Name: מודל הממברנה הכוריאואלנטואית של אפרוח (CAM) ככלי לחקר השתלת רקמת שחלה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: למד את מודל הממברנה הכוריאואלנטואית של אפרוח לחקר השתלת רקמת שחלה אנושית. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי היווסדות כלי דם ושרידות זקיקים בתקופה קריטית של שישה ימים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למירה הריניוק, BA, על סקירת השפה האנגלית של המאמר.

השימוש ברקמה אנושית אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של האוניברסיטה הקתולית של לוביין. המטופלות נתנו את הסכמתן מדעת בכתב לשימוש ברקמת השחלה שלהן למטרות מחקר.
1. הזמנת יום 0 ביציות בעלות סיכוי גבוה לעבור
<ol><li>מצאו ספק מוסמך של ביצי לגהורן לבנות שנבחר על ידי לוהמן ברמת מעבדה, המדווח על שיעורים גבוהים של ביציות עובריות, התלוי בעיקר בגיל האפרוחים.</li>
</ol>2. הכנת הביצים לדגירה;
<ol><li>לפני הגעת הביצים, יש להרכיב ולאזן את אינקובטור הביצים לטמפרטורה של 37°C בלחות אוויר יחסית של 40%-60%. עקוב אחר הטמפרטורה ולחות האוויר על ידי הכנסת מדחום ומד לחות לאינקובטור. ודא שמכסה האינקובטור מצויד בחלון זכוכית כדי לאפשר לבדוק את הפרמטרים הפנימיים של האינקובטור מבלי לפתוח אותו (איור 1).</li>
	<li>לאחר שקיבלו את היום 0 ביצים מאפרוחי לגהורן לבנים שנבחרו על ידי לוהמן מספק ביצים מוסמך במעבדה, נקו את פני הקליפות בנייר לחות וייבשו אותן מיד. הערה: מכיוון שקרום קליפת הביצה נקבובי, ניתן להשתמש במים אוטוקלאביים לניקוי משטחי ביצים ולבקרת לחות בתוך האינקובטור על מנת למזער את סיכוני הזיהום.</li>
	<li>תייגו את הביצים באמצעות סמן (למשל, תאריך ומספר ביצה).</li>
	<li>דוגרים על הביצים כשהקצה המחודד פונה כלפי מטה, ומסובבים אותן כדי לאפשר ל-CAM להתפתח. סובבו ידנית את הביצים ב-180° פעמיים עד שלוש פעמים ביום או השתמשו במסובב אוטומטי. הערה: על מנת לוודא שהביצים אכן מסובבות, ניתן לסמן את קליפת הביצה באותיות "X" ו-"O" בשני הצדדים הצדיים המנוגדים באמצעות עיפרון או טוש. חלון הזכוכית במכסה האינקובטור מאפשר לבדוק את סיבוב הביצים מבלי לפתוח את המכשיר.</li>
</ol>3. פתיחת קליפת הביצה ביום השלישי של ED
הערה: חלון מלבני נעשה בקליפת הביצה ביום 3 של ED.
<ol><li>הכינו את מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית על מנת לעבוד בתנאים סטריליים. הניחו את המכשירים הבאים מתחת למכסה המנוע, וחיטאו אותם באתנול 70% (אם לא עבר חיטוי כבר): - מתלה ביצים - נר ביצים או מקור אור קר מוקד -סמן - סיכה סטרילית ישרה -מחט סטרילית 19 גרם -5 מ"ל מזרק סטרילי - להב מסור גלילה -מלקחיים סטריליים - סרט הדבקה</li>
	<li>מעבירים ביצה אחת מהאינקובטור למתלה הביצים שמונח מתחת למכסה המנוע, ומכבים את מסובב הביצים.</li>
	<li>בחושך, זהו את כיס האוויר של הביצה על ידי הנחת נר הביצה (או מקור אור קר מוקדי) כנגד קליפת הביצה. כיס האוויר ממוקם בקצה הקהה של הביצה. השתמשו בטוש כדי לאתר את מרכז כיס האוויר על קליפת הביצה.</li>
