תקן הזהב של לפחות 98.7% זהות עם המין הקרוב ביותר12,13. הערה: הזן 9AP זוהה כשייך למין Pseudomonas hunanensis, עם זהות של 99.86% עם הרצף של הזן P. hunanensis LV (JX545210).</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת דגימת חיידקים לתצפית מורפולוגית על ידי AFM
<ol><li>בתנאים סטריליים, הניחו טיפה של תרחיף החיידקים (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) על מגלשת זכוכית.</li>
	<li>תקן את הדגימות בשקופית על ידי חימום יבש. מעבירים את המגלשה בעדינות על להבה מספר פעמים עד שהדגימה יבשה. הערה: קיבוע דגימות הוא טכניקה שגרתית במיקרוביולוגיה כדי לצפות באורגניזמים פרוקריוטים קבועים ולדמות את המבנה שלהם כתאים חיים קרוב ככל האפשר.</li>
	<li>הניחו את הדגימות הקבועות בצלחת פטרי, וקחו אותן לציוד AFM לתצפית. הערה: מכיוון שניתן לשנות את הדגימות בהתאם לתנאי מזג האוויר לאורך זמן, הקצה זמן מרבי של 24 שעות לניתוח בציוד AFM. שמור את הדגימות ללא אבק.</li>
</ol>3. השפעה אנטיבקטריאלית של חלקיקי MgO נגד חיידקים
הערה: הסינתזה והאפיון של NPs MgO פורסמו בעבר14. בעבודה זו, הפעילות האנטיבקטריאלית של הננו-חומרים הוערכה בהתבסס על המדריך של מכון התקנים הקליניים והמעבדה (CLSI) תוך שימוש בשיטות של דילול מקרודילוציה ומיקרודילוציה לעיכוב15,16.
<ol><li>הערכת הפעילות המעכבת המינימלית (MIC) וקוטלי חיידקים (CMB)<ol><li>טרום צמיחה של הזנים<ol><li>חסן כמות מתאימה של Escherichia coli או Staphylococcus aureus לתוך מרק מזין כדי לקבל ריכוז סופי של 1 × 108 CFU/מ"ל.</li>
			<li>לדגור את התרחיף ב 37 ° C (± 2 ° C) במשך 18-24 שעות.</li>
		</ol></li>
		<li>לאחר צמיחה של זנים מאוקלמים<ol><li>לטבול לולאה בקטריולוגית סטרילית בהשעיה, נוגע בתחתית הצינור.</li>
			<li>יש לבצע את השימוש בלולאה על אגר כחול מאוזין ומתילן ואגר מזין.</li>
			<li>לדגור על צלחות אגר ב 37 ° C (± 2 ° C) במשך 24 שעות.</li>
		</ol></li>
		<li>בחירת מושבות להכנת החיסון הסטנדרטי<ol><li>קח שלוש עד חמש מושבות עם אותו סוג מורפולוגי על ידי נגיעה בחלק העליון של המושבה בצלחת פטרי עם לולאה בקטריולוגית.</li>
			<li>מעבירים וטובלים את הבחירה ב 3-5 מ"ל של מרק Müller-Hinton.</li>
			<li>דגירה ב 37 ° C (± 2 ° C) כדי להשיג עכירות של 1 × 10 8 CFU/מ"ל או 2 × 108 CFU/מ"ל. הערה: בעבודה זו, תקני העכירות של מקפרלנד שימשו כהתייחסות למתלים הבקטריולוגיים; באופן ספציפי, תקן 0.5 מתאים בערך לתרחיף E. coli הומוגני של 1.5 × 108 תאים / מ"ל. ספקטרופוטומטר UV-Vis שימש למדידת העכירות.</li>
			<li>קח 1 מ"ל, ולהוסיף אותו 9 מ"ל של מרק סטרילי. קח 200 μL של דילול זה, ולהוסיף אותו 19.8 מ"ל של מרק סטרילי כדי לקבל ריכוז סופי של 5 × 105 CFU/mL.</li>
		</ol></li>
		<li>ריכוזים נדרשים של ננו-חלקיקי MgO<ol><li>השתמש ultrasonicator להכנת הפתרונות.</li>
			<li>מרחפים את הננו-חומר במים סטריליים בריכוז כפול מהנדרש לקבלת תמיסות סדרתיות.</li>
			<li>הוסיפו את המתלים הללו לצינורות סטריליים המכילים מרק מולר-הינטון כדי להשיג את טווח הריכוזים החדש הדרוש לניסוי. הערה: ריכוזי MgO NPs הבאים יושמו עבור מיקרו-דילול: 30 חל"מ, 60 חל"מ, 120 חל"מ, 250 חל"מ, 500 חל"מ, 1,000 חל"מ, 2,000 חל"מ, 3,000 חל"מ, 4,000 חל"מ ו-8,000 חל"מ.</li>
		</ol></li>
		<li>הכנת המיקרודילולציה15<ol><li>הכינו צלחת מיקרוטיטר חדשה וסטרילית בעלת 96 בארות (microplate). תווית עמודה מס '12 של microplate כמו עמודה סטריליות; סמן עמודה מס' 11 כעמודת בקרת גדילה.</li>
			<li>הוסף 120 μL של תרחיפים ננו-חלקיקים עם ריכוזים שונים לעמודות מס '1-10.</li>
			<li>לחסן 120 μL של חיידקים (5 × 10,5 CFU/mL) לתוך הבארות בעמודות מס '1-10. הערה: במחקר זה, שורה G ושורה H היו בקרות עם ceftriaxone בריכוזים שהוצעו על ידי תקני CLSI: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0.5 ppm, 0.25 ppm, 0.125 ppm, 0.06 ppm ו- 0.03 ppm.</li>
