Name: ניטור שינויים בתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי בעת זיהום ויראלי באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: חקור שינויים מורפולוגיים בתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVECs) במהלך זיהום ויראלי באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת (RTCA). שיטה זו מאפשרת מעקב רציף ולא פולשני אחר תופעות חולפות כמו ניתוק תאים ודליפה וסקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה קיבל תמיכה ממשרד ההשכלה הגבוהה מלזיה במסגרת תוכנית מרכז המצוינות למוסדות גבוהים (HICoE) (MO002-2019) ומימון במסגרת תוכנית מענקי המחקר לטווח ארוך (LRGS MRUN שלב 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

1. הכנת תאים
<ol><li>הכנת HUVECs<ol><li>לגדל 7.5 x 105 תאי HUVEC / מ"ל בבקבוק תרבית תאים בגודל 75 ס"מ2 (מצופה בקולגן מסוג 1 של 20 מיקרוגרם/מ"ל) המכיל 12 מ"ל של תווך תאי אנדותל (ECM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), תוסף גדילת תאי אנדותל 0.01% (ECGS) המכיל גורמי גדילה, הורמונים וחלבונים הדרושים לתרבית HUVECs, ו-0.01% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S). דגרו על התאים באינקובטור של תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 (איור 1).</li>
	</ol></li>
</ol>2. הגדרת ניסוי RTCA
<ol><li>אימות נגד פועל על RTCA<ol><li>לחץ פעמיים על סמל תוכנת RTCA בשולחן העבודה כדי להפעיל את היישום. יופיע חלון התחברות, הקלד את שם המשתמש והסיסמה כדי להתחבר.</li>
		<li>הניחו צלחת נגדי RTCA בעלת 96 בארות כאשר באר A1 פונה פנימה לתוך תחנת RTCA הממוקמת באינקובטור תרביות התא.</li>
		<li>בכרטיסיה הערות הוצאה של תוכנת RTCA, הקלד את שם הניסוי, SN ההתקן וסוג ההתקן (לוחית QC).</li>
		<li>בכרטיסיה פריסה תחת הכרטיסייה תא של תוכנת RTCA, סמן את כל הבארות ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הבארות המסומנות כדי לוודא שכל הבארות מופעלות (מעומעמות).</li>
		<li>בכרטיסיה לוח זמנים של תוכנת RTCA, לחץ על Step_1. הזן מטאטא: 10, ומרווח: 30 שניות. לחץ על החל. לחץ על התחל/המשך בפינה הימנית העליונה של התוכנה כדי להתחיל בהפעלת האימות. הערה: ודא שחיבור הבארות לתחנת RTCA תקין על ידי התבוננות ב"לוח סרוק. חיבורים בסדר" בתחתית העמוד.</li>
	</ol></li>
	<li>הפעלת אימות נגד לניתוח נתונים<ol><li>בכרטיסיה אינדקס תאים , בדוק את הנתונים עם השלמת ההפעלה. כל ערכי CI צריכים להיות קטנים מ- 0.063.</li>
		<li>בחלק התחתון של הכרטיסיה אינדקס תאים , בדוק את נתוני הסריקה הגולמיים. נתוני הסריקה הגולמיים צריכים להציג תבניות ערכים חוזרות ונשנות של 40.0 ± 2.0 (שורות A ו- H), 67.5 ± 2.5 (שורות B ו- G), 93.6 ±- 2.9 (שורות C ו- F) ו- 117.6 ± 3.2 (שורות D ו- E).</li>
		<li>כדי לעצור את הפעלת האימות, לחץ על צלחת > צלחת שחרור. לוחית נגדי RTCA בעלת 96 בארות מוכנה כעת להסרה מתחנת RTCA.</li>
	</ol></li>
	<li>קבלת קריאת רקע על RTCA<ol><li>שטפו את צלחת המיקרואלקטרודות המוזהבת המיוחדת המצופה קולגן מסוג 1 (מצופה בקולגן מסוג 1 של 20 מיקרוגרם/מ"ל) עם 60 מיקרוליטר/באר של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS; עם סודיום ביקרבונט, ללא סידן כלורי ומגנזיום גופרתי) פי 2.</li>
		<li>השליכו את ה-HBSS הנותרים והוסיפו 50 μL/well של ECM. הניחו את לוחית מיקרואלקטרודת הזהב המיוחדת המכילה ECM כאשר באר A1 פונה פנימה לתחנת RTCA הממוקמת באינקובטור תרביות התא.</li>