	<li>הדליקו את האורות. עשו חור קטן בקליפת הביצה, שם היא מסומנת על ידי סיבוב עדין של סיכה ישרה סטרילית. פתח זעיר בקוטר של כ-1 מ"מ מספיק בדרך כלל. הערה: היזהרו לא לדחוף את הסיכה עד הביצה. אם זה קורה, השליכו את הביצה.</li>
	<li>חבר מחט סטרילית של 19 גרם למזרק סטרילי של 5 מ"ל.</li>
	<li>בחושך, אתר את שק החלמון באמצעות נר הביצה (או מקור אור קר מוקדי), ונקב את הביצה דרך החור שנוצר בשלב 3.4 עם מחט סטרילית 19 G בזווית של 45° לכיוון תחתית הביצה; היזהרו מאוד לא לשבש את שק החלמון. שואפים בין 1.5-2 מ"ל של אלבומן כדי לנתק את CAM מן הקליפה, ולאחר מכן לסגור את החור עם חתיכת סרט דבק. הערה: אם שק החלמון משובש במהלך השאיפה, הנוזל השואף במזרק יהיה בצבע צהוב ולא שקוף (אלבומן). אם זה קורה, להחליף את המחט ואת מזרק. אם נשאבת כמות גדולה יחסית של חלמון ביצה, הדבר עלול לסכן את יכולת הקיום של העובר.</li>
	<li>הדליקו את האורות. מניחים את הביצה בצורה אופקית, ומציירים בטוש חלון מלבני בגודל 1X1.5 ס"מ. אין להגדיל את החלון מהרוחב הרגיל של סרט הדבקה סטנדרטי.</li>
	<li>החזיקו את הביצה ביד אחת, וראו בעדינות את החלון ששורטט קודם לכן לתוך קליפת הביצה באמצעות להב מסור גלילה. ודא כי הקליפה אינה נסדקת ולא לחתוך כל הדרך עד CAM מדוכא. נשפו באופן קבוע כדי להסיר אבק פגזים ופסולת.</li>
	<li>החליקו מלקחיים סטריליים מתחת לחתיכה המלבנית של הקליפה המנוסרת, ואחזו במיומנות כדי להסיר אותה בצורה נקייה מבלי לפגוע ב- CAM. בנוסף, השליכו את קרום הקליפה החיצונית הלבנה כדי שתוכלו לראות את העובר ואת ה-CAM שלו. הערה: אם אבק קליפות ביצים או פסולת נופלים על CAM, ניתן להסיר אותו באמצעות מלקחיים סטריליים, נזהר מאוד לא לקרוע את CAM.</li>
	<li>זהה ביציות עובריות בנות קיימא. ניתן להבחין בהם על ידי האלבומן השקוף שלהם וטבעת כלי הדם סביב העובר, שם לב פועם עשוי לפעמים להיות מזוהה אפילו בשלב זה (יום 3 של ED). יש להשליך עוברים לא מופרים או מתים.</li>
	<li>הניחו סרט הדבקה על החלון החדש שנוצר כדי למנוע התייבשות. הקפד לקפל קצה אחד מעל עצמו כדי להקל על ההסרה.</li>
	<li>החזירו את הביצה לאינקובטור כשהחלון הפתוח פונה כלפי מעלה והקלטת לא נוגעת ב-CAM. השתמשו בפיסת נייר מקופלת או בחלק ממדף הביצים כדי למנוע מהביצה להתגלגל. ודא שהמגש המסתובב כבוי.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.2-3.12 כדי לפתוח את הביציות הנותרות.</li>
</ol>4. השתלת רקמת שחלה אנושית קפואה-מופשרת ל-CAM
הערה: השתלה ל- CAM צריכה להתחיל באופן אידיאלי בין הימים 7-10 של ED.
<ol><li>הפשירו רצועות קליפת המוח של השחלות תחת מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית בהתאם לפרוטוקול המתואר במקום אחר30.</li>
	<li>חותכים את רצועות קליפת המוח לשלושה שברים של 4 מ"מ x 2 מ"מ x 1 מ"מ. השתמש בחתיכה אחת כבקרה ללא השתלה ובשתיים האחרות לקסנוגרפטינג למשך יום אחד או 6 ימים. הערה: אם יש מספיק רקמה זמינה, עבוד בכפילות.</li>
	<li>מעבירים ביצה אחת מהאינקובטור למתלה הביצים הממוקם מתחת למכסה המנוע, כשהחלון פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>קלפו את הסרט מהחלון, וודאו שהעובר בר-קיימא. בשלב זה, עוברים בני קיימא כוללים כלי דם נרחבים, אלבומן שקוף, פעימות לב נראות לעין ותנועה מסוימת של העובר.</li>
