Name: ניטור תגובות איתות ממוקדות בדגי זברה זחלים - Z-REX חושף מנגנונים מדויקים של תרופות אלקטרופיליות ומטבוליטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: למדו את שיטת Z-REX לניטור תגובות איתות ממוקדות בזחלי דגי זברה. גלו כיצד ליגנדים תגובתיים משפיעים על תאי חיסון ומספקים תובנות לטיפול בסרטן השד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון: Novartis FreeNovation, NCCR ו-EPFL.

<ol><li>Long, M. J. C., Ly, P., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+harnessing+non-enzymatic+post-translational+modifications+for+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A primer on harnessing non-enzymatic post-translational modifications for drug design.</a> RSC Medicinal Chemistry. 12 (11), 1797-1807 (2021).</li>
<li>Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+signaling+by+reactive+electrophiles+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Redox signaling by reactive electrophiles and oxidants.</a> Chemical Reviews. 118 (18), 8798-8888 (2018).</li>
<li>Parvez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REX+on-demand+redox+targeting+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">T-REX on-demand redox targeting in live cells.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2328-2356 (2016).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+electrophile+tagging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Precision electrophile tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 57 (2), 216-220 (2018).</li>
<li>Van Hall-Beauvais, A., Zhao, Y., Urul, D. A., Long, M. J. C., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-protein-specific+redox+targeting+in+live+mammalian+cells+and+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-protein-specific redox targeting in live mammalian cells and C. elegans.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 10 (3), 43(2018).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt3+is+a+privileged+first+responder+in+isozyme-specific+electrophile+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Akt3 is a privileged first responder in isozyme-specific electrophile response.</a> Nature Chemical Biology. 13 (3), 333-338 (2017).</li>
<li>Poganik, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wdr1+and+cofilin+are+necessary+mediators+of+immune-cell-specific+apoptosis+triggered+by+Tecfidera%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wdr1 and cofilin are necessary mediators of immune-cell-specific apoptosis triggered by Tecfidera.</a> Nature Communications. 12 (1), 5736(2021).</li>
<li>Lin, H. -Y., Haegele, J. A., Disare, M. T., Lin, Q., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalizable+platform+for+interrogating+target-+and+signal-specific+consequences+of+electrophilic+modifications+in+redox-dependent+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A generalizable platform for interrogating target- and signal-specific consequences of electrophilic modifications in redox-dependent cell signaling.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (19), 6232-6244 (2015).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1-null+mutation+leads+to+postnatal+lethality+due+to+constitutive+Nrf2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation.</a> Nature Genetics. 35 (3), 238-245 (2003).</li>
<li>Huang, K. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z-REX%3A+Shepherding+reactive+electrophiles+to+specific+proteins+expressed+either+tissue-specifically+or+ubiquitously%2C+and+recording+the+resultant+functional+electrophile-induced+redox+responses+in+larval+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Z-REX: Shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed either tissue-specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish.</a> Nature Protocols. , (2023).</li>
<li>Long, M. J. C., Assari, M., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+sight%3A+The+issue+of+hidden+variables%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain sight: The issue of hidden variables.</a> ACS Chemical Biology. 17 (6), 1285-1292 (2022).</li>
</ol>

מעכבי קינאז של מולקולות קטנות ספציפיות לאיזופורם, שגילוים התאפשר על ידי טכנולוגיות REX, הוגשו לבקשת פטנט

