Name: כימות בזמן אמת של ההשפעות של TnpB הקשור למשפחת IS200/IS605 על פעילות טרנספוזון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: למד כיצד לכמת בזמן אמת את השפעת חלבון TnpB על פעילות טרנספוזון בחיידקי Escherichia coli. שיטת הדמיה פלואורסצנטית זו מאפשרת מעקב אחר התנהגות תאים בודדים ומספקת תובנות לביולוגיה מולקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה כספית למחקר זה ניתנה על ידי קרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת קליפורניה.

1. הכנת תרביות חיידקים
<ol><li>לגדל זן E. coli MG1655 עם מבנים טרנספוזונים פלסמידים (שתוארו בעבר ב- Kim et al.8) בן לילה ב- LB עם האנטיביוטיקה המתאימה (25 מיקרוגרם / מ"ל של קנאמיצין, ראה טבלת חומרים) ב 37 °C. הערה: הרצפים של המבנים המשמשים והרצפים הקשורים זמינים כמספרי ההצטרפות של GenBank20 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 ו- OP717085.</li>
	<li>כדי להשיג צמיחה אקספוננציאלית במצב יציב, יש לדלל תרביות ≥100 פעמים לתוך המדיום M63 (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1.8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2SO 4, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל תיאמין [ויטמין B1]) בתוספת מקור פחמן (0.5% w/v גלוקוז כאן) ואנטיביוטיקה מתאימה (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>לגדל תרביות ב 37 °C עד הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD600) מגיע ~ 0.2. התרבויות מוכנות לשימוש.</li>
</ol>2. הכנת שקופיות
<ol><li>הכינו שקופית על ידי הרתחת M63 עם 0.5% גלוקוז w/v ו-1.5% w/v agarose במיקרוגל כדי להמיס את האגרוז ולוודא שהוא מותך לחלוטין ומעורבב היטב.</li>
	<li>יש לתת לתערובת להתקרר ל~55°C לפני הוספת אנטיביוטיקה וגורמים מעוררים (25 מיקרוגרם/מ"ל קנאמיצין ו-10 ננוגרם/מיקרול אנהידרו-טטרציקלין [aTc], ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>הנח שקופית מיקרוסקופ על שולחן העבודה. ערמו שתי שקופיות נוספות בניצב לראשון והניחו שקופית נוספת למעלה, במקביל לשקופית התחתונה. ודא שיש רווח השווה לעובי שקופית אחת בין השקופיות התחתונות והעליונות. פיפטה ~ 1 מ"ל של תערובת אגרוז M63 לתוך הפער הזה בין השקופיות לאט לאט כדי ליצור ריבוע ג'ל קטן.</li>
	<li>לאחר שהג'ל התמצק (~10-15 דקות), החלק את השקופית העליונה כדי להסיר אותו. גזרו את כרית האגרוז בעזרת סכין גילוח או סכין. ואז פיפטה 2.5 μL של התרבית (שלב 1.3) ולשים את כיסוי על גבי.</li>
	<li>אטמו את הרווח בין המגלשה למכסה באמצעות אפוקסי (ראו טבלת חומרים). תנו לאפוקסי להתייבש ולתאים להתיישב על כרית האגרוז למשך שעה אחת לפחות ב-37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>3. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר
<ol><li>הניחו את הדגימה המוכנה (שלב 1.3) על מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים) בסביבה מחוממת ומתוחזקת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.<ol><li>הגדר את זמני החשיפה המתאימים למצלמה המשמשת לרכישת תמונה. כוונן את עוצמת התאורה כדי למזער את הלבנת התמונות. הערה: זמן חשיפה של 2 שניות לכל אורך גל שימש במחקר הנוכחי.</li>
		<li>עבור כל אורך גל, מצא שדה ראייה (FOV) המכיל פלואורסצנטיות מינימלית. רכוש תמונות לשימוש במהלך הניתוח לחיסור רקע.</li>
	</ol></li>
	<li>הגדר פרוטוקול להשגת תמונות ברשת באורכי גל שונים ובמרווחי זמן קבועים.<ol><li>קידוד צילום בהילוך מהיר לפרוטוקול. הגדר את תדירות הרכישה למרווח הזמן הרצוי (20 דקות כאן) ואת משך הזמן הכולל לאורך הרצוי (24 שעות).</li>
		<li>קידוד אורכי גל מתאימים לפרוטוקול (בהתאם למבנה שבו נעשה שימוש). הערה: שיא העירור mCherry הוא ב-587 ננומטר ושיא הפליטה ב-610 ננומטר21; mVenus הוא ב 515 ננומטר ו 527 ננומטר12, בעוד mCerulean3 הוא ב 433 ננומטר ו 475 ננומטר11.</li>
		<li>הגדר את גודל הרשת כדי ללכוד בין המספר הרצוי של FOVs. הערה: הנתונים המייצגים המוצגים כאן השתמשו ב- 8 x 8 FOVs.</li>
	</ol></li>
</ol>4. ניתוח תמונות
<ol><li>בצע חיסור רקע בכל ערוץ צבע באמצעות תמונות הרקע המתאימות שנרכשו בשלב 3.1.2. עבור כל שלבי הניתוח, אנו משתמשים במודולים סטנדרטיים בפלטפורמת הקוד הפתוח פיג'י22 (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>הערך את האוכלוסייה הכוללת בכל נקודת זמן על-ידי ספיגת ערוץ mCerulean וחלוקת אזור הסף באזור התא הממוצע.</li>
