ניטור שינויים בתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי בעת זיהום ויראלי באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה

פרוטוקול זה איפשר זיהוי מתמשך של השפעה חולפת בצורה של כמה שינויים מורפולוגיים במהלך זיהום ויראלי, כגון ניתוק וציפה של תאים דבקים. פרוטוקול זה איפשר גישה לא פולשנית ולא עתירת עבודה לניטור רציף של שינויים מורפולוגיים בתאים ולכידת השפעות חולפות כמו דליפת כלי דם שעלולה להחמיץ בבדיקת נקודות קצה. פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח שינויים בשלמות כלי הדם של קווי תאים אחרים במערכי ניסוי שונים אם התאים הם תאים דבקים.

לאחר הכנת HUVECs, הפעל את יישום תוכנת RTCA על ידי לחיצה כפולה על הסמל בשולחן העבודה. הקלד את שם המשתמש והסיסמה בחלון ההתחברות. הניחו צלחת נגדי RTCA 96 באר כאשר באר A1 פונה פנימה לתוך תחנת RTCA הממוקמת באינקובטור תרביות התא.

לאחר מכן עבור אל כרטיסיית הערות הניסוי של תוכנת RTCA והקלד את שם הניסוי, המספר הסידורי של המכשיר וסוג המכשיר. בכרטיסיית הפריסה תחת כרטיסיית התא של תוכנת RTCA, סמן את כל הבארות ולחץ לחיצה ימנית על הבארות המודגשות כדי לוודא שכל הבארות מופעלות. לאחר מכן, פתח את הכרטיסייה לוח זמנים של תוכנת RTCA.

לחץ על Step_1 והגדר את הניקוי ל- 10 ואת מרווח הזמן ל- 30 שניות. לאחר מכן לחץ על התחל המשך בפינה השמאלית העליונה של התוכנה כדי להתחיל בריצת האימות. לאחר ההפעלה, פתח את הכרטיסיה אינדקס תאים כדי לבדוק את הנתונים.

כל ערכי אינדקס התא צריכים להיות קטנים מ- 0.063. לאחר מכן בדוק את נתוני הסריקה הגולמיים בחלק התחתון של כרטיסיית אינדקס התא לאיתור תבניות ערכים חוזרות כמתואר בכתב היד. כדי לסיים את הפעלת האימות, לחץ על צלחת ובחר צלחת שחרור.

הסר את צלחת נגדי RTCA 96 באר מתחנת RTCA. כדי לקבל קריאת רקע על RTCA, לשטוף את צלחת קולגן סוג אחד מצופה זהב מיוחד מיקרואלקטרודה פעמיים עם 60 מיקרוליטר לכל באר של HBSS. השליכו את HBSS הנותר, והוסיפו 50 מיליליטר לכל באר של מטריצה חוץ-תאית.

לאחר מכן הניחו את הצלחת בתחנת RTCA הממוקמת בחממת תרביות התאים כאשר באר A1 פונה פנימה. בכרטיסיה הערות exp של תוכנת RTCA, הקלד את שם הניסוי, המספר הסידורי של ההתקן וסוג ההתקן. נווט אל כרטיסיית התא של תוכנת RTCA ובחר בכרטיסיה פריסה.

סמן את הבארות שבהן יש להשתמש, ולחץ לחיצה ימנית על הבארות המסומנות כדי לוודא שכל הבארות מופעלות. עכשיו עבור אל הכרטיסייה לוח הזמנים של תוכנת RTCA. לחץ על Step_1 ולחץ על התחל או המשך בפינה הימנית העליונה כדי לקבל קריאת רקע.

הצלחת מוכנה כעת לזריעת תאים והוצאתם מתחנת RTCA. לאחר מכן, זרעו 10 עד התאים הרביעיים לכל באר של HUVECs בלוח מיקרואלקטרודות הזהב עם 50 מיקרוליטר לכל באר של תווך מותנה. החזירו את הצלחת לתחנת RTCA הממוקמת באינקובטור תרביות התא, כאשר ה-A1 פונה היטב פנימה.

לאחר מכן, בכרטיסייה לוח זמנים של התוכנה, לחץ על הוסף שלב בפינה השמאלית העליונה. לחץ על Step_2. שנה את הניקוי ל- 601, את מרווח הזמן לשתי דקות ולחץ על החל.