			<li>לדגור את microplate 96-well במשך 24 שעות ב 37 ° C (35 ° C ± 2 ° C). לבסוף, לנתח את הבארות.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>תצפית על שינויים מורפו-מבניים הנגרמים על ידי ננו-חלקיקים של MgO בזני החיידקים על ידי AFM<ol><li>קח 250 μL מהבארות של בדיקות microdilution, לערבב עם 750 μL של מים סטריליים, צנטריפוגה ב 2,000 × גרם מ 2 דקות עד 5 דקות ב 5 ° C.</li>
		<li>לשטוף את שקעים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של מים סטריליים בכל פעם, ובסוף שטיפות, להוסיף 500 μL של מים להם.</li>
		<li>כדי לקבל את תמונות AFM, צלם 10-20 μL של המתלה הסופי של כל התחלה טובה, בצע מריחה על שקופית שנוקתה בעבר על ידי אולטרסאונד (30 דקות), וייבוש בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.</li>
	</ol></li>
</ol>4. מדידות AFM
הערה: כאן, מיקרוסקופ הכוח האטומי במצב מגע הורכב על תחנת עבודה נגד רטט שאפשרה בידוד של המיקרוסקופ מכל מקור רטט מכני ושמר על המערכת מפולסת. הפרעות חשמליות מופחתות באמצעות מסנני קו והגנה מפני נחשולי מתח. ה-AFM המשמש כאן מיישר אוטומטית את קרן הלייזר לגלאי הפוטו.
<ol><li>הפעל את המחשב ואת AFM ולאחר מכן בחר את מצב מגע, בדיקות contAI-G ואת האפשרויות Auto Slope בכלי התוכנה. ערכי ברירת המחדל של בקר Z הם Setpoint = 20 nM, P-Gain = 10,000, I-Gain = 1,000, D-Gain = 0 ומתח קצה = 0 mV. </li>
	<li>מקם את הדגימות במצב מגע AFM באמצעות ראש טווח סריקה של 70 מיקרומטר. השתמשנו במכלי סיליקון ContAI-G עם קבוע קפיץ של 0.13 N/m.</li>
	<li>השתמש במכשיר מצלמה המורכב על שתי עדשות המשולבות בראש הסריקה כדי לקבל תצוגה מהירה של פני השטח של האזור מתחת לבדיקה.</li>
	<li>בצע עקירה ידנית במישור XY על מנת לבחור את האזור הרצוי. הגשושית נעשית כדי להתקרב אלקטרונית לדגימת פני השטח עד שמגיעים לתנאי המגע. כוונן אלקטרונית את מישור המדידה XY של הסורק ומשטח הדגימה על-ידי הפחתת השיפועים בכיווני XY.</li>
	<li>השתמש בפרמטרים הסטנדרטיים של התוכנה: שורה אחת לשנייה ב 256 נקודות לשורה.</li>
	<li>ראשית, בצע טווח סריקה מלא של שטח 70 מיקרומטר x 70 מיקרומטר; לאחר מכן, בחרו אזור קטן יותר בעזרת הכלי זום. AFM ממטב את טווח התרשימים ב- Z באופן אוטומטי. הערה: על-ידי הקטנת הקווים לשנייה בפעם השנייה, זמן הסריקה הכולל גדל, איכות הסריקה מוגדרת יותר, וחלק מהרעש מהמדידה מנוקה גם הוא.</li>
	<li>על מנת לבחור אזור חדש מהדגימה, משוך את הקנטיל באופן אלקטרוני, והזז את הדגימה לאורך מישור XY. ממש סריקה חדשה באמצעות ההליך המתואר בשלב 4.5 ובשלב 4.6. הערה: הסריקות המתקבלות מוצגות בסקאלת עמודות של צבע יחיד, שבה הצבעים הבהירים משויכים לגבהים גבוהים יותר, והצבעים הכהים קשורים לגבהים עמוקים יותר. תוכנת AFM יוצרת תצוגה תלת-ממדית של הסריקה המאפשרת להעריך את פרטי המשטח הנמדד.</li>
	<li>בצע את עיבוד הנתונים באמצעות פילוס שורה אחר שורה בתפריט כלים של התמונה בבחירת המסנן, שהיא שיטת הפילוס הנפוצה והפשוטה ביותר. הערה: שיטת פילוס זו לוקחת כל קו אופקי או אנכי שנוצר בתמונת AFM ומתאימה אותו למשוואה פולינומית.</li>
	<li>מטב את הגובה המרבי והמינימלי בסרגל הצבע מימין כדי לקבל את רזולוציית התמונה הטובה ביותר.</li>
	<li>בצע את ניתוח התמונה באמצעות תפריט ניתוח בסרגל הכלים. קבעו את הגבהים והמרחקים באמצעות בחירת הנקודות הראשוניות והסופיות לאחר בחירת הכלי הרצוי. הערה: על המשתמשים לנסות את המסננים השונים בתפריט כלים כדי להימנע מלכלוכים של תמונת קצה עקב השיטוח שנעשה בו שימוש בתהליך ההחלקה. לכלוכי תמונה מופיעים כקווי פס ומוצגים בחלק מתמונות AFM.</li>
</ol>