		<li>בכרטיסייה Exp Notes של תוכנת RTCA, הקלד את שם הניסוי, SN ההתקן וסוג ההתקן (תבנית 96 באר).</li>
		<li>בכרטיסייה פריסה תחת הכרטיסייה תא של תוכנת RTCA, סמן את הבארות שישמשו ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הבארות המסומנות כדי לוודא שכל הבארות מופעלות (מעומעמות).</li>
		<li>בכרטיסייה לוח זמנים של תוכנת RTCA, לחץ על Step_1 ולחץ על התחל/המשך בפינה השמאלית העליונה של התוכנה כדי לקבל קריאת רקע. הערה: ודא שהחיבור של הבארות נכון על ידי התבוננות "לוח סרוק. חיבורים בסדר" בתחתית העמוד.</li>
		<li>לאחר קבלת קריאת הרקע, לוח מיקרואלקטרודות הזהב המיוחד מוכן כעת לזריעת תאים ומוכן להסרה מתחנת RTCA.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת HUVEC בלוח הזהב-מיקרואלקטרודות המיוחד<ol><li>זרעו את HUVECs בלוח המיקרואלקטרודות הזהב המיוחד עם 50 μL / well של מדיום מותנה, 1 x 104 תאים / באר (מדיום מותנה: ECM בתוספת 10% FBS, 0.01% ECGS, ו 0.01% P / S). הניחו את הצלחת בחזרה לתחנת RTCA כאשר באר A1 פונה פנימה לדגירת לילה באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2. הערה: בוצעה ספירת תאים בתרחיף התא עם מקדם דילול של שניים באמצעות המוציטומטר.</li>
		<li>בכרטיסיה לוח זמנים , לחץ על הוסף שלב בפינה הימנית העליונה. לחץ על Step_2 ושנה את המטאטא: 601, ומרווח: 2 דקות. לחץ על החל. לחץ על Step_2 ולחץ על התחל/המשך בפינה השמאלית העליונה של התוכנה.</li>
		<li>לאחר 20 שעות של דגירה וכאשר ערכי CI בכרטיסייה גרף באר מראים מישור, הצלחת מוכנה לזיהום. בכרטיסיה לוח זמנים של תוכנת RTCA, לחץ על בטל שלב.</li>
		<li>לוחית מיקרואלקטרודת הזהב המיוחדת מוכנה כעת להסרה מתחנת RTCA לשלבים הבאים.</li>
	</ol></li>
</ol>3. זיהום ויראלי ב- HUVECs
<ol><li>דילול וירוסים<ol><li>תרבות המניות ZIKV נשמרת ב -80 ° C. עבור מחקר זה, הסר את מלאי הנגיף שנשמר בבקבוקונים הקריוגניים ודלל את מלאי ZIKV עם ECM ללא סרום בצינורות צנטריפוגות של 1.5 מ"ל כדי להשיג ריבוי זיהומים (MOIs) של 0.1 ו -1. הערה: מלאי ZIKV הוכן בעבר על ידי ביצוע ריבוי בתאי Vero וקצירת ZIKV supernatant34.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהום של monolayer התא<ol><li>הסר והשלך את המדיום המותנה (ECM בתוספת 10% FBS, 0.01% ECGS ו- 0.01% P/S) מכל באר. יש לשטוף כל באר עם 60 μL של HBSS 2x. הכנס את HBSS בעזרת הצד של הבאר; אל תירה בתא monolayer.</li>
		<li>עבודה מהדילול הגבוה ביותר לנמוך ביותר, להוסיף 40 μL של כל דגימת וירוס מדולל ECM ללא סרום לתוך הבאר. לשלש את הבאר עבור כל דילול ולשמור על שש בארות ללא זיהום (שליטה שלילית ושליטה חיובית טרומבין). אל תירה את monolayer התא; במקום זאת, מוסיפים את הנגיף המדולל בעזרת הצד של הבאר. השתמשו בקצה פיפט טרי לכל החדרה. הערה: תרומבין נבחר כבקרה חיובית מכיוון שהוא יכול להגדיל את חדירות האנדותל של HUVECs במהירות.</li>
		<li>יש לדגור על הצלחת באינקובטור של תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 כדי לאפשר ספיחת וירוסים. מרחו את הצלחת 5 פעמים כל 15 דקות כדי לאפשר ספיחת וירוסים בכל שכבת התא.</li>
	</ol></li>
	<li>תוספת של מדיום תרבית תאים שכבת-על<ol><li>לאחר שעה אחת של דגירה, להסיר ולהשליך את ההשעיה וירוס מן הריכוז הנמוך ביותר לגבוה ביותר.</li>
