הדמיה של מטבוליטים שזוהו במטבוליזם המרחבי של הרפואה הסינית המסורתית באמצעות DESI-MSI

מאמר זה מתאר בעיקר שיטה חסכונית להכנת דגימות צמחים והדמיה באמצעות DESI-MSI, ויכול להתגבר על החסרונות הקשורים לרקמות יבשות, אשר נשברות בקלות כאשר חנקן נושף פנימה. השורש הוקפא על מיקרוטום הקריוסטט, ואילו העלה הוכן על ידי הטבעה, הדורשת מכונה יקרה או מאבדת את עוצמת האות. השיטה שלנו יכולה להתגבר על מגבלות אלה.

שיטה זו יכולה לשמש במטבולומיקה מרחבית של צמחים כגון הפצה ותנועה של רעלים בצמחים תחת עקה אביוטית וביוטית. כדי להתחיל, לקחת שורשים נקיים ועלים מצמח salvia miltiorrhiza בן שנתיים לחתוך ישירות בעובי חתך של כשלושה עד חמישה מילימטרים. לאחר מכן, הדביקו את הדגימה על שקופית זכוכית במיקרוסקופ הידבקות באמצעות סרט דו-צדדי.

הניחו מגלשת זכוכית נוספת במיקרוסקופ מעל הדגימה ועטפו אותה בסרט איטום כמו כריך. לאחר מכן, הקפיאו את דגימת הסנדוויץ' בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות, לאחר מכן העבירו אותה לשואב אוויר למשך שעתיים כאשר הטמפרטורה הכלואה היא מינוס 75 עד מינוס 82 מעלות צלזיוס ומד ואקום בטמפרטורה של 2.5 עד 3.7 פסקל. לצורך ניתוח, לאחר הסרת הדגימות מהאחסון הקר, הביאו אותן לטמפרטורת החדר במייבש כדי למנוע עיבוי על משטח הדגימה לפני חשיפת הדגימה ליישום מטריצה.

הטמע את הגדרת גלאי המכשירים וכיול המסה ביינון אלקטרוספריי, או במצב ESI. לבצע הגדרת גלאי באמצעות לאוצין וקפלין במים acetonitrile ביחס של אחד לאחד, ולבצע כיול מסה עם פורמט נתרן איזופרופנול מים ביחס של אחד לאחד. הוציאו את מקור ה-ESI והרכיבו את יחידת ה-DESI על ספקטרומטר המסות.

חבר את אספקת גז החנקן ליחידת DESI וכוונן את לחץ הגז לכ- 0.5 מגה-פסקל. ממלאים מזרק חמישה מיליליטר בלאוצין וצלין וחומצה פורמית במתנול מים ביחס של אחד עד תשע, ומחברים את המזרק למשאבת המזרק בעלת הביצועים הגבוהים כדי לספק ממס ליינון הכימיקלים בדגימה. לאחר מכן, חבר נימים המספקים ממס למזרק ולמרסס DESI.

הממס המספק נימים הוא נימי מידות סטנדרטיים בקוטר פנימי של 75 מיקרומטר וקוטר חיצוני של 375 מיקרומטר. הפעל את משאבת המזרק והגדר את קצב החדירה לשני מיקרוליטר לדקה כדי לקבל זרימה קבועה וריסוס של הממס. כבה את שסתום גז החנקן ולאחר כ-15 שניות הפעל אותו.

טיפה קטנה של ממס נושבת החוצה על הבמה וניתן לראות תרסיס אם זרימת הממס נמצאת במצב קבוע. לאחר מכן, התאימו את מיקום המרסס מבחינת זווית ההתזה, ציר XYZ, בליטה וגובה. השתמש בסמנים אדומים ושחורים כהפניות כדי למטב את אות ספקטרומטריית המסות כדי לקבל עוצמת אות של בערך פי 10 עד החמישית במצב רגישות.

מכיוון שהבליטה של המרסס היא הגורם המשמעותי ביותר המשפיע על עוצמת האות, התאימו את הבליטה על ידי שינוי מגן גז החנקן באמצעות מפתח ברגים חמישה מילימטר. כיוון הריסוס משפיע על איכות תמונת המסה. לכן, סובבו את המרסס עד שהתרסיס ישר.