	<li>כדי לספור את אירועי הכריתה הייחודיים, קח את נגזרת הזמן של ערוץ mCerulean3. בצע זאת על-ידי חיסור תמונות עוקבות בערוץ mCerulean3. אירועי הכריתה יזוהו בנגזרת הזמן כהבזק בהיר של פלואורסצנציה.<ol><li>סף את ערימת אירועי הכריתה כדי למנוע פלואורסצנטיות לא רצויה. שים לב שתהליך זה יסתום חלקים מהכריתות עצמן. כדי לתקן זאת, הרחיבו את התמונות כדי לשחזר את הכריתות לגודלן המקורי. הערה: ניתוחים באמצעות טכניקות דומות של ספיגה וניתוח תמונה יכולים להתבצע גם בערוצי הפלואורסצנציה האחרים (לדוגמה, קורלציה בין אירועי כריתה לבין רמות של טרנספוזאז TnpA [פלואורסצנציה של ונוס צהוב] ו- TnpB [פלואורסצנציה של mCherry אדום].</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).</li>
<li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li>
<li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li>
<li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).</li>
<li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li>
<li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE+dancing+in+the+human+genome%3A+transposable+elements+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).</li>
<li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposition+in+tumors+and+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Retrotransposition in tumors and brains.</a> Mobile DNA. 5, 11(2014).</li>
<li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+transposable+element+activity+in+individual+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time transposable element activity in individual live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).</li>
<li>Lutz, R., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+and+tight+regulation+of+transcriptional+units+in+Escherichia+coli+via+the+LacR%2FO%2C+the+TetR%2FO+and+AraC%2FI1-I2+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements.</a> Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).</li>
<li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation%2C+which+greatly+increases+promoter+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics+MGG%22%5BJournal%5D)">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li>
<li>Markwardt, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cerulean+fluorescent+protein+with+enhanced+brightness+and+reduced+reversible+photoswitching%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching.</a> PLoS One. 6 (3), 17896(2011).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).</li>
<li>Kersulyte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+element+ISHp608+of+Helicobacter+pylori%3A+nonrandom+geographic+distribution%2C+functional+organization%2C+and+insertion+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity.</a> Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).</li>
<li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li>
<li>Bao, W., Jurka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologues+of+bacterial+TnpB_IS605+are+widespread+in+diverse+eukaryotic+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements.</a> Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).</li>
<li>Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+insertion+sequences%3A+their+genomic+impact+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).</li>
<li>Altae-Tran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+IS200%2FIS605+transposon+family+encodes+diverse+programmable+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.</a> Science. 374 (6563), 57-65 (2021).</li>
<li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li>
<li>Kaur, D., Kuhlman, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IS200%2FIS605+family-associated+TnpB+increases+transposon+activity+and+retention%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Benson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ton-Hoang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Stranded+DNA+transposition+is+coupled+to+host+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication.</a> Cell. 142 (3), 398-408 (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

השיטה הייחודית המוצגת כאן להדמיה בזמן אמת של פעילות אלמנטים הניתנים להעברה בתאים חיים היא בדיקה רגישה שיכולה לזהות ישירות טרנספוזיציה בתאים חיים ובזמן אמת ולתאם פעילות זו עם ביטוי של חלבונים נלווים. בעוד שהתפוקה נמוכה מכפי שניתן להשיג בשיטות בתפזורת, שיטה זו משיגה מדידות מפורטות של פעילות TE וביטוי חלבונים בתאים חיים בודדים.
ניתן להשתמש במגוון כלים וטכניקות כדי לגדל תאים ישירות במיקרוסקופ לצורך הדמיה בזמן אמת. השיטה המשמשת כאן של גידול תאים על רפידות agarose יש את היתרון של להיות מהיר, זול, וק...