<ol><li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+form+of+the+bacterial+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22American+Scientist%22%5BJournal%5D)">Growth and form of the bacterial cell wall.</a> American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).</li>
<li>Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+growth+and+form+under+mechanical+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Bacterial growth and form under mechanical compression.</a> Scientific Report. 5, 11367(2015).</li>
<li>Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozitsyn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+shape%3A+Some+features+of+ultrastructure%2C+evolution%2C+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Bulletin+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell shape: Some features of ultrastructure, evolution, and ecology.</a> Biology Bulletin Reviews. 12, 254-265 (2022).</li>
<li>Cabeen, M. T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell shape.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (8), 601-610 (2005).</li>
<li>Smith, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+morphology+drives+spatial+patterning+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell morphology drives spatial patterning in microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 114 (3), E280-E286 (2017).</li>
<li>Volke, D. C., Nikel, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+bacteria+in+shape%3A+Synthetic+morphology+approaches+for+the+design+of+efficient+microbial+cell+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Getting bacteria in shape: Synthetic morphology approaches for the design of efficient microbial cell factories.</a> Advanced Biosystems. 2 (11), 1800111(2018).</li>
<li>Mi, L., Ning, X., Lianqing, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+force+tapping+atomic+force+microscopy+for+advancing+cell+and+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Peak force tapping atomic force microscopy for advancing cell and molecular biology.</a> Nanoscale. 13 (18), 8358-8375 (2021).</li>
<li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57 (2-3), 267-272 (1987).</li>
<li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li>
<li>Behr, S., Mätzig, M., Levin, A., Eickhoff, H., Heller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fully+automated+multicapillary+electrophoresis+device+for+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ELECTROPHORESIS%22%5BJournal%5D)">A fully automated multicapillary electrophoresis device for DNA analysis.</a> ELECTROPHORESIS. 20 (7), 1492-1507 (1999).</li>
<li>Seliger, H., Groger, G., Jirikowksi, G., Ortigao, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methods+for+the+solid-phase+sequence+analysis+of+nucleic+acid+fragments+using+the+Sanger+dideoxy+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleosides+%26+Nucleotides%22%5BJournal%5D)">New methods for the solid-phase sequence analysis of nucleic acid fragments using the Sanger dideoxy procedure.</a> Nucleosides & Nucleotides. 9 (3), 383-388 (1990).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Stackebrandt, E., Ebers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomic+parameter+revisited%3A+Tarnished+gold+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Today%22%5BJournal%5D)">Taxonomic parameter revisited: Tarnished gold standards.</a> Microbiology Today. 33, 152-155 (2006).</li>
<li>Muñiz Diaz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+triethylamine-based+synthesis+of+MgO+nanoparticles+and+their+antibacterial+effect+against+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Two-step triethylamine-based synthesis of MgO nanoparticles and their antibacterial effect against pathogenic bacteria.</a> Nanomaterials. 11 (2), 410(2021).</li>
<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 48, 5-16 (2001).</li>
<li>Sarker, S. D., Nahar, L., Kumarasamy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtitre+plate-based+antibacterial+assay+incorporating+resazurin+as+an+indicator+of+cell+growth%2C+and+its+application+in+the+in+vitro+antibacterial+screening+of+phytochemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microtitre plate-based antibacterial assay incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial screening of phytochemicals.</a> Methods. 42 (4), 321-324 (2007).</li>
<li>Giesbrecht, P., Kersten, T., Maidhof, H., Wecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+cell+wall%3A+Morphogenesis+and+fatal+variations+in+the+presence+of+penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal cell wall: Morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1371-1414 (1998).</li>
<li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((autolysin+ring+associated+with+cell+separation+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">autolysin ring associated with cell separation of Staphylococcus aureus.</a> Journal of Bacteriology. 178 (6), 1565-1571 (1996).</li>
<li>Zuttion, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-adhesive+effect+of+glycoclusters+on+Pseudomonas+aeruginosa+bacteria+adhesion+to+epithelial+cells+studied+by+AFM+single+cell+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">The anti-adhesive effect of glycoclusters on Pseudomonas aeruginosa bacteria adhesion to epithelial cells studied by AFM single cell force spectroscopy.</a> Nanoscale. 10 (26), 12771-12778 (2018).</li>
<li>Kahli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+growth+conditions+on+Pseudomonas+fluorescens+morphology+characterized+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Impact of growth conditions on Pseudomonas fluorescens morphology characterized by atomic force microscopy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 9579(2022).</li>
<li>Kambli, P., Valavade, A., Kothari, D. C., Kelkar-Mane, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphostructural+changes+induced+in+E.+coli+exposed+to+copper+ions+in+water+at+increasing+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Morphostructural changes induced in E. coli exposed to copper ions in water at increasing concentrations.</a> World Journal of Pharmaceutical Research. 4 (10), 837-852 (2015).</li>
<li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vivo+atomic+force+microscopy-infrared+spectroscopy+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 140(2018).</li>
<li>Stoimenov, P. K., Klinger, R. L., Marchin, G. L., Klabunde, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+oxide+nanoparticles+as+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Metal oxide nanoparticles as bactericidal agents.</a> Langmuir. 18, 6679-6686 (2002).</li>
<li>Lee, H. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NaCl+influences+thermal+resistance+and+cell+morphology+of+Escherichia+coli+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">NaCl influences thermal resistance and cell morphology of Escherichia coli strains.</a> Journal of Food Safety. 36 (1), 62-68 (2016).</li>
<li>Song, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+effects+of+Schisandra+chinensis+extract+on+and+its+application+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Antibacterial effects of Schisandra chinensis extract on and its application in food.</a> Journal of Food Safety. 38 (5), e12503(2018).</li>
<li>Mohamed, W. M., Khallaf, M. F., Hassan, A. A., Elbayoumi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermotolerance+of+Staphylococcus+aureus+after+sublethal+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Arab+Universities+Journal+of+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Thermotolerance of Staphylococcus aureus after sublethal heat shock.</a> Arab Universities Journal of Agricultural Sciences. 27 (1), 467-477 (2019).</li>
<li>Shar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+of+platinum+by+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metals%22%5BJournal%5D)">Biomineralization of platinum by Escherichia coli.</a> Metals. 9 (4), 407(2019).</li>
<li>Baidamshina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+microbial+biofilms+using+Ficin%2C+a+nonspecific+plant+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease.</a> Scientific Reports. 7, 46068(2017).</li>
<li>Ovchinnikova, E. S., vander Mei, H. C., Krom, B. P., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+adsorbed+serum+proteins+during+adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+an+abiotic+surface+and+Candida+albicans+hyphae-An+AFM+study%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Exchange of adsorbed serum proteins during adhesion of Staphylococcus aureus to an abiotic surface and Candida albicans hyphae-An AFM study.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 110, 45-50 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

