בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח

ניתוח שעתוק על תאים בודדים או סוגי תאים יכול לזהות את ההבדל העדין של ביטוי גנים להיות מוסווה על ידי הטרוגניות, שהוא כלי רב עוצמה כדי לחשוף את מנגנוני הבקרה התוך-תאיים המשוכללים. מיון תאים מופעל פלואורסצנטי ואחריו ניתוח RN-seq יכול להתבצע במצב תא בודד או סוג תא בתפזורת עם רגישות גבוהה לזיהוי תעתיק ותאימות עם גישות מולטי-אומיות אחרות. משתמשים בפעם הראשונה של פרוטוקול זה צריכים לשים לב כמה שלבים במיון protoplast והכנת ספריית RNA-seq.

יחד עם ג'ון ג'אנג, ד"ר Rongrong Xie, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלנו, יעזור להדגים את ההליך. כדי להתחיל, לשים את Arabidopsis thaliana סוג בר סמן קו זרעים פלואורסצנטי ב 20% אקונומיקה לדגור באמצעות אינקובטור מסתובב בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לעקר את הזרעים. בזמן העבודה על ספסל סטרילי, שוטפים את הזרעים שלוש עד חמש פעמים במים מזוקקים כפולים.

צלחת את סוג הבר ואת זרעי קו כתב על מדיום MS חצי חוזק עם 0.8% משקל לכל אגר נפח. לרבד את הצמחים במשך יומיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן גדל אותם אנכית במשך חמישה ימים ב 23 מעלות צלזיוס תחת 16 שעות אור ו 18 שעות חושך מחזורים.

הפשירו בעדינות את התמיסות הפרוטו-עמידות המכונות תמיסה A ותמיסה B על קרח לפני הניסוי. חותכים את השורשים מהצמחים בעזרת להב נקי או מספריים וקוצצים את השורשים לחתיכות של כ-0.5 ס"מ. השקיעו את השורשים הקצוצים במיליליטר 1.5 של תמיסה B ולאחר מכן סיבוב עדין בטמפרטורת החדר למשך שעה וחצי עד שעתיים.

מסננים את פרוטופלסטי השורש המתקבלים דרך רשת מסננת של 40 מיקרון ושוטפים את הרשת במיליליטר אחד עד שניים של תמיסה A.צנטריפוגה התסנין המשולב ב 300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה, השהו מחדש את גלולת התא ב-500 עד 600 מיקרוליטר של תמיסה A, והניחו אותה מיד על קרח. למיון תאים, העבר את תמיסת התאים המרחפים למבחנה חדשה של חמישה מיליליטר.

מלאו את מיכל נוזל הנדן ובדקו את מיכל האשפה. לאחר מכן הפעל את מיון התאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות או את מכונת FACS. בצע את שלבי הגדרת המכשיר והכיול האוטומטי במיון.

בחר את תעלות הפלואורסצנטיות והשתמש בצמח מסוג בר ללא פלואורסצנטיות כבקרה בסיסית. התאימו את שער המיון בהתאם לעוצמת הפלואורסצנטיות ולפיזור הקדמי ולפיזור הצדדי. לאחר הוספת 500 מיקרוליטר של פתרון A לתוך צינור איסוף 1.5 מיליליטר, להתחיל מיון ולאסוף 2, 000 עד 3, 000 תאים לכל צינור.

לאחר המיון, מיד מניחים את הדגימות על קרח. צנטריפוגה את צינור האיסוף המכיל את התאים ב 300 G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולהסיר את supernatant עם פיפטה. קחו שני מיקרוליטרים של תאים ממוינים ובדקו אם יש פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

אחסן את התאים הממוינים בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס אם לא נעשה בהם שימוש מיידי. למיון אינדקס תא יחיד, מקם את צלחת 96 הבארות עם הממברנה למתאם. כיילו את מיקום הצלחת כך שהטיפה תיפול בחור המרכזי של הצלחת.

הסר את הממברנה מהצלחת של 96 בארות והכנס את צלחת 96 הבארות למתאם. בחר מצב מיון של תא בודד בעת המיון. הזן את מספר היעד של התאים הממוינים כאחד והתחל במיון.

לפני תחילת הניסוי, נקו את הספסל עם מזהם פני השטח ואתנול 75%. השתמש בכל הציוד רק להכנת רצף הספרייה. לאחר הוספת מיקרוליטר אחד של תערובת טרייה מוכנה A לתוך מדגם ממוין, לטחון אותו עם מזיק סטרילי.