	<li>הכן את אתר ההשתלה על ידי טראומה עדינה של אזור קטן של CAM על ידי הנחת רצועה של 1 ס"מ2 של נייר עדשה סטרילי Ether-extracted על משטח האפיתל והסרתו מיד. הערה: ה- CAM הוא מחסום בלתי חדיר אלא אם כן הממברנה עברה טראומה על ידי הסרת החלק ההיקפי העליון של שכבת האפיתל הכפולה, והותירה את שכבת הבסיס שלמה. טכניקה זו גם משפרת את תהליך revascularization על ידי הפעלת ריפוי פצע. אם נייר העדשה הסטרילי שחולץ מאתר נשאר על ה-CAM זמן רב מדי, הממברנה עלולה להידבק לנייר העדשה ולהיקרע. אם זה קורה, השליכו את הביצה.</li>
	<li>אחזו ברצועה אחת של קליפת המוח השחלתית שהוקפאה והופשרה (4 מ"מ x 2 מ"מ x 1 מ"מ) בעזרת מלקחיים מיקרוכירורגיים, והניחו אותה על ה-CAM שעבר טראומה עם הצד המדולרי כנגד ה-CAM. להשתיל חתיכת רקמה אחת לכל ביצה.</li>
	<li>מכסים את החלון בסרט דבק, ומחזירים בזהירות את הביצה לאינקובטור. ודאו שפתח קליפת הביצה זקוף והביצה בטוחה.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.1-4.7 להשתלת כל הרקמות הנותרות. הערה: יש לבדוק את השתלים בכל יום השתלה כדי להעריך את כדאיות העובר ולעקוב אחר שינויים בכלי הדם.</li>
</ol>5. קצירת השתלים
הערה: Xenografts יש לקצור לכל המאוחר עד יום 17 של ED, שכן המערכת החיסונית של העובר הופך בוגר ומוכשר מהיום 18.
<ol><li>הניחו את הביצה על מתלה, והגדילו את החלון בקליפת הביצה כדי לאפשר הדמיה טובה יותר של השתל ומניפולציה קלה יותר.</li>
	<li>להעריך את השתל באופן מקרוסקופי, ולשים לב במיוחד לתגובה וסקולרית של CAM כלפי השתל. צלם תמונות דיגיטליות או סרטונים לפרוטוקול.</li>
	<li>אחזו את הרקמה או את ה-CAM שמסביבה במלקחיים, והשתמשו במספריים או באזמל כדי להוציא את השתל מה-CAM בזהירות. הערה: השתלים מתכסים בשכבה שנייה של CAM בסביבות היום השלישי של ההשתלה ובסופו של דבר הופכים לעטופים. ייתכן גם שהם נעו בתוך הביצה ביום 6, מה שמקשה על שליפתם במקרים מסוימים.</li>
	<li>לנתח את הרקמות שנכרתו בכל שיטה המתאימה לניסוי הנתון. במחקר הנוכחי, חלקי רקמה היו קבועים בפרפורמלדהיד, משובצים בפרפין ומוכתמים בהמטוקסילין ואוזין בעקבות השלבים המתוארים להלן:<ol><li>תקן את השברים בפרפורמלדהיד 4% למשך 24 שעות, והטמע אותם בפרפין באמצעות התקן הטבעה אוטומטי עם השלבים המוזכרים בטבלה 1.</li>
		<li>השאירו את הקוביות המשובצות בפרפין למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C לפני שתחתכו אותן למקטעים בעובי 5 מיקרומטר בעזרת מיקרוטום.</li>
		<li>מורחים את חלקי הרקמה על מגלשת זכוכית המונחת על צלחת חמה (30 מעלות צלזיוס), ומשאירים אותם להתייבש במשך 2 שעות, ואחריו 24 שעות בתנור ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לאחר מכן, הכתימו את המגלשות בהמטוקסילין ובאאוסין בהתאם לפרוטוקול המתואר במקום אחר31. לאחר מכן, הפוך את הדגימות לדיגיטליות באמצעות סורק שקופיות, ונתח אותן באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.</li>
	</ol></li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