Z-REX המתואר בפרוטוקול זה מדגים אסטרטגיה איתנה לחקירת זוגות מטרות אלקטרופיליות ולאיתות על פירוק מסלול בדגים חיים. ההעברה מכוונת הקרבה מאפשרת מינון ובקרה מרחבית של הטיפול בתרכובת האלקטרופילית. בניגוד לשיטות מינון בולוס קונבנציונליות, שבהן הריכוזים העל-פיזיולוגיים של אלקטרופילים שנפרסו מובילים לעתים קרובות לבעיות מחוץ למטרה, הכמות הקטנה יחסית של אלקטרופיל המשתחררת למערכת הופכת את Z-REX לבלתי פולשני במידה רבה. השתמשנו ב-0.1-6 מיקרומטר Ht-PreHNE (אלקין) בעוברים של דגי זברה, והתוצאות הראו שהטיפול אינו מזיק להתפתחות העובר11.
הליך Z-REX הוא בדרך כלל ארוך יותר מאשר T-REX, טכניקה לסינון/מחקר חלבונים בעלי חישה אלקטרופילית בתאים בתרבית. נניח שמטרת הניסוי היא לסנן אינטראקציות אלקטרופילים-מטרה; אנו מציעים תחילה לבצע סינון מקיף על ידי T-REX בתאים בתרבית ולהשתמש ב- Z-REX לאימות in vivo וניתוח פנוטיפי/מסלולי. בהשוואה לתרבית תאים, הדרישות לביצוע Z-REX הן טכניקות בסיסיות לגידול דגים בנוסף למיומנויות ניסוי ביוכימיות הנדרשות על ידי T-REX. מסגרת זמן טיפוסית עבור Z-REX (מחציית דגים ועד להעברת אלקטרופילים המושרים באור) היא 2-3 ימים, שהם לא יותר מיום אחד יותר מהזמן הטיפוסי לניסוי T-REX בתאים חיים נגועים. הדמיה חיה לניתוח פנוטיפי יכולה להתבצע 2-10 שעות לאחר תאורת אור; צימוד קליקים עם ביוטין-אזיד לבדיקה נפתחת אורך 3 ימים; qRT-PCR להערכת תגובת תמלול לוקח 3 ימים; אם הצביעה נמשכת 5 ימים. צעדים אלה דומים פחות או יותר למקביליהם בתרביות תאים, אם כי פירוש הנתונים דורש הבנה של הפיזיולוגיה של הדגים וזני המדווחים.
כפרוצדורה מרובת משתנים12, מספר קבוצות ביקורת נחוצות כדי ש-Z-REX לא יכלול אי-ודאות בתוצאות (איור 1D). קבוצות בקרה נפוצות הן: (1) DMSO/טיפול ברכב בלבד; (2) טיפול בדיקה, אך ללא תאורת אור; (3) תאורת אור, אך ללא טיפול בדיקה; (4) מבנה מפוצל P2A, שבו הילה ונקודת העניין מבוטאות בנפרד, כך שמסירת הקרבה היא אבלאט; ו-(5) מוטנטים היפומורפיים, ששאריות החישה האלקטרופילית שלהם הן/הן מוטציות, כגון Akt3 (C119S)6 ו-Keap1 (C151S, C273W, C288E)5, שבהם השתמשנו במחקרים קודמים.
אם בדיקות במורד הזרם כוללות ניתוח כתמים מערביים, יש לבצע deyolking לפני הקציר. חלבוני החלמון מפחיתים את הנאמנות של הערכות ריכוז הליזט ועשויים להיקשר באופן לא ספציפי לנוגדנים. בעת ביצוע הדמיית דגים חיים או צביעת IF בהרכבה מלאה, ראינו גם אותות פלואורסצנטיים לא ספציפיים בשק החלמון, ככל הנראה כתוצאה מחלבונים אוטופלואורסצנטיים בשק החלמון, או קשירה לא ספציפית של הנוגדנים עצמם. אם האות האוטופלואורסצנטי מפריע לאות, אנו מציעים להוציא את שק החלמון מכימות או לכמת אזורים שונים בנפרד. דכורינציה נחוצה להדמיית דגים חיים ולבדיקת צביעת IF בהרכבה מלאה. הכוריון יכול להפריע להדמיה, ובהמשך לכימות / ספירת תאים. עם זאת, dechorination חל רק על עוברים מעל 1 dpf; עוברים צעירים יותר בשלבי פיצוץ/גסטרולציה/סגמנטציה הם שבירים מכדי לעבור דה-כוריון.
פרוטוקול Z-REX המתואר כאן מבוסס על ביטוי POI חוץ רחמי מונחה mRNA. ההליך מהיר בהשוואה לשימוש / יצירת קווי דגים טרנסגניים. ביטוי מונחה mRNA נמצא בכל מקום וחולף, ונמשך לפחות יומיים עבור mRNA המשמשים בפרוטוקול זה. עם זאת, משך הביטוי עשוי להשתנות במקרים אחרים. לפיכך, גישה זו מספקת חלון חקירה מהיר וגלובלי יותר להשפעות של אירוע ספציפי של תיוג אלקטרופילים, התואם למספר מבדקים בעלי תפוקה גבוהה/תוכן גבוה. קווים טרנסגניים עם ביטוי Halo-POI יציב ברקמות ספציפיות תואמים גם ל-Z-REX11. קווים כאלה משמשים בצורה הטובה ביותר כאשר יש צורך לשאול שאלה מדויקת יותר, למשל, כאשר פנוטיפ באיבר מסוים נחזה מנתוני תרבית תאים, או כאשר סינון מניסויים בהזרקת mRNA מנבא שאיבר מסוים רגיש לאירוע תיוג אלקטרופילים. השראת תגובה נוגדת חמצון ספציפית ללב באמצעות Z-REX הודגמה באמצעות דגי Tg (gstp1:GFP;DsRed-P2A-myl7:Halo-TeV-Keap1) בפרסום הקודם שלנו11. ייתכן שניתן יהיה גם לבצע Z-REX על דגים טרנסגניים מעל 2 dpf.