באמצעות מים נטולי RNAse, לפצות את נפח 14 מיקרוליטר. לאחר מכן להעביר כל דגימה לתוך 0.2 מיליליטר דק דופן PCR צינור. לאחר מכן מכינים תערובת B.מוסיפים 4.4 מיקרוליטר בתערובת B לכל צינור PCR המכיל דגימות ומערבבים בפיפטינג עדין.

לדגור על הדגימות ב 72 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לאחר הדגירה, מיד לשים את הדגימות על קרח כדי הכלאה של אוליגו dT לזנב poly-A. הכינו את תערובת תגובת השעתוק ההפוך או תערובת C ב-21.6 מיקרוליטר ממנה לכל צינור המכיל את הדגימות.

הכפיפו את הדגימות לתגובת שעתוק לאחור במכשיר PCR נפוץ לפי תוכנית התמלול ההפוך. הוסף 40.8 מיקרוליטר של תערובת תגובת קדם-הגברה טרייה שהוכנה מראש או תערובת D למוצר תגובת השעתוק לאחור והפעל את תוכנית קדם-הגברה. מחזור ההגברה יכול להיקבע על ידי PCR כמותי כאשר התגובה רק נכנסת לשלב המעריכי.

כדי לטהר את תוצרי התגובה לפני הגברה, העבר את המוצרים המוגברים מראש מצינור PCR לצינור 1.5 מיליליטר. הוסיפו 48 מיקרוליטר של חרוזי AMPure XP לכל דגימה וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג לפני הדגירה. הניחו את צינורות ה-1.5 מיליליטר המכילים את הדגימות והחרוזים על מעמד הפרדה מגנטית למשך חמש דקות.

יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט מהדגימות מבלי להפריע לחרוזים. לאחר השעייתם מחדש ב -200 מיקרוליטר של 80% אתנול, הניחו אותם על מעמד ההפרדה המגנטית למשך שלוש דקות נוספות. לאחר השלכת האתנול המכיל סופרנטנט, יש לייבש את הדגימות באוויר בצינור למשך 10 דקות.

מרחפים מחדש את החרוזים ב-20 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ודגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן הניחו אותם על מעמד ההפרדה המגנטית למשך חמש דקות. בעזרת פיפטה מעבירים 18 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מכל צינור לצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר.

לבסוף, בצע את השלבים המתוארים בטקסט כדי לאפיין את הספרייה המוקדמת, ולאחר מכן בנייה, טיהור וכימות הספרייה. קווי הסמנים הפלואורסצנטיים Arabidopsis thaliana פותחו על ידי התכה של חלבונים פלואורסצנטיים עם גנים המבוטאים באופן ספציפי בסוגי תאי מטרה או על ידי שימוש בקווי מלכודת משפרים. הפרוטופלסטים המסומנים הספציפיים לפלואורסצנטיות מוינו בהצלחה בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנטיות וסינגלטים של פיזור קדמי ופיזור צדדי.

התאים הממוינים הודגמו באמצעות שדה בהיר והדמיית פלואורסצנטיות. התוצאות המייצגות של ספריית ריצוף הרנ"א של כ -2, 000 תאי פריסייקל קוטב קסילם, תאי שורש קדמוניים רוחביים, תאי אנדודרמיס או קליפת המוח, ותאי כובע שורש רוחביים מוצגים. ספריה בגודל קטן עם פסגות דימר של פריימר או מתאם עדיין יכולה להיות מרוצפת לאחר בחירת גודל.

ספרייה עם התפלגות בגודל חריג הצביעה על הכנה לא מוצלחת של הספרייה. דפוסי ביטוי הגנים נותחו. הגנים המועשרים בכל אחד מארבעת סוגי תאי השורש קובצו ותוארו במפת חום המראה את הספציפיות של ביטויי גנים בין סוגי תאים שונים.

איכות גבוהה וטוהר של תאי המטרה באמצעות גיטוט נכון ומיון ומניעה של פירוק RNA הם המפתח לבניית ספרייה מוצלחת. עבור RNA-seq במצב תא בודד, דווחו לאחרונה מספר שיטות המשולבות עם המזהה המולקולרי הייחודי אשר שיפרו באופן משמעותי את הביצועים.