מיקרוסקופיה היא טכניקה נפוצה במעבדות ביולוגיות המאפשרת לחקור את המבנה, הגודל, המורפולוגיה והסידור התאי של דגימות ביולוגיות. כדי לשפר טכניקה זו, ניתן להשתמש במספר סוגים של מיקרוסקופים השונים זה מזה מבחינת המאפיינים האופטיים או האלקטרוניים שלהם, הקובעים את כוח הרזולוציה של המכשיר.
במחקר המדעי, השימוש במיקרוסקופ נדרש לאפיון תאי חיידקים; לדוגמה, מיקרוסקופיה הראתה כי NaCl משפיע על ההתנגדות התרמית והמורפולוגיה התאית של זני E. coli, תמצית Schisandra chinensis מראה השפעות אנטיבקטריאליות כלפי ...

צורות חיידקים שונות זוהו לראשונה על ידי אנטוני ואן לוונהוק במאה ה-171. חיידקים קיימים במגוון גדול של צורות מאז ימי קדם, החל מכדוריות ועד תאים מסתעפים2. צורת התא היא תנאי בסיסי עבור טקסונומים חיידקיים לתאר ולסווג כל מין חיידקי, בעיקר עבור ההפרדה המורפולוגית של פילה גראם-חיובי וגרם שליליפילה 3. מספר אלמנטים ידועים כקובעים את צורות התא החיידקי, כולם מעורבים בכיסויי התא ותומכים בהם כמרכיבים של דופן התא וקרום התא, כמו גם בשלד התא. בדרך זו, מדענים עדיין מבהירים את המנגנונים והתהליכים הכימיים, הביוכימיים והפיזיקליים המעורבים בקביעת צורות תאי חיידקים, שכולם מוגדרים על-ידי צבירי גנים המגדירים צורות חיידקים 2,4.
בנוסף, מדענים הראו כי צורת המוט היא ככל הנראה הצורה הקדומה של תאי חיידקים, שכן צורת תא זו נראית אופטימלית בפרמטרים משמעותיים לתא. לפיכך, צורות קוקוס, ספירלה, ויבריו, נימה וצורות אחרות נחשבות כהתאמות לסביבות שונות; ואכן, מורפולוגיות מסוימות התפתחו באופן עצמאי מספר פעמים, מה שמרמז על כך שצורות של חיידקים יכולות להיות התאמות לסביבות מסוימות 3,5. עם זאת, לאורך מחזור החיים של תא החיידק, צורת התא משתנה, וזה קורה גם כתגובה גנטית לתנאי סביבה מזיקים3. צורת תא החיידק וגודלו, קובעים במידה רבה את הנוקשות, החוסן והיחס בין פני השטח לנפח של החיידקים, וניתן לנצל תכונה זו לתהליכים ביוטכנולוגיים6.
מיקרוסקופיה אלקטרונית משמשת לחקר דגימות ביולוגיות בשל ההגדלה הגבוהה שניתן להגיע אליה מעבר למיקרוסקופים מבוססי אור. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הן הטכניקות הנפוצות ביותר למטרה זו; עם זאת, דגימות דורשות כמה טיפולים לפני שהם ממוקמים לתוך החדר של המיקרוסקופ על מנת לקבל תמונות מתאימות. כיסוי זהב על הדגימות נדרש, ואת הזמן המשמש לרכישת התמונה הכוללת לא צריך להיות ארוך מדי. לעומת זאת, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) היא טכניקה בשימוש נרחב בניתוח משטחים, אך משמשת גם בחקר דגימות ביולוגיות.
ישנם מספר סוגים של מצבי AFM המשמשים בניתוח פני שטח, כגון מצב מגע, מצב ללא מגע או הקשה, מיקרוסקופ כוח מגנטי (MFM), AFM מוליך, מיקרוסקופ כוח פיאזואלקטרי (PFM), הקשה על כוח שיא (PFT), תהודה במגע ועוצמת כוח. כל מצב משמש בניתוח חומרים ומספק מידע שונה על פני השטח של החומרים ותכונותיהם המכניות והפיזיקליות. עם זאת, מצבי AFM מסוימים משמשים לניתוח דגימות ביולוגיות במבחנה, כגון PFT, מכיוון ש- PFT מאפשר קבלת נתונים טופוגרפיים ומכניים על תאים בתווך נוזלי7.
בעבודה זו השתמשנו במצב הבסיסי ביותר הכלול בכל דגם AFM ישן ופשוט – מצב המגע. AFM משתמש בגשושית חדה (בקוטר של כ-<50 ננומטר) כדי לסרוק אזורים שגודלם פחות מ-100 מיקרומטר. הגשושית מיושרת למדגם על מנת לקיים אינטראקציה עם שדות הכוח המשויכים לדגימה. פני השטח נסרקים עם הגשושית כדי לשמור על כוח קבוע. לאחר מכן, תמונה של פני השטח נוצרת על ידי ניטור התנועה של המגן כפי שהוא נע על פני המשטח. המידע שנאסף מספק את התכונות הננו-מכניות של פני השטח, כגון היצמדות, גמישות, צמיגות וגזירה.
במצב מגע AFM, הקנטייבר נסרק על פני הדגימה בסטייה קבועה. זה מאפשר לקבוע את גובה הדגימות (Z), וזה מייצג יתרון על פני טכניקות מיקרוסקופ אלקטרוני אחרות. תוכנת AFM מאפשרת יצירת סריקת תמונה תלת-ממדית על ידי אינטראקציה בין קצה הדגימה למשטח הדגימה, והסטייה של החוד מתואמת לגובה הדגימה באמצעות לייזר וגלאי.
במצב סטטי (מצב מגע) עם כוח קבוע, הפלט מציג שתי תמונות שונות: הגובה (טופוגרפיית z) והסטייה או אות השגיאה. מצב סטטי הוא מצב הדמיה פשוט ובעל ערך, במיוחד עבור דגימות חזקות באוויר שיכולות להתמודד עם העומסים הגבוהים וכוחות הפיתול המופעלים על ידי מצב סטטי. מצב הסטייה או השגיאה מופעל במצב כוח קבוע. עם זאת, תמונת הטופוגרפיה משופרת עוד יותר על ידי הוספת אות ההסטה למבנה פני השטח. במצב זה, אות הסטייה מכונה גם אות השגיאה מכיוון שהסטייה היא פרמטר המשוב; כל התכונות או המורפולוגיה המופיעות בערוץ זה נובעות מה"שגיאה" בלולאת המשוב או, ליתר דיוק, בשל לולאת המשוב הנדרשת כדי לשמור על נקודת סטייה קבועה.
העיצוב הייחודי של AFM הופך אותו לקומפקטי - קטן מספיק כדי להתאים לשולחן - ובו בזמן ברזולוציה גבוהה מספיק כדי לפתור צעדים אטומיים. לציוד AFM יש עלות נמוכה יותר מאשר לציוד למיקרוסקופים אלקטרוניים אחרים, ועלויות התחזוקה מינימליות. המיקרוסקופ אינו דורש מעבדה עם תנאים מיוחדים כמו חדר נקי או חלל מבודד; הוא זקוק רק לשולחן עבודה נטול רטט. עבור AFM, הדגימות אינן צריכות לעבור הכנה משוכללת כמו בטכניקות אחרות (כיסוי זהב, הרזיה); יש לצרף רק דגימה יבשה למחזיק הדגימה.
אנו משתמשים במצב מגע AFM כדי לצפות במורפולוגיות חיידקיות ובהשפעות של NPs. ניתן לצפות באוכלוסייה ובמורפולוגיה התאית של חיידקים המקובעים על תמיכה, כמו גם בנזק התאי המיוצר על ידי ננו-חלקיקים על מיני החיידקים. התמונות המתקבלות על ידי מצב מגע AFM מאשרות כי זהו כלי רב עוצמה ואינו מוגבל על ידי ריאגנטים ופרוצדורות מסובכות, מה שהופך אותו לשיטה פשוטה, מהירה וחסכונית לאפיון חיידקים.

