ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית באמצעות סימולציה למידה מבוקרת

אנו מדגימים את השימוש בכלי למידת מכונה בפיקוח סימולציה לניתוח מיטוכונדריה בתמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים קבועים. השיטות הנוכחיות לפלח מיטוכונדריה בתמונות מיקרוסקופיה כוללות שיטות אוטומטיות מבוססות סף כגון Ostu או סגמנטציה ידנית. טכניקות מבוססות סף מתפקדות בצורה גרועה כאשר יחס האות לרקע נמוך.

בדרך כלל, תמונות לניתוח המורפולוגי כוללות מספר רב של מיטוכונדריה, מה שהופך את הפילוח הידני למייגע. שיטות למידה עמוקה מפוקחות מבצעות סגמנטציה בדיוק גבוה, אך דורשות מספר רב של נתוני זוגות קרקע-אמת לצורך אימון. גישה זו משתמשת בסימולטור מבוסס פיזיקה כדי ליצור זוגות של תמונות מיקרוסקופיה, ואת מסכת הצורה הדו-ממדית שלהם של אמת הקרקע, ובכך מבטלת את הצורך בביאור ידני.

המודל המאומן על תמונות מדומות משמש לאחר מכן כדי לפלח את המיטוכונדריה בתמונות מיקרוסקופ אמיתיות. אנו משתמשים בכלי פילוח מבוסס למידה עמוקה המאפשר אוטומציה של משימה זו בדיוק גבוה ושאינו דורש מערך נתונים מבואר של אמת קרקעית לצורך אימון. הסימולציה מתחילה ביצירת גיאומטריה באמצעות עקומות פרמטריות ליצירת צורה.

פולטים מתפלגים באופן אחיד וממוקמים באופן אקראי על פני השטח של הצורה שנוצרה, כך שהצפיפות תואמת לערכים ניסיוניים. PSF תלת-ממדי של המיקרוסקופ מחושב באמצעות מודל גיבסון-לאני. כדי להשיג פוטו-ריאליזם בין התמונות המדומות לבין התמונות הניסיוניות, אנו מחקים הן את הרעשים הכהים והן את רעשי הצילום.

אמת הקרקע הפיזיקלית נוצרת בצורה של מפה בינארית. אנו מעריכים את ההשפעה של טיפול CCCP על מורפולוגיה של מיטוכונדריה של קרדיומיובלסטים קבועים המצולמים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. תרבית תאים.

התכוננו לזריעת התאים, הפועלים במכסה זרימה למינרית סטרילית, על ידי הנחת כיסוי לכל תנאי ניסוי בבאר של צלחת 12 באר. ודא שמתלה התא המדולל מעורבב כראוי על ידי העברת תכולת צינור הצנטריפוגה למעלה ולמטה מספר פעמים לפני חלוקת הנפח המתאים לכל באר. הליך ניסיוני.

שאפו מדיה של תרבית תאים מהבארות של צלחת 12 הקידוחים ולאחר מכן מרחו במהירות מדיה טרייה שחוממה מראש על בארות הבקרה ועל המדיה המחוממת מראש עם 10 תמיסת CCCP מיקרומולרית על בארות מצב הבדיקה. לדגור באינקובטור התאים 37 צלזיוס במשך שעתיים. שאפו את מדיית תרבית התאים מהבארות והחלו את פתרון הקיבוע שחומם מראש.

צביעה והרכבה של תאים על תלושי כיסוי. הוסף מדיה להרכבה של 10 מיקרוליטר למגלשת זכוכית מוכנה כדי להרכיב תלוש כיסוי. הרימו את מחליק הכיסוי מ-12 לוחות הבאר באמצעות פינצטה וטפחו לחות ממחליקות הכיסוי על ידי נגיעה קצרה בקצה ובגב הכיסוי להחליק אל מגבת הנייר המוכנה ללא מוך.

הנמיכו בעדינות את הכיסוי והחליקו מטה על טיפת המדיה הממתינה. מיקרוסקופ והדמיה. באמצעות העיניים, כוונן ידנית את רמת Z כדי שהדגימה תהיה ממוקדת.

עבור לכרטיסייה שנרכשה בתוך התוכנה. השתמש בהגדרה החכמה כדי לבחור ערוץ פלואורסצנטי שישמש להדמיה. מערך ממורכז במרכז הכיסוי עם 12 מיקומים בסך הכל לצילום.

מיקום RA במרכז החלק המרכזי של הכיסוי. ניתן לצלם מספר מיקומים באופן אוטומטי. הפקת נתוני אימון מדומים.

הורד את הקוד ופתח את התוכן. בצע את ההוראות וקרא כדי להגדיר את הסביבה. נווט אל התיקיה בשם src"צור עותק או השתמש בתיקיה 2.

סימולציית מיטוכונדריה אוורירית"ו לשנות את שמה. תיקייה זו מכילה את כל הקבצים הקשורים לסימולציה של נתוני האימון. ישנן שלוש קבוצות של פרמטרים שיש להגדיר עבור הסימולציה.