		<li>לשטוף את התאים הנגועים עם 60 μL של HBSS 2x. לכסות את הבאר עם ECM בתוספת 2% FBS. עבור בארות הבקרה החיוביות, לדלל את התרומבין ל 20 U/mL עם ECM בתוספת 2% FBS, ולכסות את הבארות עם מדיום ECM המכיל טרומבין. אל תירה את monolayer התא; במקום זאת, הוסיפו מדיה בשכבת-על בעזרת הצד של הבאר.</li>
	</ol></li>
	<li>מיקום לוחית מיקרואלקטרודת הזהב המיוחדת הנגועה בחזרה לתחנת RTCA<ol><li>בכרטיסיה לוח זמנים , לחץ על הוסף שלב בפינה הימנית העליונה. לחץ על Step_3 ושנה את המטאטא: 3,601 ומרווח: 2 דקות. לחץ על החל.</li>
		<li>לחץ על OK בחלון המוקפץ שמופיע. הניחו את לוחית מיקרואלקטרודת הזהב המיוחדת הנגועה עם באר A1 הפונה פנימה לתחנת RTCA הממוקמת באינקובטור תרביות התא.</li>
		<li>לחץ על Step_3 ולחץ על התחל/המשך בפינה השמאלית העליונה של התוכנה.</li>
	</ol></li>
</ol>4. ניתוח נתונים וייצוא נתונים
<ol><li>הוספת מידע ניסיוני של כל באר<ol><li>בכרטיסיה פריסה , לחץ על הכרטיסיה תא (איור 2A). כדי להזין את פרטי תא היעד ולקבוע את סוג הבאר עבור כל באר, סמן את הבאר והקלד את שם תא היעד, המספר והצבע בתחתית התוכנה. לחץ על החל (איור 2B).</li>
		<li>כדי לבחור ולקבוע את סוג הבאר עבור כל באר בכרטיסיה תא , סמן את הבאר, בחר סוג באר (מדגם, בקרה חיובית או בקרה שלילית) ולחץ על הגדר.</li>
		<li>בכרטיסייה פריסה , לחצו על הכרטיסייה טיפול (איור 2C). כדי להזין את פרטי הטיפול, סמן את הבאר והקלד את שם הטיפול, ריכוז הטיפול, היחידה והצבע. לחץ על החל (איור 2D).</li>
		<li>כדי לבחור ולקבוע את סוג הבאר עבור כל באר בכרטיסיה טיפול , סמן את הבאר, בחר סוג באר (דגימה, בקרה חיובית או בקרה שלילית) ולחץ על הגדר. הערה: עבור כל בחירה, ניתן להדגיש בארות מרובות בו-זמנית.</li>
	</ol></li>
	<li>נורמליזציה של ערך CI<ol><li>לחץ לחיצה ימנית משמאל לכרטיסייה ניתוח נתונים ובחר אינדקס תאים מנורמל מהתיבה הנפתחת ציר Y (איור 3A). באזור ציר X בתחתית, בחרו את הזמן המנורמל כנקודת הזמן האחרונה שנמדדה שבה לוחית מיקרואלקטרודת הזהב המיוחדת הוסרה לצורך זיהום (איור 3B). הערה: תהליך הנורמליזציה המבוצע על ידי התוכנה מסיר את רוב השונות בשל ההבדלים בזריעה ובהתקשרות היטב, כל עוד נקודת הנורמליזציה שנבחרה היא לפני הוספת הנגיף ו / או הטיפול. לפיכך, נקודת הזמן האופטימלית לנורמליזציה צריכה להיות נקודת הזמן האחרונה לפני הוספת הנגיף ו / או הטיפול. ניתן לבדוק את נקודת הזמן לנרמול בכרטיסיה לוח זמנים תחת Step_2. הזמן הכולל המצוין הוא נקודת הזמן לנורמליזציה (איור 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>התוויית נתונים שהושגו באמצעות תוכנת RTCA<ol><li>בכרטיסייה ניתוח נתונים , בחר את הבארות שיש להוסיף לגרף על-ידי סימון הבארות ולחיצה << הוסף. אינדקס התאים המנורמל כנגד גרף הזמן מוכן כעת להעתקה ולייצוא. הקפד/י לסמן את תיבת הסימון ״ממוצע ״.</li>
	</ol></li>
	<li>ייצוא נתונים באמצעות תוכנת RTCA<ol><li>בפינה השמאלית העליונה של תוכנת RTCA, לחץ על Plate > Export Experiment Info.... סמן את התיבה כדי לבחור את הנתונים לייצא. לחץ על אישור. הערה: ניתן לייצא נתונים גולמיים (ערכי CI גולמיים) כאשר Cell index > All מסומן.</li>
		<li>בחר את התיקיה כדי לשמור את קובץ הייצוא. לחץ על שמור. יופיע חלון מוקפץ המציין ייצוא של מידע ניסיוני. לאחר סיום הייצוא, יופיע חלון נוסף המציין שמידע הניסוי המיוצא מוכן לצפייה.</li>
	</ol></li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