<table><tbody><tr><td>AFM EasyScan 2</td><td>NanoSurf</td><td>הופסק</td><td>מדידה</td></tr><tr><td>מדיה לולאה בקטריולוגית</td><td>אין אפליקה</td><td>לא</td><td>ישים מכשיר לחיסון חיידקים</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1</td> ערכת התקנה של <td>ThermoFisher Scientific</td><td>4337455</td><td>Matrix</td></tr><tr><td>Bioedit</td><td>לא ישים</td><td>גרסה 7.2.5</td><td>עורך</td></tr> <tr><td>יישור רצףספקטרומטר Cary 60</td><td>Agilent Technologies</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>ceftriazone</td><td>Merck</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td> אנטיביוטית <td>eppendorf</td><td>לא ישים</td><td>להסרת חלקיקים שמפריעים לשלוחה של AFM</td></tr><tr><td>ContAI-G סיליקון</td><td>BudgetSensors</td><td>ContAl-G-10</td><td>מדידת מדידה</td></tr><tr><td>eosin ו-methylene blue agar</td><td>Merck</td><td>לא ישים</td><td>מדיום תרבית חיידקים</td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 25922</td><td>זן חיידקים</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M8295</td><td>PCR של 16S rRNA</td></tr><tr><td>גן microplate</td><td>Thermo Scientific</td><td>10558295</td><td>לניתוח מיקרו-דילול</td></tr><tr><td>M&uuml; מרק ller-Hinton</td><td>Merck</td><td>לא ישים</td><td>תרבית חיידקים אגר מזין בינוני</td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>לא ישים</td><td>תרבית חיידקים מרק</td></tr><tr><td>מזין</td><td></td> בינוני מרק <td>לא ישים</td><td>תרבית חיידקים בינוני</td></tr><tr><td>כלי פטרי</td><td>לא ישים לא ישים</td><td></td><td>גידול של חיידקים</td></tr><tr><td>Pseudomonas hunanensis 9AP</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>מבודד מנורת השום על ידי ריצוף CNRG</td></tr><tr><td>Sanger</td><td>Macrogen</td><td>לא ישים</td><td>שירות ריצוף</td></tr><tr><td>ScienceDesk תחנת עבודה נגד רעידות</td><td>ThorLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>לא ישים לא ישים</td><td>מחזיק זכוכית לניתוח דגימת חיידקים</td><td></td></tr> <tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>אוסף תרבות מסוג</td><td>אמריקאי ATCC 25923</td><td>זן חיידקי</td></tr><tr><td>Thermalcycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Veriti-4375786</td><td>הגברת PCR</td></tr><tr><td>אגר סויה טריפטיקזאין BD</td><td></td><td>BA-256665</td><td>מדיית גידול</td></tr><tr><td>אולטראסוניקטור</td><td>מעבד אולטרסאונד קול-פארמר, 220 VAC</td><td>לא ישים</td><td>לערבוב דילול ננו-חלקיקים</td></tr></tbody></table>