מספר עצום של אירועי איתות תאי כרוכים בתגובות בין מולקולות תגובתיות קטנות (המיוצרות אנדוגניות בתא או קסנוביוטים/קסנומטבוליטים, כגון תרופות) לבין מטרת החלבון שלהן. במקרים רבים, רמה סובסטויכיומטרית של אירועי קישור קוולנטיים כאלה יכולה לעורר תגובות תאיות, המובילות לשינויים בהתפתחות, חילוף חומרים, אפופטוזיס ו/או תגובה חיסונית1. עם זאת, פירוק אופן הפעולה (MOA) על ידי קישור אירועים מחייבים ספציפיים לתוצאותיהם הפנוטיפיות הוכח כמאתגר. שיטות מינון בולוס מסורתיות הכוללות הכנסת ריכוזים גבוהים של המינים הריאקטיביים גורמות לעתים קרובות לשינוי מספר רב של חלבונים, כמו גם רעילות מוגזמת לאורגניזם המודל2. תנאים כאלה רחוקים מלהיות אידיאליים. פותחה שיטה לפתרון בעיות אלה בתרביות תאים באמצעות העברה אלקטרופילית מקומית מדויקת בהקשר תאי מקורי, בשם T-REX (אלקטרופילים ומחמצנים תגובתיים הניתנים למטרה)3. בשנים שחלפו, המוקד עבר לניסויים באורגניזמים שלמים, המאפשרים הזדמנות לחקור חלבונים בהקשרים תאיים ספציפיים בתאים שלא עברו טרנספורמציה. לכן, הרחבנו את הטכניקה כך שתתאים למספר מודלים, כולל מודלים עובריים של Danio rerio . כאן אנו מציגים Z-REX (דגי זברה המכוונים לאלקטרופילים ומחמצנים תגובתיים) (איור 1).
כדי להבין את Z-REX, מאמר זה מציג תחילה את טכנולוגיות REX ואת המושגים העומדים בבסיסן. בבסיסן, טכניקות אלה מדגימות איתות של מינים אלקטרופיליים תגובתיים פיזיולוגיים אנדוגניים (RES) על ידי חיקוי האופן שבו אלקטרופילים טבעיים מיוצרים באופן מקומי in vivo בדיוק מרחבי-זמני. חלבון העניין (POI) מבוטא כמבנה היתוך להילה; האחרון מעגן את הגשושית החדירה לרקמות והאינרטית הנושאת את RES הפוטוכלוב בסטואיכיומטריה של 1:1. RES אנדוגני אחד כזה הוא 4-hydroxynonenal (HNE להלן), אשר photocaged בבדיקה Ht-PreHNE. במקרים רבים, אנו משתמשים בגרסה מתפקדת אלקין של HNE [כלומר, HNE(אלקין)], שיש לה תכונות ביולוגיות זהות במהותן ל-HNE, אך ניתן לתייג אותה באמצעות כימיית קליקים. הגשושית, שמתפקדת גם עם כלורואלקן לתגובתיות עם Halo, מכונה Ht-PreHNE (אלקין). הקומפלקס של היתוך Halo-POI והגשושית שנוצרה כך מאפשר העברה פרוקסימלית של RES לנקודת העניין המאוחה עם הקרנה עם אור UV. אם נקודת העניין מגיבה במהירות עם RES המשוחרר, התיוג הקוולנטי המתקבל של נקודת העניין עם RES מאפשר לנו לזהות ציסטאין מיוחס מבחינה קינטית .
Z-REX לוקח את היתרונות הנ"ל של טכנולוגיות REX ומיישם אותם באופן נרחב כדי לחקור מסלולי איתות ספציפיים בדגים חיים. פרוטוקול זה הותאם לדגי זברה (D. rerio), מכיוון שהם אורגניזמים בעלי חוליות הניתנים למשיכה גנטית ושקופים במהלך ההתפתחות, ולכן אידיאליים לטכניקות אופטו-כימיות/גנטיות כמו טכנולוגיות REX. אף על פי כן, אסטרטגיה דומה עשויה לעבוד היטב גם על מיני דגים אחרים הניתנים למשיכה גנטית, שכן הישימות הרחבה של השיטה נובעת מהמנגנון הפסאודו-תוך-מולקולרי של העברת אלקטרופילים שמקורם בשומנים (LDE). אכן, ההליך תואם ביולוגית מאוד, שכן ניתן לטפל בדגים עם אלקטרופיל פוטו-רקס Z-REX [למשל, Ht-PreHNE (אלקין)] במשך 48 שעות לפחות ללא השפעות ניכרות על ההתפתחות. פרוטוקול דומה פועל ב- C. elegans 4,5.
הפרוטוקול מתאר תחילה את השימוש בהזרקת mRNA כדי לייצר ביטוי חולף של מבנה היתוך Halo-POI שאינו יליד במודלים של דגי זברה עובריים, 1-1.5 ימים לאחר ההפריה (dpf). התוצאה היא ביטוי של החלבון החוץ רחמי ברוב התאים בתוך הדג (להלן "בכל מקום"), ולא ברקמות או באזורים ספציפיים; עם זאת, הנתונים מראים כי השפעות ספציפיות לתא ניתן לראות במקרים מסוימים. לאחר ההזרקה, העוברים מודגרים עם ריכוז נמוך [0.3-5 מיקרומטר Ht-PreHNE (אלקין)] של הבדיקה עד 30.5 שעות לאחר ההפריה (hpf). לאחר מכן, בזמן שנקבע על ידי המשתמש, משלוח של RES לנקודת העניין בתוך דגים מושגת על ידי דיקור במשך 2-5 דקות. לאחר דיקור ה-RES, ניתן לבצע מגוון בדיקות פנוטיפיות במורד הזרם במהלך 2-10 השעות הבאות: 1) הדמיה חיה של קווי כתב (איור 2A); 2) הערכת סימון מטרות על ידי ניתוח כתמים מערביים (איור 3); 3) ניתוח תעתיק (איור 4); או 4) אימונופלואורסנציה של הר שלם (איור 5).
כדוגמה להדמיה חיה של קווי כתבים, Z-REX מודגם יחד עם הדמיה חיה של קווי דגים, Tg (lyz:TagRFP) ו-Tg (mpeg1:eGFP), כדי למדוד כיצד שינוי RES של נקודת עניין ספציפית של חיישן אלקטרופיל (כלומר Keap1) מפחית את רמות הנויטרופילים והמקרופאגים, בהתאמה, ללא השפעות נצפות על תאים אחרים בדגים. עם זאת, הראינו בעבר שניתן לשחזר את תיוג נקודות העניין ואת איתות המסלול התוצאתי ממחקרי T-REX באמצעות Z-REX עבור מספר חלבונים: Akt3 6, Keap17 ו- Ube2v26. בסך הכל, עם Z-REX, מדענים יכולים לחקור את ההשלכות של שינוי קוולנטי של נקודות עניין על ידי RES בהקשר של מספר מסלולי חמצון-חיזור מורכבים. טכניקה זו נועדה לאתר מטרות ואת השאריות הפונקציונליות שלהן עבור תכנון תרופות קוולנטיות ומנגנוני תרופות חדשניים במודל רלוונטי יותר להקשר של בעלי חיים שלמים.