החלק המאתגר ביותר בפרוטוקול המתואר כאן הוא יצירת החור הקטן הדרוש לשאיפת האלבומן על מנת לנתק את ה- CAM מקליפת הביצה לפני יצירת חלון. הפעלת לחץ רב מדי עלולה לגרום לחדירת יתר או אפילו לסדוק ולהרוס את הביצית, ולגרום נזק בלתי הפיך ל- CAM ולכלי הדם שלה. כדי לצמצם את הטעויות למינימום במהלך הניסיונות הראשוניים להפריד את ה-CAM, מומלץ מאוד לתרגל יצירת חורים קטנים בקליפת הביצה של ביצים לא מופרות, שנקנו במכולת באמצעות סיכה ישרה. יתר על כן, בהתחשב בשונות הטבעית של הפוריות בין אצוות, יחד עם העובדה שלא כל העוברים שורדים את ההליך, מומלץ...

הביקוש לשימור פוריות להתוויות אונקולוגיות ושפרות, כמו גם מסיבות חברתיות, גדל באופן דרמטי בעשורים האחרונים. עם זאת, טיפולים שונים המשמשים לריפוי מחלות ממאירות ולא ממאירות רעילים מאוד לגונדות ויכולים לגרום לאי ספיקת שחלות מוקדמת יאטרוגנית, מה שמוביל בסופו של דבר לאי פוריות1. טכניקות מבוססות לשימור פוריות כוללות שימור בהקפאת עוברים, ויטריפיקציה של ביציות לא בשלות או בוגרות, ושימור בהקפאה של רקמת שחלה 2,3,4. הקפאת רקמת שחלה היא האפשרות היחידה הזמינה לשימור פוריות אצל נערות לפני גיל ההתבגרות או נשים הזקוקות לטיפול מיידי בסרטן. שיקום התפקוד האנדוקריני לאחר השתלת רקמת שחלה מתרחש ביותר מ-95% מהנבדקות, כאשר שיעורי לידות החי נעים בין 18% ל-42%5,6,7,8,9.
למרות שהשתלת רקמת שחלה קפואה ומופשרת הוכחה כמוצלחת, עדיין יש מקום לשיפור. ואכן, כאשר שברי קליפת המוח בשחלות מושתלים ללא אנסטומוזה וסקולרית, הם חווים תקופה של היפוקסיה שבמהלכה מתרחשת revascularization השתל 10,11,12. הרוב המכריע של המחקרים שחקרו השתלת רקמת שחלה אנושית השתמשו במודל קסנוגרפטינג, שבו רקמת שחלה מושתלת בעכברות מדוכאות חיסון. הרה-וסקולריזציה המלאה של הקסנוגרפטים אורכת כ-10 ימים, כאשר הן כלי המארח והן כלי השתל תורמים להיווצרות כלי דם פונקציונליים 12,13,14. בסביבות 50%-90% מרזרבת הזקיק אובדת בחלון היפוקסי זה לפני השלמת רה-וסקולריזציה של השתל 10,15,16. הוצע מאוד כי אובדן זקיקים מסיבי זה מתרחש הן באמצעות מוות ישיר של זקיקים, כפי שמודגם על ידי ירידה במספר הזקיקים המוחלט שנותר לאחר השתלה, והן על ידי הפעלת צמיחת זקיקים קדמונית, כפי שעולה משינויים בפרופורציות הזקיקים לקראת שיעורים מוגברים של גידול זקיקים17,18.
באופן מעניין, עבודות מחקר קודמות שהשתמשו ברקמות שחלות שונות של בעלי חיים שהושתלו בקרום כוריאואלנטואי אפרוח (CAM), שיש לו מבנה המחקה את אתר ההשתלה הטיפוסי של הצפק, דיווחו על עיכוב של הפעלת זקיק ספונטנית, כאשר רזרבת הזקיק הראשונית נשארת שלמה עד 10 ימים 19,20,21,22. הצוות שלנו הוכיח בעבר כי השתלת רקמת שחלה אנושית קפואה-מופשרת ל-CAM היוותה גישה אמינה לחקר השתלת רקמת שחלה אנושית בשלביה האיסכמיים הראשונים23 ולאחרונה הראה כי שיטת השתלה זו הצליחה לנטרל את הפעלת זקיק24.
מודל CAM מושך במיוחד לא רק בגלל שביציות זולות בהרבה מעכברות, אלא גם בגלל האופי הווסקולרי מאוד של CAM, המאפשר לבחון את הקשר בין הפעלת זקיקים לבין רה-וסקולריזציה של שתל השחלות. מערכת העופות היא, אכן, אחת הדרכים הנפוצות והמגוונות ביותר לחקר אנגיוגנזה25. התפתחות עובר אפרוח (ED) אורכת 21 יום עד הבקיעה, וה-CAM נוצר בתוך 4-5 הימים הראשונים באמצעות איחוי האלנטואי והכוריון26. יש לציין כי עובר האפרוח הוא פונדקאי חיסוני באופן טבעי עד היום ה-17 של ED, כך שניתן לבצע ניסויים בקסנוגרפטינג ללא כל סיכון לדחיית השתל27,28. יתר על כן, גישת מודל CAM אינה מעלה כל חשש אתי או משפטי במונחים של החוק האירופי29, מה שהופך אותו חלופה אטרקטיבית למודלים אחרים של בעלי חיים. באשר לתנאי הרבייה, עוברי אפרוחים זקוקים רק לאינקובטור שנקבע על 37 מעלות צלזיוס עם לחות אוויר יחסית של 40%-60%. דרישות ניסוי מוגבלות אלה מפחיתות באופן משמעותי את עלויות המחקר בהשוואה לשימוש בעכברים מדוכאי חיסון.
הפרוטוקול המוצג כאן נועד לתאר את הפיתוח של מודל קסנוגרפטינג CAM עבור רקמת שחלה אנושית ולספק תובנות ספציפיות לגבי יעילות הטכניקה, מסגרת הזמן של רה-וסקולריזציה של השתל וכדאיות הרקמה על פני תקופת השתלה של 6 ימים. פרוטוקול זה יכול להיות בעל עניין רב לחקר המנגנונים מאחורי אובדן זקיק מוקדם לאחר השתלה ולחקר ההשפעה של מספר גורמים (גורמי גדילה, הורמונים וכו ') על תופעה זו.