זיהום נגיפי ציטוקידי בתאים מתירניים קשור בדרך כלל לשינויים משמעותיים במורפולוגיה של התא וביוסינתזה36. השינויים המורפולוגיים התאיים הנגרמים על ידי הנגיף, כגון התכווצות תאים, הגדלת תאים ו / או היווצרות סינסיטיה, ידועים גם בשם השפעות ציטופתיות (CPEs), האופייניות לזיהומים ויראליים מסוימים37. ב-ECs, ה-CPE תואר כהרס התאים והתמוטטות הצמתים הצפופים בין כל EC, ובכך גרם להתמוטטות מחסום האנדותל38,39. CPEs ב- HUVECs יכולים להיו...

תאי אנדותל (ECs) מצפים את פני השטח הפנימיים של כל כלי הדם והלימפה. הם מחוברים על ידי דבקים, צמתים פער הדוק, יצירת מחסום חדיר למחצה בין הדם או הלימפה לבין הרקמות שמסביב 1,2. צמתי תאי האנדותל השלמים הם קריטיים לוויסות ההובלה של מקרומולקולות, מומסים ונוזלים, החיוניים לפעילות הפיזיולוגית של הרקמות והאיברים המתאימים3. מחסום האנדותל הוא דינמי ומווסת על ידי גירויים ספציפיים4. הפרעה או אובדן של תפקוד מחסום האנדותל הוא סימן היכר של פתופיזיולוגיה של מחלות בדלקת חריפה וכרונית בפתוגנזה של מחלות רבות 5,6,7, כולל זיהום ויראלי 8,9,10,11. עבור flaviviruses, נמצא כי חלבון לא מבני NS1 יכול לשנות את חדירות האנדותל, למשל, באמצעות הפרעה של שכבת האנדותל דמוי glycocalyx כתוצאה של ביטוי מוגבר והפעלה של cathepsin L, sialidases, ו endoglycosidase heparinase9. במצב המחלה, שלמות החד-שכבה של האנדותל נפגעת, וצמתים בין תאים לתאים משתבשים, מה שעלול להוביל לפגיעה אנדותלותפקוד לקוי 12 ובסופו של דבר לביטויים פתולוגיים נרחבים על פני מערכות איברים מרובות13,14. זיהום ויראלי של ECs גורם לשינויים במסלולי האיתות התאיים ובפרופיל ביטוי הגנים התאיים, אשר עשויים להשפיע על תפקודי מחסום הנוזל, לגרום לשיבוש של ECs, ולגרום דליפת כלי דם10,15. זיהום בנגיף זיקה (ZIKV) של ECs נמצא כמשבש את שלמות הצומת הגורמת לשינויים בחדירות כלי הדם ומובילה לתפקוד לקוי של מחסום האנדותל, וכתוצאה מכך דליפת כלי דם10,15. מחקרים הראו כי ZIKV קשור למומים מולדים חמורים; עם זאת, לא הרבה ידוע על המנגנון המדויק שבו זה קורה16,17. לכן, הבנת השינויים במחסום האנדותל במהלך זיהום היא קריטית להבנת מנגנון המחלה.
ECs משמשים כיום כמערכת מודל כלי דם ניסיונית חשובה במבחנה עבור תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים 18,19,20,21. תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs) שימשו באופן נרחב כמערכת תאים ראשונית, לא אימורטלית, לחקר אנדותל כלי הדם וביולוגיה של כלי הדם במבחנה 22,23,24,25. HUVECs בודדו לראשונה לתרבית חוץ גופית בתחילת שנות השבעים מווריד הטבור של חבל הטבור האנושי26. ל-HUVECs יש מורפולוגיה דמוית אבן מרוצפת שניתנת בקלות להתרבות במעבדה. בשל מתח גזירה לאחר שנשמר במשך תקופות ארוכות במצב המפגש, התארכות צורת התא הוא ציין. HUVECs יכול להיות מאופיין על ידי נוכחות של גופים Weibel ו Palade (WPB), שלפוחיות pinocytic, כמויות קטנות של סיבים הממוקם ליד הגרעין, מיטוכונדריה עם צורות צינוריות אשר לעתים רחוקות להראות השלכות, גרעין אליפסואידי עם תבנית גרגירית עדינה של כרומטין, ואחד עד שלושה גרעינים נוכחים בכל גרעין27. למרות ש- HUVECs מראים מאפיינים מורפולוגיים רבים, זיהוי HUVECs אינו יכול להיות מושג על ידי בדיקה אופטית בלבד. מבחנים, כגון צביעה אימונופלואורסצנטית של אנדותל כלי דם (VE)-cadherin, משמש בדרך כלל לניטור שלמות כלי הדם ב- HUVECs 28,29,30,31.
מחקר זה מתאר את פרוטוקול ניתוח התאים בזמן אמת (RTCA) של זיהום HUVECs. מערכת RTCA משתמשת בלוחות מיוחדים מצופים זהב המכילים מיקרואלקטרודות המספקות משטח מוליך לחיבור התא. כאשר התאים נצמדים למשטח המיקרואלקטרודות, נוצר מחסום המעכב את זרימת האלקטרונים דרך המיקרואלקטרודות. מדידת העכבה הנוצרת על-ידי מיקרואלקטרודות יכולה לשמש להשגת מידע על תהליכים תאיים מסוימים, כולל התקשרות לתאים, התפשטות ונדידה32. הבדיקה המדווחת היא בדיקה תאית מבוססת עכבה אשר, יחד עם מנתח תאים בזמן אמת, מספקת מדידה רציפה של התפשטות תאים חיים, שינויים במורפולוגיה (כגון התכווצות תאים) ואיכות התקשרות התא באופן לא פולשני וללא תוויות. במחקר זה, מנתח תאים בזמן אמת משמש לניטור שלמות האנדותל ושינויים מורפולוגיים של HUVECs במהלך זיהום ZIKV. בקצרה, המכשיר מודד את זרימת האלקטרונים המועברת בלוחות מיקרוטיטר מיוחדים מצופים מיקרואלקטרודות זהב בנוכחות מדיום תרבית (תמיסה מוליכה חשמלית). היצמדות התא או שינויים במספר התא ובמורפולוגיה מפריעים לזרימת האלקטרונים וגורמים לשינויים בעכבה שיכולים להילכד על-ידי המכשיר (איור משלים 1). ההבדל בין צמיחת HUVEC, התפשטות והיצמדות לפני ואחרי זיהום ZIKV נרשם בזמן אמת על ידי אות עכבה חשמלית ולאחר מכן מתורגם לערך אינדקס התא (CI). ערך CI מלפני ההדבקה משמש כבסיס לנורמליזציה של ערך CI. השינויים בערכי CI משקפים שינויים מורפולוגיים תאיים או אובדן היצמדות תאים עם הזיהום33. תוצאות המחקר מראות כי פרוטוקול RTCA מאפשר זיהוי של השפעות חולפות או שינויים מורפולוגיים של התא במהלך זיהום ויראלי בהשוואה לבדיקת נקודות קצה, כגון צביעה אימונופלואורסצנטית של VE-cadherin. שיטת RTCA יכולה להיות שימושית לניתוח השינויים בשלמות כלי הדם HUVEC בעת הדבקה על ידי וירוסים אחרים.

