אפיון פונקציונלי והדמיה של פיברובלסטים בוושט באמצעות תרביות אורגנואידים

אז תאי אב אינטראקציה עם הסביבה כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות. ובאמצעות פרוטוקול זה אנו יכולים להתחיל להבין כיצד פיברובלסטים משפיעים על התנהגות תאי אב הוושט. מערכת התרבית המשותפת משתמשת תחילה בתאים מבודדים המחקים את נישת האב הוושט הרגילה.

ניקוי האורגנואידים לפני הדמיה מאפשר ניתוח הן של אינטראקציות תאים והן של מורפולוגיה של אורגנואידים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על אורגנואידים הוושט האנושי. למשל שימוש בחומרים מחולים בריאים או מחולי סרטן.

בעשותנו זאת, אנו יכולים לקבל תובנות לגבי הפונקציה הספציפית של פיברובלסטים הקשורים לסרטן. דיסוציאציה של תאי אפיתל וסטרומה היא קריטית להשגת אורגנואידים בני קיימא. עיכול נמוך יגרום לתפוקת תאים נמוכה, כאשר עיכול יתר יפחית את יכולת הקיום של התאים ואת יכולת יצירת האורגנואידים.

כדי להתחיל, מכנית להסיר את השרירים החיצוניים של הוושט באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה ומלקחיים. החזיקו את הקצה הדיסטלי של הוושט המנותח באמצעות זוג מלקחיים אחד והשתמשו במלקחיים האחרים כדי לתפוס ולמשוך את השריר מהקצה הדיסטלי לקצה הפרוקסימלי של הוושט. הסר והשלך את שכבת השריר.

כדי לפתוח את הוושט לאורך, להחזיק קצה אחד של הוושט ולהכניס את הכדור של מספריים קפיץ micro דיסקציה לתוך לומן כדי למנוע נזק לרקמות. חתכו את הוושט תוך כדי אחיזה בקצה והניחו אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, או צלחת באר 24. יש לטבול את הוושט הפתוח בתרמוליזין של 0.5 מיליגרם למיליליטר ב-HBSS ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על שייקר נדנדה למשך 15 דקות.

לאחר הסרת הוושט מתמיסת התרמוליזין, הפרד בזהירות את אפיתל הוושט מן הסטרומה. מעבירים את שכבת האפיתל והסטרומה לשני צינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים של 1.5 מיליליטר עם 200 מיקרוליטר של תמיסת דיסוציאציה ב- HBSS, ומניחים אותם על קרח. טחנו את אפיתל הוושט באמצעות אזמל חד ואספו את הרקמה הטחונה מצלחת הפטרי עם 200 מיקרוליטר של תמיסת דיסוציאציה.

העבר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. מוסיפים 800 מיקרוליטר של תמיסת דיסוציאציה טרייה ומניחים את הצינור עם שכבת האפיתל הטחון על שייקר נדנדה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. פיפטה את התמיסה למעלה ולמטה בערך 20 פעמים באמצעות קצה פיפטה 200 מיקרוליטר כל 15 דקות.

חותכים את שכבת הסטרומה לחתיכות עדינות בצינור 1.5 מיליליטר המכיל 200 מיקרוליטר של תמיסת דיסוציאציה באמצעות מספריים לדיסקציה ומוסיפים 800 מיקרוליטר של תמיסת דיסוציאציה טרייה. הניחו את הצינור על שייקר נדנדה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות דגירה לתמיסת סטרומה ו-60 דקות דגירה לתמיסת אפיתל, מחזירים את התמיסה מעלה ומטה עוד 20 פעמים.

מעבירים את תמיסת הסטרומה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר, ואת תמיסת האפיתל דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגות חדשות של 1.5 מילימטר. צנטריפוגה ב-300 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ומשליכים את הסופרנאטנט על ידי הסרת עודפי הנוזל עם פיפטה של מיליליטר אחד. להשעות את הגלולה ב 200 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים.

לאחר העברת התערובת לצינור ציטומטריית זרימה, דוגרים על התאים במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מוסיפים שוב שלושה מיליליטר של 1% FBS וצנטריפוגה למשך חמש דקות. לאחר מכן להשעות מחדש את התאים במינימום של 200 מיקרוליטר של 1% FBS.

הוסף סמן אחד ל -10, 000 כתמים של תאים מתים מדוללים, חמש דקות לפני מיון פקס כדי לבודד את התאים החיים. מערבבים את תאי האפיתל הממוינים ואת הפיברובלסטים ביחס של אחד עד שניים בצינור. לאחר צנטריפוגה ב 300 גרם במשך חמש דקות, להשליך את supernatant על ידי הסרת אותו בזהירות עם פיפטה 200 מיקרוליטר.

שטפו את התאים פעם אחת על ידי השעיית הגלולה בתווך אורגנואיד בסיסי וקר וצנטריפוגה שוב למשך חמש דקות. מניחים את התאים על קרח ומשליכים את הסופרנאטנט על ידי הסרתו בזהירות עם פיפטה של 200 מיקרוליטר. השהה מחדש את התאים ב -10 מיקרוליטר של תערובת מטריצה לכל כיפה והחזיר את הצינור לקרח.