<table><tbody><tr><td>מחט היפודרמית Agani, 19 G</td><td>Terumo Europe</td><td>AN*1950R1</td><td>מחט 19 G לשאיבת מזרק Terumo אלבום</td></tr><tr><td>, 5 מ"ל מנעול לואר קונצנטרי</td><td>Terumo Europe</td><td>SS*05LE1</td><td>מזרק סטרילי 5 מ"ל</td></tr><tr><td>Caseviewer v2.2</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td>תוכנת ניתוח תמונה</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Merck Chemicals</td><td>603-022-00-4</td><td>אתר סטרילי לטראומה של ה-CAM</td></tr><tr><td>תמיסה מימית Eosin Y 0.5%</td> <td>Merck</td><td>1098441000</td><td>תמיסת צביעה</td></tr><tr><td>פורמלדהיד 4% תמיסה מימית חוצצת (פורמלין 10%)</td> <td>VWR</td><td>97139010</td><td>פורמלדהיד המשמש לקיבוע רקמות</td></tr><tr><td>מקרר</td><td>Liebherr</td><td>7081260</td><td>מקרר בטמפרטורה של 4 מעלות; C משמש להטמעת פרפין</td></tr><tr><td>צלחת חימום</td><td>Schott</td><td>SLK2</td><td>פלטה חמה המשמשת לייבוש השקופיות</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Forma Scientific 3111</td><td>תנור 10365156</td><td>המשמש לדגירת שקופיות</td></tr><tr><td>Leica CLS 150 XE מיקרוסקופ מקור אור קר</td><td>Leica</td><td>CLS 150 XE</td><td>מקור אור קר מוקדי לנר את הביצים</td></tr><tr><td>רקמת ניקוי עדשות, כיתה 541</td><td>VWR</td><td>111-5003</td><td>רקמה להשרות באתר סטרילי כדי לגרום לטראומה</td></tr><tr><td>של ההמטוקסילין</td><td>של CAM מאייר MERCK</td><td>1092491000</td><td>תמיסת צביעה</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>VWR</td><td>20847307</td><td>מתנול</td></tr><tr><td>מיקרוטום</td><td>ThermoScientific-MICROM</td><td>HM325-2</td><td>Microtome</td></tr><tr><td>Pannoramic P250 Flash III</td><td>3DHISTECH/</td><td></td><td>Slide סורק בהגדלה של פי 20</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1,04,00,51,000</td><td>תמיסת הטמעת פרפין</td></tr><tr><td>Paraplast Plus R</td><td>Sigma</td><td>P3683-1KG</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי פרפין, 60x15 מ"מ,</td><td>גריינר</td> סטרילי <td>628161</td><td>צלחת פטרי סטרילית</td></tr><tr><td>מחזיק סיכות</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>מחזיק פינים</td></tr><tr><td>Polyhatch</td><td>Brinsea</td><td>CP01F</td><td>חממת ביצים עם מסובב אוטומטי</td></tr><tr><td>להב מסור גלילה, 132 מ"מ</td><td>Sencys</td><td>/</td><td>להב מסור ליצירת חלון בקליפת הביצה</td></tr><tr><td>סיכות הכנסה מנירוסטה</td><td>Fine Science Tools</td><td>26007-02</td><td>סיכה ישרה ליצירת חור בקליפת הביצה</td></tr><tr><td>Steril-Helios&nbsp;</td><td>Angelantoni Industrie</td><td>ST-00275400000</td><td>מכסה מנוע זרימה למינארי</td></tr><tr><td>Superfrost Plus מוט בורדס &eacute; s 90&deg;</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td>שקופיות זכוכית&nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6Al</td><td>Sakura</td><td>60320417-0711 VID6E3-1</td><td>מכשיר הטבעה אוטומטי</td></tr><tr><td>מלקחיים טיטניום</td><td>Fine Science Tools</td><td>11602-16</td><td>מלקחיים להסרת קליפות ביצה ומניפולציה של רקמות שחלות</td></tr><tr><td>טולואן, 28701364</td><td>VWR</td><td></td><td>תמיסת הטמעת פרפין</td></tr></tbody></table>