ראשית, הגדר את הפרמטרים של מספר המיטוכונדריה, טווח הקוטר, הטווח של ציר Z וצפיפות הפלואורופורים עבור הסימולטור בקובץ תצורת האצווה. לאחר מכן, הגדר פרמטרים אופטיים של צמצם מספרי, הגדלה ואורך גל מינימלי של ערכת הנתונים במיקרוסקופPSFmode הקובץ. py"הגדר את הערך הרצוי עבור גודל פיקסלים ואורך גל פליטה generate_batch_parallel האש.

py"הגדר את קבוצת הפרמטרים השלישית לגבי ערכת נתוני הפלט, כגון גודל תמונות הפלט, מספר האריחים בכל תמונה ומספר התמונות הכולל בקובץ generate_batch_parallel. py"הפעל את הקובץ generate_batch_parallel. py"כדי להתחיל את הסימולציה.

כדי לקבל את התמונה בגודל הסופי, צור עותק של התיקיה בשם 5. הכנת נתונים והדרכה/הכנת נתונים"וניווט לתוכו. הגדר את הפרמטרים של מספר האצווה ומספר התמונות לכל אצווה, טווח הרעש שיתווסף בקובץ Data_generator.

py"הפעל את הקובץ Data_generator. py"צור את תמונות המונטאז'. העתק את התיקיות בשם image"and segment" לתיקיית datatrain/train".

סגמנטציה מבוססת למידה עמוקה. לאימון מודל הפילוח להגדרת תמונת מיקרוסקופ חדשה, יש לנווט לתיקייה בשם train"ולהגדיר את הפרמטרים של גודל באך, מודל עמוד השדרה של הסגמנטציה, מספר התקופות וקצב הלמידה לאימון בתוך הקובץ בשם train_unet. py"הפעל את הקובץ train_unet.

py"כדי להתחיל את האימון. תהליך האימון מציג את המדד להערכת מודל הפילוח בערכת האימות המדומה. לאחר השלמת האימון, המודל נשמר best_model.

h5"בתיקייה בשם train"כדי לבדוק את המודל על תמונות המיקרוסקופ, יש לפצל את התמונות לגודל הרצוי על ידי מודל הרכבת. לשם כך, נווט אל התיקיה בשם 6. הכן נתוני בדיקה"והעתק את הקבצים בפורמט PNG של הנתונים לתיקייה PNG" והפעל את הקובץ split_1024_256.

py"פעולה זו תיצור חיתוך בגודל 256 על 256 של התמונות בתיקיית הנתונים. כדי לפלח את חיתוך התמונה, עבור אל התיקיה בשם 7. בדוק סגמנטציה"והפעל את הקובץ בשם מקטע.

py"לאחר הגדרת שם הדגם שנשמר לשימוש. התמונות המקוטעות נשמרות בתיקיית הפלט. ניתוח מורפולוגי.

מקם את הקובץ בשם make_montage. py"לתוך התיקייה בשם 7. בדוק סגמנטציה"והפעל את הקובץ כדי לתפור את הפלט המקוטע בחזרה לגודל המקורי של התמונה.

צור תיקיה חדשה בשם 9. ניתוח מורפולוגי"בתיקיית המקור ולנווט לתוכה. התקינו את ספריות הסקאן והים באמצעות הפקודה pip install seaborn skan"מסכות הפילוח עוברות שלד באמצעות ספרייה בשם skan"כדי לאפשר ניתוח הטופולוגיה של המיטוכונדריה הבודדת.

מקם את הקובץ בתיקיה 9. ניתוח מורפולוגי"סדרו את התמונות של קבוצות שונות של הניסוי לתיקיות שונות בתוך התיקייה 7. סגמנטציה של בדיקה"הפעל את הקובץ כדי ליצור עלילות לניתוח. תוצאות.

הניתוח הכמותי שיבוצע תלוי בשאלות המחקר או בהשערה. בניסוי שלנו, התעניינו בשלוש המורפולוגיות השונות של המיטוכונדריה, כלומר נקודות"סיביות מיטוכונדריה קטנות, מוטות דמויי סיבים או מחרוזת כמו מיטוכונדריה, ורשתות מרובות הסתעפויות"כדי לזהות את המורפולוגיה, אנו תחילה שלד את פלט הסגמנטציה ומנתח את קישורי הענפים של המעמדות השונים. אנו מראים את תוצאות הניתוח עבור שתי קבוצות התאים המותאמים לגלקטוזים, קבוצת הביקורת וקבוצת הטיפול ב-CCCP.

אנו רואים עלייה משמעותית באורך הענף הממוצע של נקודות, וזה צפוי, בהתחשב בנפיחות המיטוכונדריה לעבור כאשר נחשפים CCCP. אחוז המיטוכונדריה באורכים בודדים של מוטות ומחלקות רשת מופחת באופן משמעותי ביחס לבקרה כאשר התאים טופלו ב- CCCP, ובכך לאמת את ההשערה שלנו. תרחיש מאתגר לשיטה שלנו הוא כאשר התמונה עמוסה במיטוכונדריה צפופה.

הצבע הוורוד מציין את המיטוכונדריה היחידה הארוכה ביותר שזוהתה בתמונה, אשר נגרמת עקב השגיאה המוגברת בתוצאות הסגמנטציה. מקרי כשל אלה יכולים להיות מזוהים על ידי שליטה על אורכי המיטוכונדריה ושימוש באופרטורים מורפולוגיים. בעוד שהיישום שלנו הוא דוגמה לאופן שבו ביצענו ניתוח של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית, אנו מאמינים כי ניתוח כזה ושאלות מחקר סביבו יכולים להיות מנוסחים עבור היבטים שונים של mitophagy וניסויים ביולוגיים קשורים.