<table><tbody><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>קן</td><td>615601</td><td></td></tr><tr><td>37 מעלות; אינקובטור C עם 5% CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>75 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמות&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אנטיביוטיקה פניצילין-סטרפטומיצין (P/S)</td><td>Sciencell</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגי, Class II</td><td>Holten</td><td>HB2448</td><td></td></tr><tr><td>קולגן סוג 1</td><td>SIgma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>תוסף צמיחת תאי אנדותל (ECGS)</td><td>Sciencell</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>מדיום תאי אנדותל (ECM)</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>E-plate 96</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>05232368001</tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Sciencell</td><td>0025</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>Laboroptik LTD</td><td>נויבאואר שיפר</td><td></td></tr><tr><td>תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVECs)</td><td>Sciencell</td><td>8000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>ZEISS</td><td>מחשב נייד TELAVAL 31</td><td></td></tr><tr><td>Latitude 3520</td><td>Dell&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטה רב ערוצית (10 - 100 ומיקרו; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטה רב ערוצית (30 - 300 ומיקרו; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Reservior</td><td>Tarsons</td><td>T38-524090</td><td></td></tr><tr><td>לוחית נגד RTCA 96</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>05232350001</tr><tr><td>RTCA Software Pro (גרסה 2.6.1)</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>5454433001</tr><tr><td>פיפטות חד ערוציות (10 - 100 ומיקרו; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות חד ערוציות (100 - 1000 ומיקרו; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות חד ערוציות (20 - 200 ומיקרו; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence מנתח תאים בזמן אמת SP (דגם: W380)</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>00380601030</td><td>https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232</td></tr></tbody></table>

ניטור שינויים בתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי בעת זיהום ויראלי באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה

Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis

תאי אנדותל מצפים את פני השטח הפנימיים של כל כלי הדם והלימפה, ויוצרים מחסום חדיר למחצה המווסת את חילופי הנוזלים והמומסים בין הדם או הלימפה לבין הרקמות הסובבות אותם. יכולתו של וירוס לחצות את מחסום האנדותל היא מנגנון חשוב המאפשר הפצת וירוסים בגוף האדם. וירוסים רבים מדווחים כמשנים את חדירות האנדותל ו / או גורמים להפרעה במחסום תאי האנדותל במהלך ההדבקה, אשר מסוגלת לגרום לדליפת כלי דם. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול ניתוח תאים בזמן אמת (RTCA), המשתמש במנתח תאים מסחרי בזמן אמת כדי לעקוב אחר שלמות האנדותל ושינויים בחדירות במהלך זיהום נגיף זיקה (ZIKV) של תאי אנדותל ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). אותות העכבה שנרשמו לפני ואחרי זיהום ZIKV תורגמו לערכי אינדקס התא (CI) ונותחו. פרוטוקול RTCA מאפשר זיהוי של השפעות חולפות בצורה של שינויים מורפולוגיים התא במהלך זיהום ויראלי. בדיקה זו יכולה להיות שימושית גם לחקר שינויים בשלמות כלי הדם של HUVECs בתצורות ניסוי אחרות.