אלמנטים הניתנים להעברה (TEs) הם אלמנטים גנטיים המתגייסים בתוך הגנום המארח שלהם על ידי כריתה או זירוז העתקה ואחריה שילוב מחדש של גנום. TEs קיימים בכל תחומי החיים, והטרנספוזיציה בונה מחדש את הגנום המארח, תוך מוטציה של אזורי קידוד ובקרה1. זה יוצר מוטציות ומגוון שממלאים תפקיד חשוב באבולוציה2,3, התפתחות 4,5, וכמה מחלות אנושיות6, כולל סרטן7.
באמצעות מבנים גנטיים חדשניים שמצמידים היבטים של פעילות טרנספוזיציונית לכתבים פלואורסצנטיים, העבודה הקודמת שלנו תיארה את הפיתוח של מערכת ניסיונית המבוססת על TE IS608 החיידקי, נציג של משפחת ה-TEs הנפוצה IS200/IS605, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של טרנספוזיציה בתאים חיים בודדים8 (איור 1). מערכת TE מוצגת באיור 1A. ה- TE כולל את רצף קידוד הטרנספוזאז, tnpA, ולצדו קצה שמאלי (LE) וקצה ימין (RE) חזרות פלינדרומיות לא מושלמות (IP), שהן אתרי הזיהוי והכריתה עבור TnpA. tnpA מבוטא באמצעות מקדם PLTetO1, אשר מודחק על ידי מדכא tet והוא inducible עם anhydrotetracycline (aTc)9. ה- TE מפצל את הרצפים -10 ו- -35 של מקדם PlacIQ1 מכונן10 עבור הכתב הכחול mCerulean311. כפי שניתן לראות באיור 1C, כאשר הייצור של tnpA מושרה, ניתן לכרות את ה-TE, מה שמוביל לשיקום המקדם. התא המיוצר מבטא mCerulean3 ופלואורסצנטי כחול. N-terminus של TnpA מתמזג עם הכתב הצהוב ונוס12, ומאפשר מדידה של רמות TnpA על ידי פלואורסצנציה צהובה.
IS608 וחברים אחרים במשפחת הטרנספוזונים IS200/IS605 מקודדים בדרך כלל גם גן שני של הפונקציה הלא ידועה עד כה, tnpB13. חלבוני TnpB הם משפחה שופעת מאוד אך מאופיינת באופן לא מושלם של נוקלאזות המקודדות על ידי מספר TEs 14,15 חיידקי וארכאי, שלעתים קרובות מורכבים מ-tnpB16 בלבד. יתר על כן, מחקרים אחרונים חידשו את העניין ב-TnpB בכך שמצאו כי TnpB מתפקד כאנדונוקלאז מונחה RNA מונחה קריספר/Cas הניתן לתכנות אשר יניב הפסקות dsDNA או ssDNA בתנאים מגוונים17,18. עם זאת, עדיין לא ברור איזה תפקיד TnpB עשוי למלא בוויסות הטרנספוזיציה. כדי לבצע הדמיה בזמן אמת של ההשפעות של TnpB על טרנספוזיציה של IS608, נוצרה גרסה של הטרנספוזון, כולל אזור הקידוד של TnpB עם היתוך N-מסוף לחלבון הפלואורסצנטי האדום mCherry.
כהשלמה למחקרים מפורטים יותר ברמת תפזורת שבוצעו על ידי מעבדת Kuhlman19, הוא הראה כאן כיצד הדמיה בזמן אמת של פעילות טרנספוזון יכולה לחשוף באופן כמותי את ההשפעה של TnpB או כל חלבון עזר אחר על דינמיקה טרנספוזיציונית. על ידי מיזוג TnpB ל-mCherry, האירועים הטרנספוזיציוניים הבודדים מזוהים על ידי פלואורסצנציה כחולה ומתואמים עם רמות הביטוי של TnpA (פלואורסצנציה צהובה) ו- TnpB (פלואורסצנציה אדומה).