<table><tbody><tr><td>2-מרקפטואתנול (BME)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ צלחות פטרי</td><td>Celltreat</td><td>229692</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>30% תמיסת אקרילאמיד וביס-אקרילאמיד</td><td>BioRad</td><td>1610154</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>Celltreat</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>פישר</td><td>A/0600/15</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>GoldBio</td><td>A201-100</td><td></td></tr><tr><td>כל תקני החלבון המוכתמים הכחולים</td><td>BioRad</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>סיגמא</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין-dPEG11-אזיד</td><td>Quanta Biodesign</td><td>102856-142</td><td></td></tr><tr><td>ברדפורד צבע</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>פישר</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימיים</td><td>VWR</td><td>HARV30-00200</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>Supelco, Inc</td><td>1.02445.1000</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, מעכב פרוטאז ללא EDTA קוקטייל</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Cu(TBTA)</td><td>Lumiprobe</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד עכבר-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150107</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150075</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>חמור נגד חולדות-AlexaFluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175475</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>מצע ECL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>מצע ECL-Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>מסובב מקצה לקצה</td><td>FinePCR</td><td>Rotator AG</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>חולץ</td> <td>מיקרופיפטה בוער/חוםסאטר אינסטרומנט ושות'</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים (בוטה)</td> <td>מתוצרת עצמית מתוצרת</td><td></td><td>עצמית על ידי קהות מלקחיים חדים (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40)</td></tr><tr><td>מלקחיים (חדים)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont #5, 11252-40</td><td></td></tr><tr><td>קצה טעינת ג'ל</td><td>פישר</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת ג'ל/כתם</td><td>Vilber</td><td>Fusion FX imager</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית</td><td>Sigma</td><td>45-G1145</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומטר שלב זכוכית</td><td>Meiji Techno.</td><td>MA285</td><td></td></tr><tr><td>מושבת בחום FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>אמבטיה אולטרסאונד מחוממת</td><td>VWR</td><td>89375-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין בעל קיבולת גבוהה אגרוז</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Ht-PreHNE אלקין בדיקה</td><td>מתוצרת</td> <td>עצמית-</td><td>פרבז, ס. ואחרים. T-REX מיקוד חמצון חיזור לפי דרישה בתאים חיים. נט פרוטוק. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>לוחית הדמיה (10% מאגר HBSS, לעוברים חיים)</td><td></td><td></td><td>מיוצרת עם צלחת פטרי, ו-2% אגרוז ב-10% מאגר HBSS</td></tr><tr><td>לוחית הדמיה (PBS, לעוברים קבועים בפורמלדהיד)</td><td></td><td></td><td>עשויה עם צלחת פטרי, ו-2% אגרוז</td></tr><tr><td>בצלחת</td><td></td><td></td> הזרקת PBS <td>מיוצרת עם תבנית מיקרו-הזרקה, צלחת פטרי ו-2% אגרוז ב-10% מאגר HBSS</td></tr><tr><td>LDS</td><td>Apollo</td><td>APOBI3331</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>עובש מיקרו-הזרקה</td><td>כלי מדע אדפטיבי</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>טיפים מיקרו-מעמיס</td><td>אפנדורף</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ למיקרו-הזרקה</td><td>אולימפוס</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מקור אור</td><td>אולימפוס</td><td>&nbsp;KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 ערכת תמלול</td><td>אמביון</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי &בטא;-אקטין-HRP</td><td>Sigma</td><td>A3854</td><td>1:20000 (WB)</td></tr> <tr><td>עכבר נגד HaloTag</td><td>Promega</td><td>G921A</td><td>1:500 (IF)</td></tr> <tr><td>קורא רב-מצבי</td><td>BioTek Instruments</td><td>Cytation 5</td><td></td></tr><tr><td>מנגנון אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז חומצת גרעין</td><td>Biorad</td><td>Mini-Sub Cell GT Systems</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)20</td><td>טכנולוגיות DNA</td><td>משולבות מותאמות אישית: (dT)20</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA&nbsp;</td><td>שיבוט עצמי-זמין</td><td></td> <td>מקבוצתו של פרופ' יימון AYE ב-EPFL</td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA</td><td></td> <td>שיבוט עצמי-זמין</td> <td>מקבוצתו של פרופ' יימון AYE ב-EPFL</td></tr><tr><td>Pneumatic PicoPump</td><td>WPI</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>ציוד אלקטרופורזה לחלבון ומספק</td><td>Biorad</td><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit אנטי-אקטיבי Caspase-3</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>559565</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>חולדה נגד HA-HRP</td><td>Sigma</td><td>H3663</td><td>1:500 (IF ו-WB)</td></tr><tr><td>חולדה נגד RFP</td><td>ChromoTek</td><td>5F8</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT מעכב ריבונוקלאז רקומביננטי ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap פתרון</td> <td>טיהור RNAThermoFisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>שייקר נדנדה</td><td>DLAB</td><td>SK-R1807-S</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Teknova</td><td>S9974</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III טרנסקריפטאז הפוך</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>t-בוטנול</td><td>סיגמא</td><td>471712</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>זהב ביוטכנולוגיה</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>TeV פרוטאז (S219V)</td> <td>מתוצרת</td><td></td> <td>עצמית-Parvez, S. et al. T-REX מיקוד חמצון חיזור לפי דרישה בתאים חיים. נט פרוטוק. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Tg(lyz:TagRFP)</td><td>מרכז המשאבים הבינלאומי של דג הזברה (ZIRC)</td><td>uwm11Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1:eGFP)</td><td>מרכז המשאבים הבינלאומי של דג הזברה (ZIRC)</td><td>gl22Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>ציקלר תרמי</td><td>Analytik Jana</td><td>846-x-070-280</td><td></td></tr><tr><td>TMEDA</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>צנרת העברה</td><td>פישר</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Apollo</td><td>APOBI2888</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol ריאגנט</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין מבית Glycine max (פולי סויה)</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>מנורת UV עם אור 365 ננומטר</td><td>Spectroline</td><td>ENF 240C</td><td></td></tr><tr><td>מד UV&nbsp;</td><td>ספקטרוליין</td><td>XS-365</td><td></td></tr><tr><td>וורטקסר</td><td>תעשיות מדעיות, בע"מ</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Western Blotting Transfer ציוד ואספקה</td><td>Biorad</td><td>Mini Trans-Blot או Criterion Blotter&nbsp;</td><td></td></tr><tr>ציוד <td></td><td></td><td>גידול וגידול דגי זברה</td><td>בבית</td></tr><tr><td>חרוזי זירקוניה</td><td>BioSpec</td><td>11079107zx</td><td></td></tr></tbody></table>

ניטור תגובות איתות ממוקדות בדגי זברה זחלים - z-rex חושף מנגנונים מדויקים של תרופות אלקטרופיליות ומטבוליטים