מצב מגע מיקרוסקופ כוח אטומי כטכניקה מהירה לתצפית מורפולוגית וניתוח נזק לתאי חיידקים

Contact Mode Atomic Force Microscopy as a Rapid Technique for Morphological Observation and Bacterial Cell Damage Analysis

מיקרוסקופ אלקטרונים הוא אחד הכלים הדרושים לאפיון מבנים תאיים. עם זאת, ההליך מסובך ויקר בשל הכנת הדגימה לתצפית. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) היא טכניקת אפיון שימושית מאוד בשל הרזולוציה הגבוהה שלה בתלת מימד ובשל היעדר כל דרישה למוליכות ואקום ודגימה. AFM יכול לצלם מגוון רחב של דגימות עם טופוגרפיות שונות וסוגים שונים של חומרים. 
AFM מספק מידע טופוגרפי תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה מרמת האנגסטרום ועד לסולם המיקרון. שלא כמו מיקרוסקופיה מסורתית, AFM משתמש בגשושית כדי ליצור תמונה של טופוגרפיית פני השטח של דגימה. בפרוטוקול זה, השימוש במיקרוסקופ מסוג זה מוצע לאפיון מורפולוגי ונזק תאי של חיידקים המקובעים על תמיכה. נעשה שימוש בזנים של Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) ו-Pseudomonas hunanensis (שבודדו מדגימות פקעת שום). בעבודה זו גודלו תאי חיידק בתרבית ספציפית. כדי לצפות בנזק לתאים, Staphylococcus aureus ו- Escherichia coli הודגרו עם ריכוזים שונים של ננו-חלקיקים (NPs). 
טיפה של מתלה חיידקי נקבעה על תומך זכוכית, ותמונות צולמו עם AFM בקני מידה שונים. התמונות שהתקבלו הראו את המאפיינים המורפולוגיים של החיידקים. יתר על כן, באמצעות AFM, ניתן היה לצפות בנזק למבנה התא שנגרם על ידי ההשפעה של NPs. בהתבסס על התמונות שהתקבלו, AFM מגע יכול לשמש כדי לאפיין את המורפולוגיה של תאי חיידקים קבועים על תמיכה. AFM הוא גם כלי מתאים לחקר ההשפעות של NPs על חיידקים. בהשוואה למיקרוסקופ אלקטרונים, AFM היא טכניקה זולה וקלה לשימוש.