מודל הממברנה הכוריאואלנטואית של אפרוח (cam) ככלי לחקר השתלת רקמת שחלה

The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation

שימור והשתלת רקמת שחלות היא אסטרטגיה יעילה לשימור פוריות, אך יש לה חסרון עיקרי אחד, והוא אובדן זקיקים מסיבי המתרחש זמן קצר לאחר ההשתלה מחדש עקב הפעלת זקיק חריגה ומוות. מכרסמים הם מודלים לבחינת הפעלת זקיקים, אך העלות, הזמן והשיקולים האתיים הופכים לאוסרים יותר ויותר, ובכך מניעים את הפיתוח של חלופות. מודל הממברנה הכוריאואלנטואית של האפרוחים (CAM) אטרקטיבי במיוחד, בהיותו זול ושומר על כשל חיסוני טבעי עד היום ה -17 לאחר ההפריה, מה שהופך אותו לאידיאלי ללמוד קסנוגרפטינג לטווח קצר של רקמת שחלה אנושית. ה- CAM הוא גם מאוד וסקולרי ונמצא בשימוש נרחב כמודל לחקר אנגיוגנזה. זה נותן לו יתרון יוצא דופן על פני מודלים במבחנה ומאפשר לחקור מנגנונים המשפיעים על תהליך אובדן זקיק מוקדם לאחר השתלה. הפרוטוקול המתואר כאן נועד לתאר את הפיתוח של מודל קסנוגרפטינג CAM עבור רקמת שחלה אנושית, עם תובנות ספציפיות לגבי יעילות הטכניקה, מסגרת הזמן של רה-וסקולריזציה של השתל ויכולת הקיום של הרקמה על פני תקופת השתלה של 6 ימים.

שיעורי הישרדות עוברי אפרוחים שיעור הישרדות העוברים מחלון (יום 3 של ED) להשתלת רקמת שחלה (יום 7 של ED) היה 79% (33/42). מכיוון שאחוז הביציות המועברות ביום 0 אינו ידוע, נצטוו מספר על 0 ביצים מתרנגולות לגהורן לבנות שנבחרו על ידי לוהמן כדי להבטיח שיהיו מספיק ביצים עובריות זמינות להשתלה. בסך הכל 23 ביציות בנות קיימא שימשו להשתלה, אחת מהן נספתה במהלך 24 השעות הראשונות, וכתוצאה מכך שיעור הישרדות העובר הכולל של 96% לאחר ההשתלה (22/23).
היבט מקרוסקופי של השתלים ל...

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לפיתוח מודל קסנוגרפטינג של קרום כוריואלנטואי אפרוח (CAM) עבור רקמת שחלה אנושית ומדגימים את יעילות הטכניקה, מסגרת הזמן של רה-וסקולריזציה של השתל ויכולת הקיום של הרקמה על פני תקופת השתלה של 6 ימים.

מודל הממברנה הכוריאואלנטואית של אפרוח (CAM) ככלי לחקר השתלת רקמת שחלה

Ovarian tissue cryopreservation and transplantation is an effective strategy for preserving fertility but has one major drawback, namely massive follicle ...