לפני ההדבקה ב-ZIKV, ה-CI שנרשם עבור החד-שכבה HUVEC בתרבית על לוחית מיקרו-אלקטרודה מיוחדת מצופה מיקרו-אלקטרודה היה מעל 8, מה שמרמז על תכונות היצמדות חזקות. יש להשליך צלחות או בארות עם מדד CI נמוך מ-8. לאחר מכן ה-HUVECs נדבקו ב-ZIKV ב-MOI של 0.1 ו-1, ועכבת התאים נרשמה במשך 7 ימים. ערך CI של HUVECs נגועים ZIKV P6-740 ב MOI של 0.1 (קו כחול בהיר) התחיל לרדת 15 שעות לאחר ההדבקה (HPI), בהשוואה בקרת זיהום שלילית (קו חום; איור 4). באשר ל- HUVECs שנדבקו במינון גבוה יותר של ZIKV P6-740 ב- MOI של 1 (קו ...

המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול לניטור השינויים בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs) במהלך זיהום ויראלי באמצעות מערכת ניתוח תאים בזמן אמת (RTCA).

Endothelial cells line the inner surface of all blood and lymphatic vessels, creating a semi-permeable barrier regulating fluid and solute exchange ...

פרוטוקול זה איפשר זיהוי מתמשך של השפעה חולפת בצורה של כמה שינויים מורפולוגיים במהלך זיהום ויראלי, כגון ניתוק וציפה של תאים דבקים. פרוטוקול זה איפשר גישה לא פולשנית ולא עתירת עבודה לניטור רציף של שינויים מורפולוגיים בתאים ולכידת השפעות חולפות כמו דליפת כלי דם שעלולה להחמיץ בבדיקת נקודות קצה. פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח שינויים בשלמות כלי הדם של קווי תאים אחרים במערכי ניסוי שונים אם התאים הם תאים דבקים.לאחר הכנת HUVECs, הפעל את יישום תוכנת RTCA על ידי לחיצה כפולה על הסמל בשולחן העבודה. הקלד את שם המשתמש והסיסמה בחלון ההתחברות. הניחו צלחת נגדי RTCA 96 באר כאשר באר A1 פונה פנימה לתוך תחנת RTCA הממוקמת באינקובטור תרביות התא.לאחר מכן עבור אל כרטיסיית הערות הניסוי של תוכנת RTCA והקלד את שם הניסוי, המספר הסידורי של המכשיר וסוג המכשיר. בכרטיסיית הפריסה תחת כרטיסיית התא של תוכנת RTCA, סמן את כל הבארות ולחץ לחיצה ימנית על הבארות המודגשות כדי לוודא שכל הבארות מופעלות. לאחר מכן, פתח את הכרטיסייה לוח זמנים של תוכנת RTCA.לחץ על Step_1 והגדר את הניקוי ל- 10 ואת מרווח הזמן ל- 30 שניות. לאחר מכן לחץ על התחל המשך בפינה השמאלית העליונה של התוכנה כדי להתחיל בריצת האימות. לאחר ההפעלה, פתח את הכרטיסיה אינדקס תאים כדי לבדוק את הנתונים.כל ערכי אינדקס התא צריכים להיות קטנים מ- 0.063. לאחר מכן בדוק את נתוני הסריקה הגולמיים בחלק התחתון של כרטיסיית אינדקס התא לאיתור תבניות ערכים חוזרות כמתואר בכתב היד. כדי לסיים את הפעלת האימות, לחץ על צלחת ובחר צלחת שחרור.הסר את צלחת נגדי RTCA 96 באר מתחנת RTCA. כדי לקבל קריאת רקע על RTCA, לשטוף את צלחת קולגן סוג אחד מצופה זהב מיוחד מיקרואלקטרודה פעמיים עם 60 מיקרוליטר לכל באר של HBSS. השליכו את HBSS הנותר, והוסיפו 50 מיליליטר לכל באר של מטריצה חוץ-תאית.לאחר מכן הניחו את הצלחת בתחנת RTCA הממוקמת בחממת תרביות התאים כאשר באר A1 פונה פנימה. בכרטיסיה הערות exp של תוכנת RTCA, הקלד את שם הניסוי, המספר הסידורי של ההתקן וסוג ההתקן. נווט אל כרטיסיית התא של תוכנת RTCA ובחר בכרטיסיה פריסה.סמן את הבארות שבהן יש להשתמש, ולחץ לחיצה ימנית על הבארות המסומנות כדי לוודא שכל הבארות מופעלות. עכשיו עבור אל הכרטיסייה לוח הזמנים של תוכנת RTCA. לחץ על Step_1 ולחץ על התחל או המשך בפינה הימנית העליונה כדי לקבל קריאת רקע.