מצב מגע מיקרוסקופ כוח אטומי כטכניקה מהירה לתצפית מורפולוגית וניתוח נזק לתאי חיידקים
30 ביוני 2023
כאן אנו מציגים את היישום של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) כשיטה פשוטה ומהירה לאפיון חיידקים ומנתחים פרטים כגון גודל וצורת החיידקים, ביופילמים של תרבית חיידקים ופעילות ננו-חלקיקים כקוטלי חיידקים.
פרוטוקול זה מראה את השימוש במיקרוסקופ כוח אטומי במצב מגע כדי לצפות בשינויים במורפולוגיה של התא עקב מחלה או טיפול ספציפיים. מומלץ מאוד להשתמש במיכלים אטומים להליך זה כדי למנוע זיהום ולנתח את המדגם הקבוע בהקדם האפשרי כדי למנוע הזדקנות. התחל על ידי קיבוע הדגימות בשקופית על ידי העברה עדינה של המגלשה מעל להבה מספר פעמים עד שהדגימה יבשה.
מניחים את הדגימות הקבועות בצלוחית פטרי ומעבירים אותן לציוד מיקרוסקופ הכוח האטומי לתצפית. לאחר מכן, הפעל את המחשב ואת מיקרוסקופ הכוח האטומי. לאחר מכן בחר את מצב איש הקשר, בדיקות ContAI-G ואפשרויות שיפוע אוטומטי בתוכנה.
הגדר את ערכי ברירת המחדל עבור בקר Z על ידי הגדרת נקודת ההגדרה ל- 20 ננומטר, רווח P ב- 10, 000, רווח I ב- 1, 000, רווח D באפס ומתח קצה לאפס מיליוולט. באמצעות ראש טווח סריקה של 70 מיקרומטר, מקם את הדגימות במצב מגע AFM. קבל תצוגה מהירה של פני השטח מתחת לגשושית באמצעות מצלמה המורכבת על שתי עדשות המשולבות בראש הסריקה.
עכשיו, בחר את האזור הרצוי על ידי עקירה ידנית אותו במישור XY. אפשר לגשושית להתקרב אלקטרונית למשטח הדגימה עד שתגיע למגע. התאם אלקטרונית את מישור המדידה XY של הסורק ומשטח הדגימה על-ידי הפחתת כיוון שיפוע XY.
הגדר את הפרמטרים הסטנדרטיים של התוכנה לקו אחד לשנייה ו 256 נקודות לשורה. לאחר מכן בצע טווח סריקה מלא של שטח של 70 על 70 מיקרומטר. בחרו באזור הקטן יותר בעזרת הכלי זום.
בחר אזור חדש מהדגימה על-ידי משיכת המגן באופן אלקטרוני והזזת הדגימה לאורך מישור XY. לאחר מכן בצע סריקה חדשה כפי שהודגם בעבר. לאחר מכן, השתמש בפילוס שורה אחר שורה בתפריט הכלים של התמונה בבחירת המסנן כדי לבצע עיבוד נתונים.
מטבו את הגובה המרבי והמינימלי בסרגל הצבע לקבלת רזולוציית התמונה הטובה ביותר. לבסוף, בצע את ניתוח התמונה באמצעות תפריט הניתוח. בחר את הנקודות הראשוניות והסופיות בעזרת הכלי הרצוי כדי לקבוע את האורך והמרחק.
ניתוח מיקרוסקופי של כוח אטומי של תרביות החיידקים הראה כי תרביות Staphylococcus aureus התפזרו לפי אזורים עם אגרגטים קוקוס. סולמות מוגברים הראו שיש הערכה גדולה יותר של התפלגות האוכלוסייה ומורפולוגיה של קוקוס. תמונות מצב המגע AFM אפשרו לקבוע את גודל הקוקוס שהראה רוחב ממוצע של 1.25 מיקרומטר.
Pseudomonas hunanensis הראה פיזור הומוגני על כל משטח התמיכה בזכוכית ויצר חד-שכבה דבקה. התרביות היו בצורת מוט באורך של 1.9 מיקרומטר וברוחב של 0.9 מיקרומטר. חשיפה לדילול מיקרו של ננו-חלקיקי תחמוצת מגנזיום של סטפילוקוקוס זהוב גרמה לאובדן משטח חלק וקווי מתאר הומוגניים עקב הידרדרות חמורה במבנה התאים.
היווצרות שלפוחית ושחרור חומר ציטוסולי נצפו בתרביות בריכוזים גבוהים יותר מאשר המיקרופון. תוצאות דומות התקבלו בתרביות E.coli, כאשר הבקרות הראו משטחים חלקים המדגישים את צורתו ההומוגנית דמוית המוט. המבנה נעלם לחלוטין בחשיפה של 1, 000 PPM לננו-חלקיקים עם צלליות מובחנות בלבד.