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

מטבוליטים תגובתיים ותרופות אלקטרופיליות קשורות הם בין המולקולות הקטנות המאתגרות ביותר למחקר. גישות קונבנציונליות לפירוק אופן הפעולה (MOA) של מולקולות כאלה ממנפות טיפול בתפזורת בדגימות ניסיוניות עם עודף של מין תגובתי מסוים. בגישה זו, התגובתיות הגבוהה של אלקטרופילים הופכת את התיוג של הפרוטאום ללא הבחנה באופן תלוי זמן והקשר; חלבונים ותהליכים רגישים לחמצון-חיזור יכולים גם להיות מושפעים בעקיפין ולעתים קרובות באופן בלתי הפיך. על רקע כזה של אינספור מטרות פוטנציאליות והשפעות משניות עקיפות, קישור פנוטיפ למעורבות מטרה ספציפית נותר משימה מורכבת. דגי זברה המכוונים לאלקטרופילים ומחמצנים תגובתיים (Z-REX) - פלטפורמת משלוח אלקטרופילים תגובתית לפי דרישה המותאמת לשימוש בדגי זברה זחלים - מתוכננת לספק אלקטרופילים לחלבון ספציפי בעל עניין (POI) בעוברי דגים חיים שאינם מוטרדים בדרך אחרת. המאפיינים העיקריים של טכניקה זו כוללים רמה נמוכה של פולשניות, יחד עם מתן אלקטרופילים מדויקים במינון, כימוטיפ וספיקת אלקטרופילים מבוקרת מרחבית. לפיכך, בשילוב עם חבילה ייחודית של בקרות, טכניקה זו עוקפת השפעות מחוץ למטרה ורעילות מערכתית, שנצפתה אחרת בעקבות חשיפה בלתי מבוקרת בתפזורת של בעלי חיים לאלקטרופילים תגובתיים ולתרופות אלקטרופיליות פליוטרופיות. באמצעות מינוף Z-REX, חוקרים יכולים לבסס דריסת רגל בהבנה כיצד תגובות לחץ אינדיבידואליות ותפוקות איתות משתנות כתוצאה ממעורבות ליגנד תגובתי ספציפי עם נקודת עניין ספציפית, בתנאים כמעט פיזיולוגיים בבעלי חיים שלמים.