<table><tbody><tr><td>2 טון אפוקסי שקוף</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>5066</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום גופרתי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>AX1385-1</td><td></td></tr><tr><td>אנהידרוטטרציקלין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>37919</td><td></td></tr><tr><td>ארגון לייזר</td><td>Melles Griot</td><td>35-IMA-840-015</td><td></td></tr><tr><td>קוביית מסנן</td><td>כחולה כרומה</td><td>לדוגמה: Z457/10X, em: ET485/30M</td><td></td></tr><tr><td>D(+)גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Eclipse Ti-E</td><td>ניקון</td><td></td> קופסאות <td></td></tr><tr><td>ומגשי מילוי eppendorf eppendorf שהופסקו, נפח: 0.1 עד 10 ומיקרו; L, אורך: 3.4 ס"מ, 1.33 אינץ', PP (פוליפרופילן)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491504</td><td></td></tr><tr><td>קופסאות ומגשי מילוי eppendorf epTIPS, נפח: 50 עד 1000 ומיקרו; L, אורך: 7.1 ס"מ, 2.79 אינץ', PP (פוליפרופילן)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491555</td><td></td></tr><tr><td>ברזל סולפט Acs 500 גרם</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>706834</td><td></td></tr><tr><td>פיג'י</td><td></td><td></td><td>פיג'י (imagej.net)</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&nbsp;מרק LB, מילר (מגורען)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>שקופית כיסוי זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-542B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1355006</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי Cert Ac</td><td>Fisher XXM63SP3KG</td><td></td><td></td>מדעי</tr><tr><td>מיקרוסקופ מחמם</td><td>World Precision Instruments</td><td>96810-1</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט Monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>17001H</td><td></td></tr><tr><td>ProScan III שלב</td><td>קודם</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קוביית מסנן אדומה</td><td>כרומה</td><td>לשעבר: ET560/40X, Em: ET645/75M</td><td></td></tr><tr><td>ספיר 561 LP שקופית</td><td>1170412</td><td></td><td>קוהרנטית</td> לייזר</tr>, <tr><td>מיקרוסקופ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>125535B</td><td></td></tr><tr><td>תיאמין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ' (SIAL)</td> <td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ti-LU4 שיגור לייזר</td><td>ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קוביית מסנן צהוב</td><td>כרומה</td><td>לדוגמה: Z514/10X, EM: ET535/30M</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות בזמן אמת של ההשפעות של tnpb הקשור למשפחת is200/is605 על פעילות טרנספוזון

Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

כאן, מתווה פרוטוקול לביצוע הדמיה חיה בזמן אמת של פעילות אלמנטים הניתנים להעברה בתאי חיידקים חיים באמצעות חבילה של כתבים פלואורסצנטיים המצומדים לטרנספוזיציה. בפרט, הוא מדגים כיצד ניתן להשתמש בהדמיה בזמן אמת כדי להעריך את ההשפעות של חלבון האביזר TnpB על הפעילות של האלמנט הניתן להעברה IS608, חבר במשפחת IS200/IS605 של אלמנטים הניתנים להעברה. משפחת IS200/IS605 של יסודות הניתנים להעברה הם שפע של יסודות ניידים המחוברים לאחד הגנים הרבים ביותר שנמצאו בטבע, tnpB. הומולוגיות של רצף מציעות כי חלבון TnpB עשוי להיות קודמן אבולוציוני למערכות CRISPR/Cas9. בנוסף, TnpB זכה להתעניינות מחודשת, לאחר שהוכח כי הוא פועל כאנדונוקלאז דנ"א מונחה RNA דמוי Cas. ההשפעות של TnpB על שיעורי הטרנספוזיציה של IS608 ניתנות לכימות, והוכח כי הביטוי של TnpB של IS608 גורם לפעילות טרנספוזון מוגברת של ~5x בהשוואה לתאים ללא ביטוי TnpB.

שיטה זו של הדמיה של פעילות טרנספוזון בתאים חיים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, תוך תפוקה נמוכה יותר מאשר מדידות פלואורסצנטיות בתפזורת, מאפשרת הדמיה ישירה של פעילות טרנספוזון בתאים חיים בודדים. אירועי כריתה של טרנספוזון גורמים לבנייה מחדש של מקדם ה-mCerulean3 (איור 1), מה שמאפשר זיהוי של תאים שעוברים טרנספוזון על-ידי פלואורסצנציה כחולה בהירה (איור 2, TnpB+: סרט משלים 1 ו-TnpB-: סרט משלים 2). 
נמצא כ...