הצלחת מוכנה כעת לזריעת תאים והוצאתם מתחנת RTCA. לאחר מכן, זרעו 10 עד התאים הרביעיים לכל באר של HUVECs בלוח מיקרואלקטרודות הזהב עם 50 מיקרוליטר לכל באר של תווך מותנה. החזירו את הצלחת לתחנת RTCA הממוקמת באינקובטור תרביות התא, כאשר ה-A1 פונה היטב פנימה.לאחר מכן, בכרטיסייה לוח זמנים של התוכנה, לחץ על הוסף שלב בפינה השמאלית העליונה. לחץ על Step_2. שנה את הניקוי ל- 601, את מרווח הזמן לשתי דקות ולחץ על החל.לחץ על Step_2 ולחץ על התחל או המשך בפינה השמאלית העליונה של התוכנה. לאחר 20 שעות של דגירה, כאשר ערכי אינדקס התא בכרטיסיית גרף הבאר מראים מישור, הצלחת מוכנה לזיהום. בכרטיסייה לוח זמנים של תוכנת RTCA, לחץ על בטל שלב.הצלחת מוכנה כעת להסרה מתחנת RTCA. כדי להדביק את HUVECs, שלפו את מלאי נגיף הזיקה מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. לדלל את מלאי וירוס זיקה עם מטריצה תאית ללא סרום בצינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר כדי להשיג מכפלות של זיהום של 0.1 ואחד.לאחר מכן, השליכו את המדיום המותנה מכל באר, ושטפו כל באר עם 60 מיקרוליטר HBSS תוך שימוש בצד הבאר. הוסף 40 מיקרוליטר של דגימת וירוס מדולל לתוך הבאר, החל מהדילול הגבוה ביותר לנמוך ביותר, באמצעות הצד של הבאר. לדגור על הצלחת באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר ספיגת הנגיף.סובבו את הצלחת חמש פעמים כל 15 דקות כדי לאפשר ספיגת וירוסים בכל שכבת התא. לאחר שעה של דגירה, להסיר ולהשליך את תרחיף הנגיף מהריכוז הנמוך ביותר לגבוה ביותר. לשטוף את התאים הנגועים פעמיים עם 60 מיליליטר של HBSS.לכסות את הבארות עם מטריצה תאית בתוספת 2% FBS. עבור בארות הבקרה החיוביות, לדלל את התרומבין ב -20 יחידות למיליליטר עם מטריצה חוץ-תאית בתוספת 2% FBS, ולכסות את הבארות עם תרומבין המכיל תווך מטריצה חוץ-תאי, באמצעות הצד של הבאר. כעת לחץ על הכרטיסייה לוח זמנים והוסף שלב בפינה השמאלית העליונה.נווט אל Step_3 ושנה את הטאטוא ל- 3, 601 ואת מרווח הזמן לשתי דקות. לחץ/י על ״החל״ ולאחר מכן לחץ/י על ״אישור״ בחלון הקופץ. הניחו את צלחת מיקרואלקטרודת הזהב המיוחדת הנגועה עם באר A1 הפונה פנימה לתחנת RTCA הממוקמת בחממת התרבית.לבסוף, לחץ על Step_3 ולחץ על התחל המשך בפינה השמאלית העליונה של התוכנה. ערך אינדקס התאים של HUVECs שנדבקו בנגיף זיקה P6-740 במכפיל זיהום של 0.1 החל לרדת לאחר 15 שעות לאחר ההדבקה, בהשוואה לבקרת הזיהום השלילית. ה- HUVECs שנדבקו במינון גבוה יותר של נגיף זיקה P6-740 בריבוי הדבקה של אחד הראו ירידה באינדקס התאים לאחר 11 שעות לאחר ההדבקה.לאחר 24 שעות לאחר ההדבקה, חלה ירידה של 5% ו-7% בערך אינדקס התאים המנורמל כאשר תאי האנדותל נדבקו במכפיל זיהום של 0.1 ואחד בהתאמה. ירידה של 50% בערך אינדקס התאים המנורמל נרשמה 96 שעות לאחר ההדבקה ו-66.75 שעות לאחר ההדבקה במכפיל הדבקה של 0.1 ואחד בהתאמה. ערך אינדקס התאים המנורמל הגיע לנקודה הנמוכה ביותר שלו 107 שעות לאחר ההדבקה, עם ירידה של 51% ו -60% עם ההדבקה במכפיל זיהום של 0.1 ואחד בהתאמה.ערך אינדקס התאים המנורמל נמצא כבעל עלייה של 4% ו-13% מ-107 שעות לאחר ההדבקה ואילך ועד סוף הניסוי ב-168 שעות לאחר ההדבקה. לפני כל ניסוי RTCA, אימות נגד הפועל באמצעות צלחת RTCA 96 באר חיוני כדי להבטיח שכל חיישן ביולוגי עובד היטב כדי לייצר ערכי אינדקס תאים אמינים.