תמונות של המורפולוגיה והגודל של הזנים S. aureus ו- P. hunanensis , כמו גם ארגון האוכלוסייה של שני הזנים, צולמו במיקרוסקופ כוח אטומי במצב מגע. התמונות של S. aureus הראו שהאוכלוסייה שלו התפזרה לפי אזורים עם אגרגטים של קוקוס (איור 1A). עם הגידול בקנה המידה, הייתה הערכה גדולה יותר של התפלגות האוכלוסייה והמורפולוגיה של הקוקוס (איור 1B). דוחות המיקרוסקופ הראו כי מבנה פסאודו-המיספרי היה קיים בתאים סמוכים של S. aureus, אך באופן כללי, ...

כאן אנו מציגים את היישום של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) כשיטה פשוטה ומהירה לאפיון חיידקים ומנתחים פרטים כגון גודל וצורת החיידקים, ביופילמים של תרבית חיידקים ופעילות ננו-חלקיקים כקוטלי חיידקים.

Electron microscopy is one of the tools required to characterize cellular structures. However, the procedure is complicated and expensive due to the ...

פרוטוקול זה מראה את השימוש במיקרוסקופ כוח אטומי במצב מגע כדי לצפות בשינויים במורפולוגיה של התא עקב מחלה או טיפול ספציפיים. מומלץ מאוד להשתמש במיכלים אטומים להליך זה כדי למנוע זיהום ולנתח את המדגם הקבוע בהקדם האפשרי כדי למנוע הזדקנות. התחל על ידי קיבוע הדגימות בשקופית על ידי העברה עדינה של המגלשה מעל להבה מספר פעמים עד שהדגימה יבשה.מניחים את הדגימות הקבועות בצלוחית פטרי ומעבירים אותן לציוד מיקרוסקופ הכוח האטומי לתצפית. לאחר מכן, הפעל את המחשב ואת מיקרוסקופ הכוח האטומי. לאחר מכן בחר את מצב איש הקשר, בדיקות ContAI-G ואפשרויות שיפוע אוטומטי בתוכנה.הגדר את ערכי ברירת המחדל עבור בקר Z על ידי הגדרת נקודת ההגדרה ל- 20 ננומטר, רווח P ב- 10, 000, רווח I ב- 1, 000, רווח D באפס ומתח קצה לאפס מיליוולט. באמצעות ראש טווח סריקה של 70 מיקרומטר, מקם את הדגימות במצב מגע AFM. קבל תצוגה מהירה של פני השטח מתחת לגשושית באמצעות מצלמה המורכבת על שתי עדשות המשולבות בראש הסריקה.עכשיו, בחר את האזור הרצוי על ידי עקירה ידנית אותו במישור XY. אפשר לגשושית להתקרב אלקטרונית למשטח הדגימה עד שתגיע למגע. התאם אלקטרונית את מישור המדידה XY של הסורק ומשטח הדגימה על-ידי הפחתת כיוון שיפוע XY.הגדר את הפרמטרים הסטנדרטיים של התוכנה לקו אחד לשנייה ו 256 נקודות לשורה. לאחר מכן בצע טווח סריקה מלא של שטח של 70 על 70 מיקרומטר. בחרו באזור הקטן יותר בעזרת הכלי זום.בחר אזור חדש מהדגימה על-ידי משיכת המגן באופן אלקטרוני והזזת הדגימה לאורך מישור XY. לאחר מכן בצע סריקה חדשה כפי שהודגם בעבר. לאחר מכן, השתמש בפילוס שורה אחר שורה בתפריט הכלים של התמונה בבחירת המסנן כדי לבצע עיבוד נתונים.מטבו את הגובה המרבי והמינימלי בסרגל הצבע לקבלת רזולוציית התמונה הטובה ביותר. לבסוף, בצע את ניתוח התמונה באמצעות תפריט הניתוח. בחר את הנקודות הראשוניות והסופיות בעזרת הכלי הרצוי כדי לקבוע את האורך והמרחק.ניתוח מיקרוסקופי של כוח אטומי של תרביות החיידקים הראה כי תרביות Staphylococcus aureus התפזרו לפי אזורים עם אגרגטים קוקוס. סולמות מוגברים הראו שיש הערכה גדולה יותר של התפלגות האוכלוסייה ומורפולוגיה של קוקוס. תמונות מצב המגע AFM אפשרו לקבוע את גודל הקוקוס שהראה רוחב ממוצע של 1.25 מיקרומטר.Pseudomonas hunanensis הראה פיזור הומוגני על כל משטח התמיכה בזכוכית ויצר חד-שכבה דבקה. התרביות היו בצורת מוט באורך של 1.9 מיקרומטר וברוחב של 0.9 מיקרומטר. חשיפה לדילול מיקרו של ננו-חלקיקי תחמוצת מגנזיום של סטפילוקוקוס זהוב גרמה לאובדן משטח חלק וקווי מתאר הומוגניים עקב הידרדרות חמורה במבנה התאים.היווצרות שלפוחית ושחרור חומר ציטוסולי נצפו בתרביות בריכוזים גבוהים יותר מאשר המיקרופון. תוצאות דומות התקבלו בתרביות E.coli, כאשר הבקרות הראו משטחים חלקים המדגישים את צורתו ההומוגנית דמוית המוט. המבנה נעלם לחלוטין בחשיפה של 1, 000 PPM לננו-חלקיקים עם צלליות מובחנות בלבד.חשוב לבצע תיקון מדגם כראוי כפי שהוא חיוני לניתוח נוסף. מסנן התמונה מסייע לספק רזולוציית תמונה טובה ופרטים לדוגמה. באמצעות שיטת התיקון, ניתן ליישם מצבי AFM ללא מגע שיכולים להיות מועילים בחקר תכונות מכניות.מתודולוגיה זו יכולה להיות כלי זול ושימושי למחקר רפואי ומיקרוביולוגי המתמקד בניתוח נזק לתאי חיידקים.