לשימוש ב- CAM לצפייה בשינויים מוקדמים לאחר השתלת רקמת שחלה יש יתרון משמעותי על פני מודלים במבחנה, שכן הוא מאפשר לחקור את המנגנון המשפיע על תהליך מוקדם של כלי דם ואובדן זקיקים. טכניקה זו אינה יקרה, וניתן לבצע אותה ללא כל סיכון לדחיית השתל עקב הכשל החיסוני הטבעי של העובר במשך 17 הימים הראשונים. יתר על כן, גישה זו אינה מעלה כל בעיה אתית או משפטית במונחים של החוק האירופי.האסטרטגיה הטובה ביותר לפיתוח המיומנויות הידניות הדרושות למניפולציה של ביציות יכולה להיות מושגת על ידי אימון עם ביציות לא עובריות לפני הניסוי בפועל. בתור התחלה, תייגו את היום שבו אפס ביצים שהתקבלו מלובן בחרו אפרוחי לגהורן לבנים באמצעות טוש. דוגרים על הביצים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, כאשר הקצוות המחודדים פונים כלפי מטה.סובבו את הביצים ב-180 מעלות, פעמיים עד שלוש פעמים ביום באופן ידני. בחושך, מניחים נר ביצים כנגד קליפת הביצה ומאתרים את מרכז כיס האוויר על קליפת הביצה באמצעות טוש. הדליקו את האורות וסובבו סיכה ישרה סטרילית במיקום המסומן כדי ליצור פתח של כמילימטר.אתרו את שק החלמון בחושך בעזרת נר הביצים. נקבו את הביצה עם מחט סטרילית באורך 19 מד, בזווית של 45 מעלות לכיוון תחתית הביצה, מבלי להפריע לשק החלמון. שאפו 1.5 עד שני מיליליטר מהאלבומין לנתק את ה-CAM מהקליפה.לאחר מכן סגור את החור עם סרט דבק. הדליקו את האורות וציירו חלון מלבני בגודל אחד על 1.5 סנטימטרים על הביצה המונחת אופקית. החזיקו את הביצה ביד אחת, וחתכו בעדינות חלון לתוך קליפת הביצה, באמצעות להב מסור גלילה, מבלי לסדוק את הקליפה.נשפו באופן קבוע כדי להסיר אבק פגזים ופסולת. החלק מלקחיים סטריליים מתחת לחתיכת הקליפה המלבנית, והסר אותה בצורה נקייה מבלי לפגוע ב- CAM. לאחר מכן השליכו את קרום הקליפה החיצונית הלבנה כדי לראות את העובר ואת ה-CAM.בביציות עובריות בנות קיימא, אלבומין שקוף, טבעת כלי דם סביב העובר, ולפעמים לב פועם, נראים ביום השלישי להתפתחות עובר האפרוחים. מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, הניחו את הביצה על מדף הביצים כשהחלון פונה כלפי מעלה וקילפו את סרט הדבק. הניחו בעדינות והסירו מיד רצועה מרובעת של סנטימטר אחד של נייר עדשה סטרילי שחולץ מאתר על משטח האפיתל, כדי לגרום טראומה לאזור קטן של CAM.לאחר מכן אחזו ברצועת קליפת השחלות הקפואה והמופשרת עם מלקחיים מיקרוכירורגיים, והניחו אותה על ה- CAM הטראומטי עם הצד המדולרי כנגד ה- CAM. הערך את השתל באופן מקרוסקופי, והקדש תשומת לב מיוחדת לתגובת כלי הדם של ה- CAM כלפי השתל לפני צילום תמונות דיגיטליות או סרטונים. לאחר שתסיים, קצור את השתל על ידי אחיזת הרקמה או ה- CAM שמסביב עם מלקחיים, והוצא בזהירות את השתל מה- CAM באמצעות מספריים.השתלים היו בני קיימא ב -100% מהמקרים לאחר היום הראשון של ההשתלה. הם כבר נצמדו חלקית ל-CAM, והראו שהגלגל מדבר על תבנית כלי הדם הדרושים לכלי הדם שלהם. לאחר שישה ימים של השתלה, השתלים הודבקו ל- CAM.בסביבות היום השלישי לאחר ההשתלה, השתלים כוסו בשכבה שנייה של CAM והפכו לעטוף. השתל הראה כלי דם טובים, כאשר 80% מההשתלות חדרו לביצית. שני שתלים לא התחברו ל-CAM וקיבלו מראה נמק, וכתוצאה מכך שיעור הישרדות הרקמה המושתלת עמד על 83% לאחר שישה ימים.בהערכה ההיסטולוגית של ההשתלה נצפו זקיקים בריאים בכל נקודות הזמן. לאחר ההשתלה נצפתה ירידה לא משמעותית בצפיפות הזקיק. שיעורי הישרדות הזקיקים נשמרו במהלך תקופת ההשתלה על 95% ביום הראשון, ו-83% ביום השישי.החלק המאתגר ביותר הוא יצירת החור הקטן הדרוש כדי לשאוף את האלבומין, לנתק את ה- CAM מקליפת הביצה, לפני יצירת חלון ליישום. לחץ רב מדי עלול לגרום לגירוי יתר, או אפילו לסדוק ולהרוס את הביצית, ולגרום נזק בלתי הפיך ל- CAM או לכלי הדם שלה. מודל זה אידיאלי לבדיקת מספר היבטים של התקופה המוקדמת של רקמת השחלה שלאחר ההשתלה, כולל ההשפעה של גורמים פרו-אנגיוגניים, חומרים נוגדי חמצון מגנים, ציטוקינים, הורמונים וגורמים אחרים השולטים בהפעלת זקיקים ובגדילה מוקדמת.מודל זה הצביע על הקשר בין וסקולריזציה מוקדמת לבין אפנון הפעלת זקיקים, שהם שני האירועים העיקריים המביאים לירידה ברזרבה השחלתית לאחר השתלת רקמת שחלה.

the-chick-chorioallantoic-membrane-cam-model-as-tool-to-study-ovarian

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Chorioallantoic חומוס קרום (רמ"א) הוא ייחודי, immunodeficient באופן טבעי בסביבה תומכת תרבות ללמוד אנגיוגנזה tumorigenesis. מאמר זה וידאו מדגים את השלבים השונים...