חשוב לבצע תיקון מדגם כראוי כפי שהוא חיוני לניתוח נוסף. מסנן התמונה מסייע לספק רזולוציית תמונה טובה ופרטים לדוגמה. באמצעות שיטת התיקון, ניתן ליישם מצבי AFM ללא מגע שיכולים להיות מועילים בחקר תכונות מכניות.
מתודולוגיה זו יכולה להיות כלי זול ושימושי למחקר רפואי ומיקרוביולוגי המתמקד בניתוח נזק לתאי חיידקים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה משתמש במיקרוסקופיה כוח אטומי (AFM) לאופיין חיידקים בפירוט, תוך התמקדות בגודל החיידקים, בצורתם, בביוממברים תרבותיים ובהשפעות החיידקים של ננו-חלקיקים. הפרוטוקול שם דגש על הכנת דגימות זהירה וטכניקות הדמיה ספציפיות לצפייה בשינויים מורפולוגיים בתאים חיידקיים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המחקר
- מִיקְרוֹבִּיוֹלוֹגְיָה
- אֲווִירוּת חִיידָקִית
- מחקר ננו-חלקיקים
רקע
- מיקרוסקופיה כוח אטומי היא כלי חשוב לצפייה במורפולוגיה של חיידקים.
- הבנת היווצרות ביוממברים חיידקיים ותגובה לחיידקים מסייעת במחקר רפואי.
- הכנת דגימות היא קריטית לצילום ונתוח מדויקים.
שיטות ששימשו
- מיקרוסקופיה כוח אטומי במצב מגע
- תרבויות Staphylococcus aureus ו-Pseudomonas hunanensis
- בדיקות חשיפה לננו-חלקיקים
תוצאות עיקריות
- ניתוח AFM גילה את גודל התאים החיידקיים והתפלגותם, כאשר Staphylococcus aureus הציג רוחב ממוצע של 1.25 מיקרומטר.
- ריכוזים מוגברים של ננו-חלקיקים של תחמוצת מגנזיום הובילו לשינויים מורפולוגיים משמעותיים בתאים החיידקיים.
- המחקר מדגים את יעילות ה-AFM לניתוח שלמות מבנית של חיידקים.
מסקנות
- מתודולוגיה זו מדגישה את התועלת של AFM במיקרוביולוגיה, במיוחד בהערכת נזק חיידקי.
- התוצאות תורמות להבנה הרחבה יותר של תגובות חיידקים לטיפולים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Contact mode atomic force microscopy (AFM) enables rapid, high-resolution morphological assessment of bacterial cells, supporting early-stage evaluation of antimicrobial interventions. This technique provides actionable 3D topography and cell damage data without the complexity or cost of electron microscopy, facilitating efficient screening of nanoparticle effects on bacterial integrity. AFM's operational simplicity and quantitative outputs position it as a valuable tool for mechanistic de-risking and target validation in anti-infective discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of bacterial cell morphology and structural changes following compound exposure.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cell damage and morphological disruption at the nanoscale.
- Facilitates rapid hypothesis testing regarding antimicrobial mechanisms of action.
Screening & Assay Development
- Provides reproducible, quantitative topographical data for assay standardization and validation.
- Accelerates screening of nanoparticle or compound libraries for bactericidal effects.
- Delivers high-content imaging outputs suitable for downstream comparative analytics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological readouts with translational biomarkers of bacterial cell integrity.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical validation of antimicrobial candidates.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust evidence of cellular impact.
Pipeline & Workflow Integration
AFM contact mode integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early, quantitative assessment of bacterial cell damage and morphology in response to candidate interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of antimicrobial mechanisms and cellular targets.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging data for compound triage and prioritization.
- Analytics: Provides quantitative measurements of cell size, surface integrity, and morphological disruption.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with preclinical models by aligning morphological endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective platform for repeated use across diverse bacterial strains and compound classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antimicrobial efficacy and mechanism-of-action studies.
- Operational Value: Reduces time and cost compared to electron microscopy while maintaining high-resolution outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative evidence of cellular impact.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates based on direct morphological evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and sample preparation to ensure data quality.
- Needs access to AFM instrumentation with contact mode capability and appropriate probes.
- Demands standardized protocols for sample fixing and imaging to ensure reproducibility across teams.
- Adaptable to various bacterial strains and nanoparticle types with protocol optimization.
- Sample aging and contamination must be minimized to preserve morphological integrity for analysis.