קח את צלחת 48 בארות שחוממה מראש מאינקובטור 37 מעלות צלזיוס ועשה כיפת מטריצה אחת לכל באר. באמצעות פיפטה של 20 מיקרוליטר מוסיפים 200 מיקרוליטר של תווך נמוך מחומם מראש, ER נמוך לכיפות המטריקס המכילות תרביות אורגנואידים ותווך ENR לכיפות המטריקס בהתאמה המכילות אורגנואידים אפיתליאליים בלבד. מניחים את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

ובמשך היומיים הראשונים, להשלים את המדיום עם 10 מעכב סלע micromolar. הסר את התווך האורגנואידי והוסף 200 מיקרוליטר PBS קר כקרח לכיפות המטריצה. לאחר הנחת הצלחת על קרח במשך חמש עד 10 דקות, פיפטה למעלה ולמטה ולהעביר את הפתרון לצינור 0.6 מיליליטר לא דבק.

צנטריפוגה קצרה למשך 30 עד 60 שניות ב-100G כדי לאפשר לאורגנואידים לשקוע בתחתית. לאחר הסרת עודפי הנוזל, הוסיפו PBS קר כקרח לצינור ולצנטריפוגה שוב למשך 30 עד 60 שניות. הסר את עודפי הנוזל כפי שהוצג קודם לכן וקבע את האורגנואיד עם 200 מיקרוליטר של פורמלדהיד קר 4% בתמיסת PBS למשך 30 דקות על קרח.

הניחו את הצינור זקוף כדי לאפשר לאורגנואיד לשקוע והסירו את הפורמלדהיד. הוסיפו 500 מיקרוליטר של PBS קר כדי לשטוף את שאריות הפורמלדהיד. לאחר הסרת PBS עודף, להוסיף 500 מיקרוליטר של מאגר חוסם.

הניחו את הצינור על שייקר נדנדה למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את המאגר החוסם והשהה מחדש את האורגנואידים ב -200 מיקרוליטר של חיץ חוסם עם נוגדנים ראשוניים. הניחו את האורגנואידים שוב על שייקר נדנדה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

הסר את תערובת הנוגדנים העיקרית ושטוף את האורגנואידים באמצעות 500 מיקרוליטר של 0.02% טריטון X 100 ב- PBS במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על פעולה זו שלוש פעמים. באופן דומה, הסירו את חיץ הכביסה והוסיפו 200 מיקרוליטר של נוגדן משני מצומד פלואורסצנטי למאגר החוסם למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

שטפו מחדש את האורגנואידים באמצעות 0.02% Triton X 100 ב-PBS ואחריו 500 מיקרוליטר של PBS. לאחר הסרת כל הנוזל העודף, מוסיפים 10 מיקרוליטר של תמיסת ניקוי לאורגנואידים ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הניחו מרווח ארבע בארות דביק דו-צדדי בקוטר 0.05 מ"מ על שקופית מיקרוסקופ.

מוסיפים את 10 המיקרוליטרים של תמיסת הניקוי עם האורגנואידים בבאר אחת ומניחים מחליק כיסוי על גבי הספייסר. רכוש תמונות באמצעות מערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית. תאי אב של הוושט ממוינים על בסיס ביטוי בטא ארבע ו-e-cadherin המשולב הגבוה שלהם.

תרשים ציטומטריית הזרימה המייצגת של בידוד תאי אפיתל מראה את אחוז התאים החיים מכל התאים הבודדים. אחוז תאי האב המבודדים של אינטגרין בטא ארבע ו-e-cadherin מכל התאים החיים מוצג כאן. תרשימי ציטומטריית הזרימה המוצגים כאן מייצגים את אחוז הפיברובלסטים המבודדים מסוג DPP4+ וקולטן Pdgf אלפא חיובי.

תמונות השדה הבהיר עם אורגנואידים בתרבית משותפת עם קולטן Pdgf אלפא H2 BEGFP פיברובלסטים חיוביים מראים את אות EGFP הגרעיני. תמונות השדה הבהיר של כל כיפת המטריקס ביום השישי מוצגות כאן. יעילות יצירת האורגנואידים מוצגת על ידי תמונה גרפית זו.

כל נקודה מייצגת כיפת מטריצה, והעמודה מייצגת את הממוצע של כל הנקודות לכל תנאי. השדה הבהיר ותמונות הפלואורסצנטיות של היום השישי לתרבות משותפת של אורגנואידים עם פיברובלסטים אלפא חיוביים לקולטן Pdgf מוצגים כאן. כל תמונות ההר של האורגנואידים בתרבית משותפת מראות משטחים תלת-ממדיים של האורגנואידים עם פיברובלסטים חיוביים של וימנטין עטופים סביב ובמגע הדוק עם האורגנואיד.

כל צביעת ההר של אורגנואידים מונו ואורגנואידים בתרבית משותפת עם פיברובלסטים אלפא חיוביים לקולטן Pdgf חושפת אוכלוסיות תאים בזאליות ועל-בזאליות נפרדות. יעילות יצירת האורגנואידים, כמו גם גודל האורגנואידים, מושפעים מהפיברובלסטים הכלולים בתרבית המשותפת. יש לצפות לשינויים ולתוצאות בעת שימוש בתת-אוכלוסיות פיברובלסטים שונות.

ניתן להשתמש באותה אסטרטגיה כדי לאפיין פיברובלסטים הקשורים לגידול הן בעכברים והן בבני אדם.