לאחר כל השלבים הללו, ההתקנה מוכנה לניסויים ובדרך כלל יציבה למשך כשלושה שבועות של שימושיות לאחר ההתקנה הראשונית. עבור הדמיית DESI-MS, אין צורך בטיפול מקדים דגימה. עם זאת, הסר את המדיה העודפת בשקופיות במידת האפשר.

צלם תמונה של הדוגמה בשקופית. מבלי לגעת במשטח הדגימה כדי למנוע כל לכלוך, מקם את השקופית על מיקום הצלחת על במת DESI, בעלת שני מיקומי לוחות, A ו- B.השתמש בשקופיות סטנדרטיות או בשקופית מלאה כדי להתאים למיקום. שקופית מלאה יכולה להכיל עד ארבע שקופיות ולכן יש לה שטח גדול בהרבה לניסויים.

פתח את תוכנת עיבוד התמונה ההמונית בחדות גבוהה. קבעו לוח חדש בכרטיסייה 'רכישה', ובחרו את מיקום הצלחת הנכון, A או B, ואת סוג הצלחת. בעמוד בחירת תמונה, בחר את ארבע פינות השקופית ולאחר מכן התמונה תותאם באופן אוטומטי לכיוון הנכון.

כדי להגדיר את הפרמטרים של MS, בחר את סוג הניסוי כמצב DESI-MS המשמש בדרך כלל שבו רק יון האב יזוהה. לאחר מכן, בחר את הקוטביות כחיובית או שלילית מכיוון שהמכשיר יכול להשתמש רק בקוטביות אחת בניסוי. לאחר מכן החל את מצב הרגישות כדי לקבל מידע נוסף על כימיקלים בכמויות קטנות.

לאחר מכן, ציירו מלבן כדי להגדיר את אזור הסריקה בכרטיסייה 'דוגמת מילוי', והגדירו את גודל הפיקסלים באמצעות שמירה על הגדלים X ו- Y של הפיקסלים שווים. הגדר את קצב הסריקה ללא יותר מפי חמישה מגודל הפיקסל. שמור את הפרויקט וייצא גליון עבודה עבור תוכנת הרכישה של MS.

לאחר מכן, יבא את גליון העבודה לתוכנת רכישת MS ושמור אותו כרשימה חדשה לדוגמה. הקש Start Run כדי להתחיל בסריקת התמונות של MS, וניתן להוסיף תמונות מרובות לתור הניסוי על-ידי ייבוא גליונות עבודה נוספים. טען את קובץ הנתונים של הדגימה לתוכנת עיבוד התמונה ההמונית והגדר את הפרמטרים לעיבוד תמונה DESI.

מכיוון שלאוצין וצפלין שימשו למסת נעילה פנימית, ומסת המנעול היא הנקודה היחידה לזיהוי קוטביות הניסוי, חיוני לקבוע את מסת המנעול הנכונה. הגדר 556.2772 למצב חיובי ו- 554.2620 למצב שלילי. כדי לבנות רשימה של כימיקלים היעד, טען את קובץ הנתונים המעובדים כדי להציג באופן חזותי את תמונת ה- DESI של הדגימה.

לחץ על לחצן נורמליזציה כדי לנרמל את הנתונים לפי כרומטוגרפיית יונים כוללת כדי לקבל את העוצמה היחסית של כימיקל מסוים להפניה, ואז ניתן להשוות דגימות שונות זו עם זו. צייר אזור עניין, או החזר השקעה, והעתק מספר עותקים בתמונה לדוגמה. לאחר מכן בחר את כל החזר ההשקעה וייצא ניתוח רב-משתני כדי לחלץ מידע MS מכל החזר ההשקעה.

הדמיה ספקטרומטרית מסה של מקטעי השורש והעלה כולו מראה את ההתפלגות המרחבית של התרכובות שנבחרו. צבעו של כל פיקסל מייצג את העוצמה היחסית של יחס המסה לטעינה, ולכן ניתן לשייך אותו לפיזור הטבעי ולשפע יון המטבוליט לאורך הדגימה. התפלגות תרכובות המטרה, טנשנון IIA וחומצה רוזמרינית, נראית באזורים שונים של השורש.

התרכובת טנשינול A זוהתה בקטעי העלה כפרוטוקול שמטרתו שחזור, הדבר החשוב ביותר הוא לייעל את עוצמת האות על ידי התאמת מיקום המרסס במספר ממדים.