monitoring-changes-human-umbilical-vein-endothelial-cells-upon-viral

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זה פרוטוקול וידאו ממחישה את הבידוד של התרבות האנושית וריד הטבור בתאי האנדותל (HUVEC) מ חבל הטבור האדם. לאחר מבודד את התאים האלה יכול לשמש ב מבחני חוץ גופית אנגיוגנזה כמו Assay אופטימליים הפיברין ביד ג'ל הוכיח גם על ידי המעבדה יוז.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

טכניקה מבוסס למדוד את הפלישה של monolayer תא האנדותל על ידי תאים סרטניים חשמל התנגדות בזמן אמת

מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

בסרטון זה אנו מדגימים את התהליך של ניטור בזמן אמת של אירועים תאיים, כולל התפשטות של תאים דבקים, באמצעות בדיקת עכבה תאית. כאן, התאים הדבקים פועלים כמבודדים, מגבילים את זרימת הזרם בין האלקטרודות ומגבירים את העכבה.

ניתוח מבוסס עכבה תאית לניטור תהליכים תאיים בזמן אמת

סרטון זה מתאר טכניקה מבוססת עכבה תאית לחקר קינטיקה הישרדותית של וירוסים הגורמים להשפעות ציטופתיות. השיטה מודדת את העכבה החשמלית של תאים דבקים נגועים בנגיף שטופלו מראש במי מלח.

בדיקת קינטיקה הישרדותית מבוססת עכבה תאית להערכת הישרדות הנגיף

פרוטוקול זה מסוקר Cell-מצע חשמלי עכבת חישה, שיטה להקליט ולנתח את ספקטרום העכבה של תאי חסיד לכימות של התקשרות סלולרי, התפשטות, תנועתיות, ותגובות תאיות לגירויים תרופתיים ורעילים. זיהוי של חדירות האנדותל והערכה של קשרים בין תאים ותא מצע מודגשים.

חשמל Cell-מצע עכבת חישה לכימות של האנדותל למניעת הפצת נשק, תפקוד מחסום, ותנועתיות

תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים ראשוניים (HUVECs) גודלו למפגש בתוך מכשיר רשת מיקרופלואידי. צומת תאי האנדותל והתפלגות ה-F-actin הודגמו והשינויים בריכוז הסידן התוך-תאי וייצור תחמוצת החנקן בתגובה לאדנוזין טריפוספט (ATP) כומתו בזמן אמת ברמות תאים בודדים.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

פרוטוקולים לתרבית תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC), טרנספקציה חולפת של סמנים פלואורסצנטיים של צמיחת מיקרו-צינוריות, הדמיית תאים חיים וניתוח אוטומטי של דינמיקת צמיחת מיקרו-צינורות בין-פאזיים.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

דיווח כאן הוא פרוטוקול לכימות של חלקיקים ויראליים זיהומיות באמצעות ניטור בזמן אמת של עכבה חשמלית של תאים נגועים. יישום מעשי של שיטה זו מוצג על ידי כימות שפעת A וירוס ריקבון תחת פרמטרים פיסיקוכימיים שונים המחקים תנאים סביבתיים.

ניטור הישרדות וירוס שפעת מחוץ למארח באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת

כאן, אנו מדגימים את השימוש בעכבה חשמלית מבוססת תאים (CEI) כשיטה קלה ופשוטה מאוד לחקר זיהום ושכפול נגיף זיקה בתאים אנושיים בזמן אמת. יתר על כן, בדיקת CEI שימושית להערכת תרכובות אנטי-ויראליות.

פלטפורמת עכבה חשמלית מבוססת תאים להערכת מעכבי נגיף זיקה בזמן אמת

מבחן TCID50 המדווח כאן משתמש במדידות התנגדות בזמן אמת ללא תוויות ובמודול הווירולוגיה של המערכת כדי לנטר באופן אובייקטיבי את ההשפעות הציטופתיות הנגרמות על ידי וירוס (CPE) בזמן אמת. הבדיקה היעילה הזו מקצרת משמעותית את זמן העבודה תוך תמיכה במדידות CPE קינטיות ומהירות תפוקה גבוהה וכמותית ומאפשרת חישובי TCID50 אוטומטיים בזמן אמת.

בדיקת מינון זיהומי של תרבית רקמה (TCID50) בזמן אמת וללא תוויות באמצעות אימפדנס לכימות אוטומטי של טיטר ויראלי

חקור שינויים מורפולוגיים בתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVECs) במהלך זיהום ויראלי באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת (RTCA). שיטה זו מאפשרת מעקב רציף ולא פולשני אחר תופעות חולפות כמו ניתוק תאים ודליפה וסקולרית.

ניטור שינויים בתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי בעת זיהום ויראלי באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה

גלה סרטונים נוספים