פרוטוקול מתואר לביצוע הדמיה חיה בזמן אמת כדי לכמת כיצד חלבון האביזר TnpB משפיע על הדינמיקה של טרנספוזיציה בתאי Escherichia coli חיים בודדים.

כימות בזמן אמת של ההשפעות של TnpB הקשור למשפחת IS200/IS605 על פעילות טרנספוזון

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לכמת סטטיסטיקות כריתה על בסיס תא בודד, בניגוד להסתכלות על התנהגות בתפזורת. ברמה זו, אנו יכולים לעקוב אחר ההתנהגות של תאים בודדים לאורך זמן, כולל רמות ה-TnpA וה-TnpB שלהם עבור תאים שנכנסים לעומת תאים שלא, מה שיכול לאפשר לנו, למשל, למדוד את ההשפעות של אירועים מוטציוניים מזוהים על קצב הגדילה. שיטה זו היא דרך פשוטה וזולה למדוד דינמיקה של מוטציות בתאים חיים.הגישה הכללית ישימה לכל מערכת הדורשת הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים. הכינו שקופית על ידי הרתחת M63 עם 0.5% גלוקוז ו-1.5% אגרוז במיקרוגל כדי להמיס את האגרוז. ודא כי המדיום הוא נמס לחלוטין מעורבב היטב.תנו לתערובת להתקרר ל-55 מעלות צלזיוס לפני הוספת אנטיביוטיקה ומשרה. הנח שקופית מיקרוסקופ על שולחן העבודה. ערימת שקופית אחת בניצב לשקופית הראשונה.ודא שיש רווח השווה לעובי שקופית אחת בין השקופית התחתונה לשקופית העליונה. פיפטה מיליליטר אחד של תערובת האגרוז M63 לתוך המרווח בין המגלשה באיטיות ליצירת ריבוע ג'ל קטן. לאחר שהג'ל התמצק, החלק את השקופית העליונה כדי להסיר אותו.גזרו את כרית האגרוז בעזרת סכין גילוח או סכין. לאחר מכן, פיפטה 2.5 microliters של תרבית חיידקים ולשים את הכיסוי להחליק על גבי. אטמו את הרווח בין המגלשה למכסה באמצעות אפוקסי.תנו לאפוקסי להתייבש ולתאים להתיישב על כרית האגרוז למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מניחים את הדגימה המוכנה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי בסביבה מחוממת ומתוחזקת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. עבור כל אורך גל, מצא את שדה הראייה המכיל פלואורסצנציה מינימלית.הגדר פרוטוקול להשגת תמונות ברשת באורכי גל שונים ובמרווחי זמן קבועים. אירועי כריתה של טרנספוזון גורמים לבנייה מחדש של המקדם עבור mCerulean3, ומאפשרים זיהוי של תאים העוברים פעילות טרנספוזון על ידי פלואורסצנציה כחולה בהירה. TnpB משפר את קצב כריתת הטרנספוזון.תאים המבטאים חלבון אביזר TnpB חווים רמות גבוהות פי ארבעה עד חמישה של פעילות טרנספוזון בהשוואה לתאים שליליים ל-TnpB. בתאים חיוביים ל-TnpB, לתאים שעוברים אירועי כריתת טרנספוזון יש רמות ביטוי גבוהות יותר של mCherry TnpB מאשר באוכלוסייה הכללית. יתר על כן, עבור תאים העוברים אירועי כריתה, תאים חיוביים ל-TnpB מבטאים רק רמות גבוהות יותר באופן שולי של TnpA-טרנספוזאז מאשר תאים שליליים ל-TnpB, שהם גבוהים יותר מהפלואורסצנטיות הצהובה של האוכלוסייה הכללית.המקום הסביר ביותר להיאבק בו הוא בהכנת תרבית התאים לניסוי. עליך לוודא שהתאים גדלים לפאזה מעריכית ושהשקופית מחוסנת במספר מתאים של תאים. זכרו להיזהר מבועות בעת איטום המגלשה כדי שג'ל האגרוז לא יתייבש.

real-time-quantification-effects-is200is605-family-associated-tnpb-on

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Kazi, M. I., et. al., יצירת ספריות החדרת טרנספוזונים בחיידקים גראם-שליליים לריצוף תפוקה גבוהה. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את הבחירה, הכימות והשימור של חיידקים נמענים גראם-שליליים הנושאים החדרות טרנספוזונים על סמך עמידות לקנמיצין.