הדמיה חיה של דגי נויטרופילים/מקרופאגים טרנסגניים שטופלו ב-Z-REX, Tg (lyz:TagRFP) ו-Tg (mpeg1:EGFP). אינדוקציה של אפופטוזיס נויטרופילים/מקרופאגים באמצעות Keap1 HNEylation. (ראו גם איור 2). ההשפעה של סימון אלקטרופילים של Keap1 על רמות נויטרופילים ומקרופאגים הוערכה על ידי הזרקת עוברים טרנסגניים הטרוזיגוטיים שמקורם ב- Tg (lyz:TagRFP) או Tg (mpeg1:EGFP) עם mRNA המקודד Halo-Keap1, ולאחר מכן טיפול ב- Ht-PreHNE (אלקין). בעקבות ההליכים לבדיקת שלב 6.1 במורד הזרם, אפשרות 1-HNE (אלקין) שוחררה ו- Keap1 סומן. רמות נויטרופילים ומקרופאגים הוערכו על ידי הדמיה חיה של קווי כתבים, Tg (lyz:TagRFP) ו- Tg (mpeg1:eGFP), בהתאמה. רמתם של שני סוגי התאים ירדה ב-30%-40% לאחר טיפול Z-REX, שבו HNE הועבר ל-Keap1. להיפך, לא נצפה אובדן של נויטרופילים או מקרופאגים בקבוצות הבקרה הטכניות של Z-REX [ללא אור ו-Ht-PreHNE (אלקין), אור בלבד, או Ht-PreHNE (אלקין) בלבד] (איור 1D ואיור 2A-D).
השראת אפופטוזיס נויטרופילים/מקרופאגים הצביעה על העברת HNE מוצלחת ל-Keap1 דרך Z-REX. פורסמו פרטים על ניתוח המסלול ומנגנון אפופטוזיס5. כדי להסביר השפעות מחוץ למטרה של HNE (אלקין), נעשה שימוש במספר בקרות. (1) באותם תנאי ניסוי, במקום ה-mRNA Halo-TeV-Keap1, הוזרקו לעוברים ה-mRNA Halo-P2A-Keap1. מקשר P2A איפשר לחלבוני Halo ו-Keap1 להתבטא באופן עצמאי. בתרחיש זה, HNE(אלקין) ששוחרר מ-Halo לא יכול היה לתייג את Keap1, מכיוון שהוא כבר לא היה קרוב ל-Halo (איור 1D); לפיכך, מסלול איתות אפופטוזיס לא הופעל. בקבוצה זו לא נצפו שינויים ברמות המקרופאגים או הנויטרופילים (איור 2A,B). (2) אותם תנאי ניסוי בוצעו באמצעות mRNA המקודד Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E), מוטציה של Keap1 שאינה מגיבה ל-HNE (אלקין) (איור 1D). לא נצפו שינויים ברמות המקרופאגים או הנויטרופילים (איור 2G,H).
צימוד ביוטין אזיד-קליק ובדיקת ביוטין נפתחת. הערכת תיוג יעדים. (ראו גם איור 3). הערכת תיוג המטרה בוצעה באמצעות עוברי WT, שהוזרקו להם mRNA המקודד Halo-TeV-Keap1-2xHA (מבנה היתוך Halo-POI) או Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA (מבנה מפוצל P2A, שבו Halo ו-Keap1 אינם מתמזגים; איור 1D). חלבון Keap1 שכותרתו נמשך מטה רק בקבוצה המבטאת חלבון היתוך וטופל ב-Z-REX (נתיב שני בכתם האנטי-HA העליון), אך לא בקבוצות ביקורת אחרות (ללא הזרקת mRNA, מבנה היתוך ללא Z-REX, או מבנה מפוצל P2A). התוצאות מצביעות על כך שה-HNE(אלקין) הועבר בהצלחה ל-Keap1, וה-Keap1 שעבר שינוי צומד לאחר מכן לביוטין באמצעות תגובת קליק, וה-Keap1 שכותרתו ביוטין נמשך מטה על ידי שרף סטרפטאבידין.
ניתוח תמלול. RNA-seq ו- qRT-PCR. (ראו גם איור 4). שינוי השעתוק לאחר טיפול Z-REX הוערך על ידי RNA-seq ו- qRT-PCR. ב-RNA-seq, מספר גנים הקשורים למערכת החיסון עברו ירידה ברגולציה לאחר Z-REX. לעומת זאת, גנים רבים הקשורים לתגובה נוגדת חמצון (AR) היו מווסתים לאחר Z-REX, כתוצאה מהשראת מסלול Keap1-Nrf2-AR על HNEylation על Keap110 (איור 4A). בניתוח qRT-PCR נמצאו תוצאות דומות בעת ניתוח שלושה גנים הקשורים למערכת החיסון (lyz, mpeg1.1 ו-coro1a) (איור 4B). הרגולציה למעלה ולמטה של הגנים בהתאמה הראתה השראות מוצלחות של מסלולים בתיווך Keap1 HNEylation.
בדיקת צביעת אימונופלואורסנציה מלאה (co-)וניתוח קולוקליזציה. (ראו גם איור 5). הביטוי האקסוגני Halo-TeV-Keap1-2xHA וביטוי Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA הוערכו על-ידי צביעה של אימונופלואורסנציה (IF) בהר שלם (איור 5A,B). למבנה המפוצל P2A היה מספר גדול פי שניים של תגי HA מאשר למבנה TeV-fusion, אשר מתאים לאות אנטי-HA גבוה פי שניים בקבוצה P2A-split-construct-mRNA המוזרקת מאשר הקבוצה השנייה, מה שמצביע על כך שרמת הביטוי של שני המבנים הייתה דומה (איור 5C). רמות הביטוי של Halo-TeV-Keap1 (wt) ו-Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E) נמצאו דומות גם כאשר חיטטו עם אנטי-הילה (איור 5D,E). קולוקליזציה של נויטרופילים וקספז פעיל 3 ב-Tg שטופל ב-Z-REX (lyz:TagRFP) נצפתה על-ידי שיתוף אימונוסטיין עם אנטי-RFP ואנטי-אקטיבי-קספז 3 (איור 5F). קספז פעיל 3 הוא אינדיקטור לאירועי אפופטוזיס.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig01.jpg"> איור 1: זרימת עבודה של Z-REX. (A,B) לעובר דג זברה בשלב התא 1-4 מוזרק mRNA המקודד Halo-POI (למשל, Halo-Keap1). עוברים מוזרקים מטופלים לאחר מכן באמצעות בדיקה המורכבת מליגנד HaloTag ואלקטרופיל בכלוב פוטו-כלוב המצורף לקבוצה פונקציונלית אלקין, כגון Ht-PreHNE (אלקין) ב-B. לאחר הסרת הכמות העודפת של הגשוש, העובר נחשף לאור כדי לשחרר את האלקטרופיל המעניין [למשל, HNE או האנלוגי שלו, HNE (אלקין)]. הניתוח במורד הזרם מתבצע בנקודת זמן נתונה/מוגדרת על ידי המשתמש. (C) תכנון ומנגנון של הגשושית Ht-PreLDE, אשר ישימה לאלקטרופילים שונים שמקורם בשומנים (LDE). (D) קבוצות בקרה שליליות/טכניות עבור Z-REX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig02.jpg"> איור 2: הדמיה חיה של דגי נויטרופילים/מקרופאגים טרנסגניים שנחשפו ל-Z-REX. Z-REX-mediated Keap1 HNEylation גורם אפופטוזיס נויטרופילים/מקרופאגים. (A) תמונות מייצגות של דגי Tg (lyz:TagRFP ) המבטאים Halo-TeV-Keap1 (מבנה היתוך) או Halo-P2A-Keap1 (מבנה מפוצל), ונתונים לתנאי בקרה שליליים [ללא טיפול, אור בלבד, או Ht-PreHNE (אלקין) בלבד או Z-REX]. גיל העובר: 36 כ"ס. (B) כימות רמות נויטרופילים ב-A. (C) תמונות מייצגות של דגי Tg(mpeg1:eGFP) המבטאים את Halo-TeV-Keap1 עם או בלי טיפול Z-REX. גיל העובר: 34 כ"ס. (D) כימות רמות המקרופאגים ב-C. (ה,ו) מדידת מסלול זמן של (E) נויטרופילים ו-(F) רמות מקרופאגים לאחר טיפול ב-Z-REX. (G) ניסוי דומה כמו ב-A בדגים המבטאים Halo-TeV-Keap1 (WT) או Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E), מוטנט שאין לו יכולת חישת HNE. (H) כימות רמות נויטרופילים ב-G. פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר. כל הגרפים מוצגים עם ממוצע ± SEM. ערכי p חושבו באמצעות מבחן ANOVA חד-כיווני (כחול) ומבחן t של סטודנט דו-זנבי (שחור). נתון זה שונה מ- Poganik et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig03.jpg"> איור 3: בדיקת משיכת ביוטין. עוברי WT המבטאים Halo-TeV-Keap1-2XHA או Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA טופלו ב-Z-REX או בתנאי בקרה שליליים מתאימים (ללא טיפול בדיקה במקרה זה). לאחר הקציר, עוברים עברו ליזה וטופלו בפרוטאז TeV לפני בדיקת משיכת הביוטין. התוצאות נותחו על ידי Western Blotting. נתון זה שונה מהואנג ואחרים. Z-REX: רעיית אלקטרופילים תגובתיים לחלבונים ספציפיים המבוטאים באופן ספציפי לרקמות או בכל מקום, ורישום תגובות חמצון-חיזור תפקודיות המושרות על ידי אלקטרופילים בדגי זחל. נתון זה שונה מהואנג ואחרים.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig04.jpg"> איור 4: ניתוח שעתוק. (A) תוצאות RNA-seq של עוברים שטופלו ב-Z-REX לעומת עוברים שלא טופלו. גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי מובהק סטטיסטית (SDE) מודגשים. גנים הקשורים למערכת החיסון SDE צבועים באדום. גנים הקשורים לתגובה נוגדת חמצון (AR) צבועים בירוק. גנים אחרים של SDE צבועים בכחול. כל ערכי p חושבו באמצעות CuffDiff. (ב-ד) שלושה גנים הקשורים למערכת החיסון SDE מ-A: (B) lyz, (C) mpeg1.1 ו-(D) coro1a נותחו עוד יותר עם qRT-PCR, ורק העוברים שטופלו ב-Z-REX הראו דיכוי של תעתיקים אלה. כל הגרפים מוצגים עם ממוצע ± SEM. ערכי p חושבו באמצעות מבחן ANOVA חד-כיווני (כחול) ומבחן t של סטודנט דו-זנבי (שחור). נתון זה שונה מ- Poganik et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig05.jpg"> איור 5: בדיקת צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה מלאה . (A,B) תמונות מייצגות של עוברים המבטאים (A) Halo-TeV-Keap1-2xHA או (B) Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA המוכתמים עם אנטי-HA ונוגדן משני מצומד עם AlexaFluor568. דגים שהוזרקו באמצעות mRNA הושוו לדגים שלא הוזרקו לפי גילם. (C) כימות אות אנטי-HA ב-(A,B). (D) תמונות מייצגות של עוברים המבטאים Halo-TeV-Keap1 (WT) או Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) המוכתמים במערכת החיסון עם נוגדן אנטי-Halo ונוגדן משני מצומד עם AlexaFluor647. דגים שהוזרקו באמצעות mRNA הושוו לדגים שלא הוזרקו לפי גילם. (E) כימות אות אנטי-הילה ב-D. ערכי p חושבו באמצעות מבחן t דו-זנבי של סטודנט. (ו) עוברי Tg (lyz:TagRFP) שנחשפו ל-Z-REX עברו חיסון משותף עם נוגדנים אנטי-RFP ואנטי-אקטיביים קספז 3, ונוגדנים משניים מצומדים פלואורופורים בהתאמה. התיבה הלבנה מסמנת את האזור המוגדל. חיצים לבנים מצביעים על קולוקליזציה של נויטרופילים וקספז פעיל 3. פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר. כל הגרפים מוצגים עם ממוצע ± SEM. נתון זה שונה מ- Poganik et al.7. והואנג ואחרים.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה משלימה 1: רשימת המאגרים ששימשו במחקר זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