אפרוח אובו לשעבר תרבות אובו לשעבר CAM Assay: איך זה באמת עובד

בסרטון זה, אנו מתארים טכניקה לפתיחת קליפת הביצה של ביצת תרנגולת מופרית כדי לחשוף את הקרום הכוריאואלנטואי שלה או CAM הנושא רשת של כלי דם מסתעפים. ה- CAM החשוף יכול לשמש במידול גידולי ביצו.

חלון ביצים: שיטה לפתיחת קליפת ביצי תרנגולת מופרית לחשיפת כלי הדם של הממברנה הכוריאואלנטואית

בסרטון זה, אנו מתארים השתלה של תאים סרטניים על קרום כוריואלנטואי של תרנגולת כדי ליצור מודל in ovo. המודל משתיל בהצלחה את תאי סרטן השחלות כדי לחקור את התקדמות הסרטן הגינקולוגי.

מודל סרטן מבוסס קרום עוף Chorioallantoic: מודל In Ovo לחקר גידולים וגרורות של תאים סרטניים

בסרטון זה, אנו מתארים את השיטה לתרבית משותפת של גרעיני שורש גביים ותאים סרטניים על קרום כוריאואלנטואי אפרוח או CAM כדי לחקור פלישה פריעצבית.

Chick Chorioallantoic Membrane או CAM Tumor Model: שיטת In Ovo להדמיית פלישה פריעצבית של תאי גידול

סרטון זה מדגים את בידודו של קרום כוריאואלנטואי נושא גידול מעובר התרנגולת. ניתן להשתמש ב- CAM שנקצר ליישומים נוספים במורד הזרם.

קציר קרום צ'וריואלנטואי אפרוחים: שיטה לבידוד קרום כוריאואלנטואי נושא גידול מביצת תרנגולת

<em&gt; באוב</em&gt; CAM-assay כXenograftmodel לסרקומה

הממברנה הכוריואלנטואית של הגוזל (CAM) היא חסרת חיסון ובעלת כלי דם גבוהים, מה שהופך אותה למודל טבעי in vivo של צמיחת גידול ואנגיוגנזה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה אמינה לגידול גידולי קרצינומה תלת מימדיים של הכבד (HCC) באמצעות בדיקת CAM.

<em&gt; באוב</emAssay&gt; אפרוח chorioallantoic ממברנה (CAM) כמודל xenograft יעיל של Hepatocellular Carcinoma

הפלישה הנקבים הוא פנוטיפ אגרסיבי הראש והצוואר קרצינומה של תאים וגידולים אחרים. מודל הממברנה של האפרוח שימש ללימוד אנגיוגנזה, הפלישה לסרטן וגרורות. כאן אנו מדגימים כיצד מודל זה יכול להיות מנוצל כדי להעריך את הפלישה הנקבים בvivo.

ממברנה של צ'יק כוראלאנטוניק במודל Vivo להערכת הפלישה לתוך הראש ולסרטן הצוואר

אנו מציגים את המודל ממברנה העוף כוראואליאלי כחלופה, השתלה שולחן, במודל vivo עבור החרט של גינקולוגית ואורולוגית תאים לסרטן וגידולים הנגזר החולה.

שימוש בקרום כוראלאלי ממברנה במודל Vivo כדי ללמוד גינקולוגית ואורולוגיים סרטן

פרוטוקול זה מתאר שלוש שיטות כיצד להשיג ולהשתמש בעוברי עוף בני 5 עד 8 ימים ובממברנה הכוריאואלנטואית שלהם (CAM) כמודל in vivo לחקר הדמיית אולטרסאונד משופרת ניגודיות ואספקת תרופות בתיווך מיקרו-בועות.

הכנת עוברי עוף אקס אובו וכלי קרום כוריואלנטואיים כמודל In Vivo להדמיית אולטרסאונד משופר ניגודיות ומחקרי אספקת תרופות בתיווך מיקרו-בועות

הממברנה הכוריאלנטואית (CAM) של עובר העופות היא כלי שימושי מאוד וישים לתחומי מחקר שונים. דגם אקס אובו מיוחד של שליו יפני CAM מתאים לחקירת טיפול פוטודינמי.

ממברנת שליו כוריואלנטואית - כלי לאבחון וטיפול פוטודינמי

למד את מודל הממברנה הכוריאואלנטואית של אפרוח לחקר השתלת רקמת שחלה אנושית. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי היווסדות כלי דם ושרידות זקיקים בתקופה קריטית של שישה ימים.

מודל הממברנה הכוריאואלנטואית של אפרוח (CAM) ככלי לחקר השתלת רקמת שחלה

גלה סרטונים נוספים