ניטור ביולומינסנטי של הישרדות השתל במודל העברה מאומץ של סוכרת אוטואימונית בעכברים

פרוטוקול זה יכול לעזור להבין את מנגנוני ההגנה מפני התקפות אוטואימוניות ולזהות מטרות טיפוליות להחלפת תאי בטא בסוכרת מסוג 1. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא העלות הנמוכה יחסית, הפשטות של תרבית התא, שיטות ההשתלה וההדמיה, כמו גם פולשניות מינימלית של טכניקות העכבר. אנשים שמעולם לא ביצעו הזרקת וריד זנב לפני כן עשויים להתקשות להחדיר את המחט לווריד.

בקש הדגמה על ידי מומחה לפני הזריקה הראשונה שלך. כדי להתחיל, לקחת את העכבר מורדם ולהסיר שיער מן הצד הגבי שלו באמצעות מכונת גילוח חשמלית עם מגן, חושף כ אינץ 'על שני סנטימטרים של העור. החזירו את העכבר המגולח לתא ההפלה.

לפני ההשתלה, להעביר עכבר אחד בכל פעם מהחדר למשטח נקי מצויד חרוט אף איזופלורן ולהנחות בעדינות את ראש העכבר לתוך חרוט האף. נגבו את האזור המגולח עם פד להכנת אלכוהול איזופרופיל כדי להסיר שיער רפוי ולחטא את העור. לאחר מכן, ציירו יותר מ -300 מיקרוליטר של תרחיף תאים לתוך מזרק סטרילי של מיליליטר אחד המצויד במחט 26 מד.

הסר את כל הבועות מהמזרק ושמור על 300 מיקרוליטר של תרחיף התא תוך דחיפת העודף. בעזרת זוג מלקחיים מעוקלים המוחזקים ביד הלא דומיננטית, הרימו בעדינות את העור בצד אחד של גב העכבר כדי לאפשר גישה קלה יותר לחלל התת עורי. לאחר מכן באמצעות היד הדומיננטית, מקם את המזרק במקביל למישורי העטרה והקשת של גוף העכבר.

כאשר המחט מכוונת לכיוון ראש העכבר, הכניסו אותה לעור הסמוך לרבעים האחוריים וכיוונו אותה לחלל התת עורי תוך הקפדה על כך שהמחט כולה תישאר מתחת לעור ולא תחדור דרכו. התאימו את המלקחיים כך שיחזיקו את העור סביב בסיס המחט. לאט להוציא פחות מ 50 מיקרוליטר של השעיית התא ולאשר את היווצרות של בליטה קטנה מתחת לעור באתר ההזרקה.

המשך הזרקה של עד 200 מיקרוליטר של תרחיף התא תת עורית. לאחר מכן מחזיקים את המלקחיים במקום ושומרים על המחט מקבילה לגוף העכבר, מושכים את המחט. לאחר הסרת המחט, החזיקו את העור סגור במלקחיים למשך מספר שניות כדי למנוע מהתאים לדלוף החוצה מפצע הניקוב.

לאחר ההשתלה, העבירו כל עכבר לכלוב חדש ואפשרו לבעל החיים להחלים באופן מלא מההרדמה לפני הוספת עכברים נוספים לכלוב. הנחת העכבר המתת חסד על גבו, להשתמש מספריים כירורגיים כדי לבצע חתך אנכי באורך של כשני סנטימטרים בעור. פתח את הצד הימני של העכבר ואתר את הטחול האדום הבוהק.

חותכים בעדינות את הטחול מהלבלב הוורוד ומעבירים אותו לצלחת פטרי סטרילית בגודל 10 ס"מ המכילה חמישה מיליליטר PBS סטרילי. מועכים את הטחול עם החלק העליון השטוח של בוכנה מזרק סטרילי. הניחו מסננת של 40 או 70 מיקרון על צינור חרוטי של 50 מיליליטר והכניסו אותה לחמישה מיליליטר PBS.

מעבירים את מתלה הטחול לתוך המסננת ומועכים אותו בעדינות. לשטוף את הכלים עם 10 מיליליטר של PBS ולהעביר את הכביסה למסננת. ממשיכים למעוך עד שלא נשאר צבע אדום על המסננת.