לחץ על Step_2 ולחץ על התחל או המשך בפינה השמאלית העליונה של התוכנה. לאחר 20 שעות של דגירה, כאשר ערכי אינדקס התא בכרטיסיית גרף הבאר מראים מישור, הצלחת מוכנה לזיהום. בכרטיסייה לוח זמנים של תוכנת RTCA, לחץ על בטל שלב.

הצלחת מוכנה כעת להסרה מתחנת RTCA. כדי להדביק את HUVECs, שלפו את מלאי נגיף הזיקה מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. לדלל את מלאי וירוס זיקה עם מטריצה תאית ללא סרום בצינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר כדי להשיג מכפלות של זיהום של 0.1 ואחד.

לאחר מכן, השליכו את המדיום המותנה מכל באר, ושטפו כל באר עם 60 מיקרוליטר HBSS תוך שימוש בצד הבאר. הוסף 40 מיקרוליטר של דגימת וירוס מדולל לתוך הבאר, החל מהדילול הגבוה ביותר לנמוך ביותר, באמצעות הצד של הבאר. לדגור על הצלחת באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר ספיגת הנגיף.

סובבו את הצלחת חמש פעמים כל 15 דקות כדי לאפשר ספיגת וירוסים בכל שכבת התא. לאחר שעה של דגירה, להסיר ולהשליך את תרחיף הנגיף מהריכוז הנמוך ביותר לגבוה ביותר. לשטוף את התאים הנגועים פעמיים עם 60 מיליליטר של HBSS.

לכסות את הבארות עם מטריצה תאית בתוספת 2% FBS. עבור בארות הבקרה החיוביות, לדלל את התרומבין ב -20 יחידות למיליליטר עם מטריצה חוץ-תאית בתוספת 2% FBS, ולכסות את הבארות עם תרומבין המכיל תווך מטריצה חוץ-תאי, באמצעות הצד של הבאר. כעת לחץ על הכרטיסייה לוח זמנים והוסף שלב בפינה השמאלית העליונה.

נווט אל Step_3 ושנה את הטאטוא ל- 3, 601 ואת מרווח הזמן לשתי דקות. לחץ/י על ״החל״ ולאחר מכן לחץ/י על ״אישור״ בחלון הקופץ. הניחו את צלחת מיקרואלקטרודת הזהב המיוחדת הנגועה עם באר A1 הפונה פנימה לתחנת RTCA הממוקמת בחממת התרבית.

לבסוף, לחץ על Step_3 ולחץ על התחל המשך בפינה השמאלית העליונה של התוכנה. ערך אינדקס התאים של HUVECs שנדבקו בנגיף זיקה P6-740 במכפיל זיהום של 0.1 החל לרדת לאחר 15 שעות לאחר ההדבקה, בהשוואה לבקרת הזיהום השלילית. ה- HUVECs שנדבקו במינון גבוה יותר של נגיף זיקה P6-740 בריבוי הדבקה של אחד הראו ירידה באינדקס התאים לאחר 11 שעות לאחר ההדבקה.

לאחר 24 שעות לאחר ההדבקה, חלה ירידה של 5% ו-7% בערך אינדקס התאים המנורמל כאשר תאי האנדותל נדבקו במכפיל זיהום של 0.1 ואחד בהתאמה. ירידה של 50% בערך אינדקס התאים המנורמל נרשמה 96 שעות לאחר ההדבקה ו-66.75 שעות לאחר ההדבקה במכפיל הדבקה של 0.1 ואחד בהתאמה. ערך אינדקס התאים המנורמל הגיע לנקודה הנמוכה ביותר שלו 107 שעות לאחר ההדבקה, עם ירידה של 51% ו -60% עם ההדבקה במכפיל זיהום של 0.1 ואחד בהתאמה.

ערך אינדקס התאים המנורמל נמצא כבעל עלייה של 4% ו-13% מ-107 שעות לאחר ההדבקה ואילך ועד סוף הניסוי ב-168 שעות לאחר ההדבקה. לפני כל ניסוי RTCA, אימות נגד הפועל באמצעות צלחת RTCA 96 באר חיוני כדי להבטיח שכל חיישן ביולוגי עובד היטב כדי לייצר ערכי אינדקס תאים אמינים.