דגי זברה המכוונים לאלקטרופילים ומחמצנים תגובתיים (Z-REX) היא שיטה מבוססת ביולוגיה כימית לחקר איתות תגובתי של מולקולות קטנות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על דגים חיים בשלבי התפתחות שונים. כאן, אנו משלבים בדיקות סטנדרטיות בדגי זברה עם Z-REX לניתוח מסלולי איתות.

ניטור תגובות איתות ממוקדות בדגי זברה זחלים - Z-REX חושף מנגנונים מדויקים של תרופות אלקטרופיליות ומטבוליטים

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

וכך באמצעות מינוף Z-REX, חוקרים יכולים לחקור כיצד תגובות איתות אינדיבידואליות משתנות בתגובה לליגנד תגובתי ספציפי העוסק בחלבון ספציפי בעל עניין בתנאים פיזיולוגיים קרובים בזחלי דגי זברה. שיטות קונבנציונליות כמו מינון בתפזורת מגיבות מולקולות קטנות הגורמות למטרות ולרעילות ואינן נותנות שליטה על ספציפיות המטרה של הליגנד. Z-REX יכול לקשר מעורבות מטרה ספציפית של ליגנד עם פנוטיפ ספציפי בדיוק מרחבי-זמני גבוה.לאחרונה הראינו כיצד מטבוליט תגובתי HNE, מטרה ומסלול קשורים שהתגלה על ידי Z-REX, מאפשר פיתוח מעכבי קינאז ספציפיים לאיזופורם מדויק נגד סרטן שד טריפל נגטיב. התחילו ביישור העוברים בחריצים של צלחת הזרקה מלאה בתמיסת מלח מאוזנת טרייה 10% של האנק או HBSS. יש לטבול את קצה המחט בתווך, ובמידת הצורך להפעיל פולסי הזרקה להסרת בועות אוויר בקצה לצורך הזרקת העובר יש לחדור לכוריון ולשק החלמון בתנועה אחת ולהפעיל פולס הזרקה.לאחר הזרקת העוברים האחרים, שטפו אותם לתוך צלחת פטרי חדשה המכילה מדיה HBSS טרי באמצעות בקבוק להשפריץ. אגרו את העוברים שלא הוזרקו לצלחת אחרת. כדי לבצע ניתוח טיפול Z-REX, התחל על ידי חלוקת העוברים המוזרקים לתוך 10 ס"מ צלחות.בחדר חשוך עם אור אדום, החלף את המדיום ב- 30 מיליליטר של HBSS 10% עם או בלי מיקרומולר אחד של בדיקת REX. לדגור על העוברים ב 28.5 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר 30 שעות לאחר ההפריה, להחליף את המדיה בחושך.לאחר חזרה על הדגירה והחלפת המדיה פעמיים, חשוף את העוברים לאור מנורת UV מחוממת מראש המסתחררת כל 30 שניות. כדי לבצע בדיקה פנוטיפית, הסר את העוברים הלא מופרים או המתים מהצלחת המכילה את העוברים המורדמים. בעזרת מלקחיים חדים, להסיר את כוריון העוברים.הרכיבו את העוברים על צלחת אגרוז 2% שהוכנה עם תווך HBSS של 10% והתבוננו תחת סטריאומיקרוסקופ. השתמשו ב-ImageJ כדי לספור את מספר הנויטרופילים והמקרופאגים של כל דג. בחר את הבחירה ביד חופשית והקף את הדג כולו, ולאחר מכן בחר באפשרות מצא מקסימה כדי לספור את התאים הפלואורסצנטיים במחקר הנוכחי, עוברים שטופלו ב- Z-REX הדגימו אובדן של נויטרופילים ומקרופאגים.השפעה זו נעדרה בקבוצות שלא טופלו. מסלול איתות האפופטוזיס לא הופעל בקבוצת Halo-P2A-Keap1 וכתוצאה מכך רמות המקרופאגים והנויטרופילים לא השתנו. תוצאות דומות נצפו גם במוטציה Halo-TEV-Keap1 שלא הגיבה ל-HNE.ניתוחי PCR כמותיים בזמן אמת הראו ירידה ברגולציה של גנים הקשורים למערכת החיסון ושיפור בוויסות של גנים נוגדי חמצון לאחר Z-REX. צביעת אימונופלואורסנציה הראתה כי למבנה המפוצל P2A היו פי שניים יותר תגי HA מאשר למבנה TeV-fusion, מה שמעיד על רמות ביטוי דומות. רמות הביטוי של הסוג הפראי והמוטנטי Halo-TeV-Keap1 היו דומות גם הן.בקו הכתבים של נויטרופילים טרנסגניים שטופלו ב-Z-REX, נצפתה גם קולוקליזציה של נויטרופילים וקספז פעיל 3. הדבר החשוב ביותר הוא להגדיר את המסמכים שלך כראוי. הגבלה באמת תשפר את התוצאות שלך.אימצנו את Z-REX, רעיון לפלטפורמת סינון סמים המכונה Localis-REX. אף טכניקה אחרת עד כה לא הצליחה להשיג ליגנד מקומי ספציפי וריאקטיבי כזה או מיפוי מטרות. זה עזר לנו לפתח תרופות אלקטרופיליות מועמדות לטיפול בסרטן השד.בהתחשב בחשיבות הגוברת של איתות מקומי בתחומים רבים, סרטן, אימונולוגיה, הזדקנות וכו', Z-Rex, הכלי היחיד המסוגל למפות אירועים מקומיים מכווני ליגנד תגובתי, מבטיח לסייע בתחומים רבים.