לאחר מכן סובבו את הצינור במהירות של 500 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והוציאו את הסופרנאטנט עם פיפטה שואפת לפני שתשהו מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של חיץ ליזה ACK שחומם מראש לטמפרטורת החדר כדי לבצע ליזה של תאי הדם האדומים בטמפרטורת החדר במשך ארבע דקות. להרוות את התגובה עם חמישה מיליליטר של מדיה התאית NIT-1 לכל חמישה מיליליטר של חיץ ליזה ולהעביר את תרחיף התא לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר דרך מסננת חדשה כדי להסיר גושים. סובבו את הצינור ב-500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא ב 20 מיליליטר של PBS לפני ספירת התאים. לאחר הספירה, סובבו את התאים ב 500 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השהה מחדש את גלולת התא ב- PBS סטרילי בצינור תגובה לנעילה בטוחה של 1.5 מיליליטר.

יש להזריק מיד או לאחסן את התאים על קרח למשך שעה לכל היותר. חממו את גופם של עכברי NOD SCID הבוגרים באמצעות מנורת חום למשך חמש עד 10 דקות כדי להרחיב את הוורידים. השהה מחדש את תמיסת הטחול לפני כל הזרקה.

עבור כל עכבר, ציירו 100 מיקרוליטר של תרחיף הטחול שחומם מראש לתוך המזרק, וודאו שאין בועות אוויר. לאחר מכן, הנח את העכבר במכשיר הריסון לפני שתלכוד את זנבו ביד הלא דומיננטית. אתר את אחד משני ורידי הזנב הרוחביים.

סובבו את הזנב בעדינות במידת הצורך. נגבו את הזנב במגבון חיטוי המכיל 70% אלכוהול איזופרופיל. בעזרת היד הדומיננטית, מחדירים את המחט בזווית חדה לאזור המרכזי של הזנב.

כאשר שיפוע המחט פונה כלפי מעלה, החלק את המחט כמה מילימטרים דרך העור. לאחר מכן להחיל לחץ עדין על המזרק כדי להזריק את השעיית הטחול. אין לאפשר למחט לנוע פנימה או החוצה בעת ההזרקה.

זריקות מוצלחות אינן גורמות ללחץ גב במהלך ההזרקה ומסומנות על ידי זרימת דם שקופה או לבנה מיד לאחר ההזרקה. לאחר ההזרקה, שחררו בעדינות את המחט מהווריד והפעילו לחץ קל על הזנב עם מגבון חיטוי עד שהדימום ייפסק. שחררו את העכבר מהתקן הריסון והעבירו אותו בעדינות לכלוב טרי.

לפחות חמש דקות לפני ההדמיה, להזריק את העכבר intraperitoneally עם המינון המתאים של פתרון D-luciferin באמצעות מזרק מיליליטר ומחט 26 מד. לאחר הכניסה לתוכנת ההדמיה, בלוח הבקרה, בחר אתחול. כדי לשמור אוטומטית את נתוני ההדמיה, לחץ על רכישה ואחריה שמירה אוטומטית אל וצור את התיקיות המתאימות במחשב.

לאחר שהמכשיר סיים לאתחל אותו, הגדר את זמן החשיפה לדקה. הניחו את העכבר על מכשיר ההדמיה במצב נוטה כשגפיו משורבבות וכיוונו את ראשו לתוך חרוט האף. שטח את העכבר בעדינות על ידי לחיצה על מרכז גבו בשתי ידיו ולאחר מכן פיזר את הידיים החוצה ובנפרד.

לאחר מכן בתוכנת ההדמיה, בחר לרכוש ולתעד את כל הפרטים הרלוונטיים של הניסוי בחלון הקופץ. בשניים מתוך שלושת העכברים שנחקרו, שתל הבקרה הושמד עד היום ה-18, כפי שניתן לראות מאובדן האותות הביולומינסנטיים המתאימים. בעכבר השני, לעומת זאת, השתל המוטנטי הושמד בעוד ששתל הבקרה שרד, מה שמדגיש את השונות הביולוגית בין בעלי החיים.

האות הביולומינסנטי כומת והישרדות השתל דווחה כאחוז האות הביולומינסנטי השיורי בהשוואה לאות בנקודת הזמן הראשונה. היחס בין אותות זוהרים מהשתל המוטנטי לשתל הבקרה של כל עכבר שימש כדי להמחיש את השונות בין בעלי חיים. לפני העברת המחלה, התאים המושתלים עשויים להשתכפל וכתוצאה מכך השתלים המורחבים נראים דרך העור.

לאחר ההדמיה, שתלים אלה הציגו אותות ביולומינסנטיים רוויים שלא ניתן היה לכמת במדויק. ניתן לבודד שתלים בנקודות זמן שונות לצורך אפיון תאי החיסון החודרים על ידי, למשל, ציטומטריית זרימה כדי לחקור את מנגנוני ההתקפה האוטואימונית וההגנה מפני השתלים.