contact-mode-atomic-force-microscopy-as-rapid-technique-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה נועד להדריך את הקורא בפעולה של כוח אטומי משולב אופטי מיקרוסקופ הדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבות. פרוטוקול צעד אחר צעד מוצג. נתונים נציג קבוצה שמראה תא חי בתגובה לגירוי מכני מוצג.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

חיים חיידקים גראם שליליים גראם חיוביים יכולים להיות משותקת על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה בנוזל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

אנו מתארים שיטה למעקב אחר קרע endomembrane שהושרו על ידי החיידקים תוך...

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

שיטה לחקירת המבנה של קולטן אור חלבון באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מתוארת במאמר זה. מיפוי מאפיינים ננו-מכניים כמותי של PeakForce (PF-QNM) חושף דימרים חלבונים שלמים על משטח נציץ.

מיקרוסקופית כוח האטומי של אורות אדומים קולטני אור שימוש במיפוי PeakForce כמותי nanomechanical נכס

כאן, אנחנו מפרטים את הטכניקות ניסיוני המשמשים להערכת כוחות בליטה podosomes להחיל על סרט תואם, משלב הכנת הסרט לניתוח אוטומטי של תמונות הטופוגרפי.

בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא

אנו מציגים פרוטוקול לפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התלויה מנופים עם תא T יחיד וחלקיק חרוז למחקרים אימונולוגיים. הליכים לחקור בודד זוג תא תא דנדריטי כריכה על ידי AFM ולפקח על התגובה התאית בזמן אמת של מקרופאגים לחלקיק אחיד אחד על ידי AFM עם הדמיה פלואורסצנטית מוצגים.

הפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי מנופים עם תאים חד-טי או חלקיק יחיד לספקטרוסקופיית של כוח בודד אימונולוגיים

מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור את הדינמיקה לוקליזציה של חלבון subcellular ולנטר שינויים מורפולוגיים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה ב subtilis מקרתגו ו סטיילוולוקוקוס.

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

פרוטוקול זה נועד להפוך מדידות AFM לאוטומטיות על מאות תאים מיקרוביאליים. ראשית, מיקרואורגניזמים משותקים למיקרו-מבנים של חותמות PDMS ולאחר מכן מאלצים מדידות ספקטרוסקופיה להתבצע באופן אוטומטי על מאות תאים משותקים.

אוטומציה של מדידות מיקרוסקופ כוח ביו-אטומי על מאות תאי C. אלביקנס

להלן הפרוטוקול של טכניקת קונפוקל, המשלבת מיקרוסקופיה של כוח קונפוקלי ואטומי לפלטפורמת מכשיר יחיד. Conpokal מספק תא זהה, אותו אזור, ליד הדמיה קונפוקאלית בו זמנית אפיון מכני של דגימות ביולוגיות חיות.

ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים

ספקטרוסקופיית מיקרוסקופיה-אינפרא אדום של הכוח האטומי (AFM-IR) מספקת פלטפורמה רבת עוצמה למחקרים חיידקיים, המאפשרת להשיג רזולוציה ננומטרית. שניהם, מיפוי של שינויים תת-תאיים (למשל, על חלוקת תאים) כמו גם מחקרים השוואתיים של הרכב כימי (למשל, הנובעים עמידות לתרופות) יכולים להתבצע ברמת תא אחד בחיידקים.

מיקרוסקופיה של כוח אטומי בשילוב עם ספקטרוסקופיית אינפרא אדום ככלי לחקירת כימיה של חיידק יחיד

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שינויים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) עם מערכת תאורת אור, ייצור תאים נוזליים, ותצפיות in situ TEM של אינטראקציות הנגרמות על ידי אור בין תאי חיידקים לבין פוטוסנסיטייזר. כמו כן נדונו שיטות הכנת הדגימה, נזק לקרן אלקטרונים והדמיה.

מיקרוסקופיית אלקטרונים המושרה על ידי אור באתרו לתצפית על אינטראקציית החומר הנוזלי-רך

למדו שימוש במיקרוסקופ כוח אטומי במצב מגע לניתוח מורפולוגי של חיידקים כולל Staphylococcus aureus ו-Pseudomonas hunanensis. השיטה מאפשרת זיהוי שינויים מבניים ונזק תאי ביעילות.

מצב מגע מיקרוסקופ כוח אטומי כטכניקה מהירה לתצפית מורפולוגית וניתוח נזק לתאי חיידקים

גלה סרטונים נוספים