monitoring-on-target-signaling-responses-larval-zebrafish-z-rex

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

דג הזברה הוא אורגניזם ניסיוני מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים חוליות ומחלות של בני אדם מודל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול על אופן ביצוע מסך כימי תפוקה גבוהה מדריך לעוברי דג הזברה עם כל הר באתר הכלאה (רוצה) לקריאה החוצה.

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

אנו מציגים שיטה לניתוח אלקטרורטינוגרפי (ERG) של זחלי דג הזברה תוך שימוש בטכניקות מיקרומניפולציה ואלקטרורטינוגרפיה. זוהי שיטה פשוטה ופשוטה לבדיקת תפקוד חזותי של זחלי דג הזברה in vivo.

ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבחון פעילויות זחל דג זברה, פאטהד מינו גינקולוגיות ותגובות photomotor (PMR) באמצעות תוכנת מעקב אוטומטי אנטי. כאשר שולבו במשותף הרעלים bioassays, ניתוחים של התנהגויות אלו מספקים כלי אבחון לבחון אתריים כימי. פרוטוקול זה מתואר באמצעות קפאין, neurostimulant מודל.

נסיוני לבחינת תגובה התנהגותית פרופילים בדגים זחל: ליישום הקפאין נוירו-ממריץ

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להתפתחות ואפיון של מודל דג זברה של אפילפסיה הנובע מהעיכוב הארעי של הגן DEPDC5.

ניתוח התנהגותי ופיזיולוגי במודל דגי זברה של אפילפסיה

עוברי דג משמשים להערכת הרעילות של תרכובות כימיות. הם מפתחים מבחוץ ורגישים לכימיקלים, ומאפשרים זיהוי של שינויי פנופאיות עדינים. הניסוי דורש רק כמות קטנה של תרכובת, אשר מתווסף ישירות לצלחת המכילה עוברים, מה שהופך את מערכת הבדיקה יעילה וחסכונית.

הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish

כאן, אנו מתארים את הסינתזה של ליפוזומים בסמים שנטענו וההזרקה שלהם לזחל הדגים מטרה למטרה לכוון מסירת סמים לתאי השושלת מקרופאג.

הכוונת תרופות לזחל מקרופאגים על ידי הזרקת סמים טעונים ליפוזומים

אנו מתארים את זרימת העבודה וניתוח הנתונים של מערכת סינון להערכת רעילות של תרכובות כימיות בהתבסס על תגובת הבהלה של רטט עובר דג הזברה. המערכת מתעדת את תנועותיהם של עוברי דגי זברה בחשיפה לגירוי רטט ומאפשרת הערכה משולבת של רעילות/קטלניות כללית ורעילות עצבית-שרירית.

הערכת רעילות של כימיקלים באמצעות מערכת סינון תגובת בהלה לרטט של דגי זברה

פרוטוקול זה מתאר הליך סינון תרופות בזחלי זברה 3-7 ימים לאחר ההפריה ואחריו הערכה מורפולוגית.

בדיקת מולקולות קטנות ובדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

למדו את שיטת Z-REX לניטור תגובות איתות ממוקדות בזחלי דגי זברה. גלו כיצד ליגנדים תגובתיים משפיעים על תאי חיסון ומספקים תובנות לטיפול בסרטן השד.

ניטור תגובות איתות ממוקדות בדגי זברה זחלים - Z-REX חושף מנגנונים מדויקים של תרופות אלקטרופיליות ומטבוליטים

גלה סרטונים נוספים