בידוד של חיידקים גראם-שליליים עם החדרת טרנספוזון גנומי

כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis בתיווך transposon ספן מיני himar1 ליצירת ספריית מוטציה הכנסה בצפיפות גבוהה למסך, לבודד ולזהות רגולטורים אלגינט רומן בPAO1 מתח Pseudomonas aeruginosa אב הטיפוס.

זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; שימוש מיני<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesis תיווך transposon מרינר

sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף.

דור של Enterobacter Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

כאן אנו מתארים את זרימת העבודה לשימוש במערכת TetON להשגת ביטוי גנים ספציפי לרקמה בסנפיר הזנב המתחדש של דג הזברה הבוגר.

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

. כאן, עוצמת הכניסה אקראי בתיווך transposon של רכיב ה-DNA ללא קידוד שימש כדי לפתור את מעמדה כרומוזומלית אופטימלית.

קביעת Location(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור רכיב ה-DNA ב- Escherichia coli באמצעות גישה מוזרה בתיווך Transposon

המובאת כאן היא שיטה פשוטה ליצירת ספריית ההכנסה transposon בצפיפות גבוהה ב- Escherichia coli או שיגלה flexneri באמצעות קוניוגציה. פרוטוקול זה מאפשר היצירה של אוסף של מאות אלפי מוטציות ייחודיות של חיידקים על ידי החדרת גנומית אקראי transposon.

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

נתאר כאן טכניקה המשלבת מוטגנזה מכוונת transposon עם תפוקה גבוהה רצף כדי לזהות ולכמת transposon מוטציות leptospiral ברקמות לאחר אתגר של אוגרים. פרוטוקול זה יכול לשמש המוטנטים מסך עבור הישרדות והפצה בבעלי חיים, ניתן להחיל גם על מחקרים במבחנה .

רצף מקביל בתפוקה גבוהה כדי כושר מדד לזיהום Leptospira interrogans Transposon ההכנסה מוטציות במהלך הזהב הסורי אוגר

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשיג שילוב יציב הגן עניין הגנום האנושי על ידי המערכת היפהפייה הנרדמת transcriptionally מוסדרים. הכנת השילוב של וקטורים lentiviral פגומים, התמרה של במבחנה חושית של תאים אנושיים ואת וזמינותו המולקולרית בתאי transduced מדווחים.

שיטת טרנספוזיציה יעיל במבחנה על-ידי מערכת יופי ישן Transcriptionally מוסדרים הארוזים לתוך וקטור Lentiviral פגומים אינטגרציה

אנו מתארים שיטה ליצירת ספריות מוטציה טרנספוסון רוויבחיידקים גראם שלילי והכנה לאחר מכן של ספריות amplicon DNA להמשך תפוקה גבוהה. כדוגמה, אנו מתמקדים בפתוגן ESKAPE, Acinetobacter baumannii, אבל פרוטוקול זה הוא נוח למגוון רחב של אורגניזמים גראם שלילי.

יצירת ספריות הכנסה Transposon בחיידקים גראם שלילי עבור רצף בתפוקה גבוהה

זוהי שיטה מותאמת לזיהוי גורמי קולוניזציה חרקים מועמדים בסימביונט מועיל Burkholderia. מארח חיפושית נגוע בספריית מוטציות אקראית שנוצרת באמצעות mutagenesis טרנספוסון, ומורכבות הספרייה לאחר קולוניזציה מושוות לשליטה גדל במבחנה.

רצף הכנסה טרנספוסון ככלי להבהב גורמי קולוניזציה חיידקיים בבורקהולדריה גלדיולי סימביונט של לגריה וילוסה בילס

למד כיצד לכמת בזמן אמת את השפעת חלבון TnpB על פעילות טרנספוזון בחיידקי Escherichia coli. שיטת הדמיה פלואורסצנטית זו מאפשרת מעקב אחר התנהגות תאים בודדים ומספקת תובנות לביולוגיה מולקולרית.

כימות בזמן אמת של ההשפעות של TnpB הקשור למשפחת IS200/IS605 על פעילות טרנספוזון

גלה סרטונים נוספים