Name: בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: למדו שיטה לבידוד סוגי תאי שורש מ-Arabidopsis thaliana באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי ו-RNA-seq חד-תאי. שיטה זו מאפשרת חקירת הבדלי ביטוי גנים ומנגנוני רגולציה תוך-תאיים בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הקמנו פרוטוקול זה במתקן הרב-תאי היחיד של בית הספר לחקלאות וביולוגיה, אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנחאי, ונתמכו על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '32070608), תוכנית שנחאי פוג'יאנג (מענק מס '20PJ1405800), ואוניברסיטת שנגחאי ג'יאו טונג (מענק מס 'Agri-X20200202, 2019TPB05).

הפרוטוקול הבא עבר אופטימיזציה עבור זרעי A. thaliana wild-type (WT) ללא קווי סמן פלואורסצנטי ופלואורסצנטי עבור סוגי תאי השורש הבאים: תאי פריסייקל בקוטב קסילם (J0121), תאי שורש ראשוניים לטרליים, תאי כובע שורש רוחביים (J3411), אנדודרמיס ותאי קליפת המוח (J0571) (איור 1A). כל קווי הסמנים התקבלו ממקור מסחרי (ראה טבלת חומרים), למעט קו סמן תא התחלת שורש רוחבי, שנוצר על ידי החדרת מבנה GFP מונע מקדם GATA23 לצמח ארבידופסיס מסוג בר בעקבות דו"ח14 שפורסם בעבר.
1. הכנת החומר הצמחי
<ol><li>יש לעקר את זרעי A. thaliana WT ואת זרעי קו הסמן הפלואורסצנטי על ידי דגירה של הזרעים באקונומיקה של 20% באינקובטור מסתובב בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
	<li>שטפו את הזרעים במים מזוקקים פעמיים (ddH2O) שלוש עד חמש פעמים. בצעו שלב זה על ספסל סטרילי ונקי.</li>
	<li>מקציפים את זרעי קו ה-WT והכתב על מדיום Murashige ו-Skoog (MS) בחצי חוזק עם 0.8% אגר (w/v)15. לגדל את הצמחים אנכית במשך 5 ימים (16 שעות אור ב 23 ° C) לאחר ריבוד במשך 2 ימים ב 4 °C (75 °F).</li>
</ol>2. Protoplasting
<ol><li>הכינו את תמיסות הפרוטו-עמידות2,5, המכונות תמיסה א' ותמיסה ב' (ראו טבלת חומרים).<ol><li>הכן תמיסה A המכילה 400 mM mannitol, 0.05% BSA, 20 mM MES (pH 5.7), 10 mM CaCl2 ו-20 mM KCl (ראה טבלת חומרים). אחסנו את תמיסה A בטמפרטורה של -20°C למשך עד חודש אחד.</li>
		<li>הכינו תמיסה B על-ידי הוספת 1% (w/v) צלולאז R10, 1% (w/v) צלולאז RS, 1% (w/v) המיצלולאז, 0.5% (w/v) פקטוליאז, ו-1% (w/v) macerozyme R10 באליציטוט טרי של תמיסה A. אחסנו תמיסה B בטמפרטורה של -20°C למשך עד חודש אחד.</li>
	</ol></li>
	<li>הפשירו בעדינות את תמיסה א' ותמיסה ב' על קרח לפני תחילת הניסוי.</li>
	<li>חותכים את השורשים באמצעות להב נקי או מספריים, וקוצצים את השורשים לחתיכות ~0.5 ס"מ. השקיעו את השורשים ב-1.5 מ"ל של תמיסה B ולאחר מכן סיבוב עדין (בערך 18 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 1.5-2 שעות.</li>
	<li>סנן את הפרוטופלסטים של השורש דרך רשת המסננת בגודל 40 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>שטפו את רשת המסננת עם 1-2 מ"ל של תמיסה A.</li>
	<li>שלב את הנוזלים של שלב 2.4 ושלב 2.5, וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט עם פיפטה, השהו מחדש את גלולת התא ב 500-600 מיקרוליטר של תמיסה A, ולאחר מכן הניחו אותה על קרח מיד.</li>
	<li>העבר את תמיסת התאים המרחפים למבחנה חדשה של 5 מ"ל למיון תאים.</li>
</ol>3. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS)
<ol><li>הפעל וסיים את שלבי הגדרת המכשיר במיון (ראה טבלת חומרים). בחרו את התעלות הפלואורסצנטיות, השתמשו בצמח WT (ללא פלואורסצנציה) כבקרה כדי לקבוע את קו הבסיס לפלואורסצנטיות עצמית, וכווננו את שער המיון בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנטיות וסינגלי FSC/SSC (איור 2).</li>
	<li>הוסף 500 μL של תמיסה A (שלב 2.1.1) לתוך צינור איסוף של 1.5 מ"ל כדי למנוע נזק לתאים. לאסוף 2,000-3,000 תאים בכל צינור.</li>
	<li>לאחר המיון, מיד מניחים את הדגימות על קרח, צנטריפוגות את צינור האיסוף המכיל את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ולהסיר את supernatant עם פיפטה.</li>
	<li>קח 2 μL של תאים ממוינים, ולבדוק פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>אחסן את התאים הממוינים ב- -80°C, או השתמש בהם מיד לבניית ספריה (שלב 4).</li>
	<li>למיון אינדקס של תא יחיד, מקם את לוח 96 הבארות במתאם. כיילו את מיקום הצלחת כך שהטיפה תיפול בחור המרכזי של הצלחת. בחר מצב מיון של תא בודד בעת המיון, הזן את מספר היעד של התאים הממוינים כ- 1 והתחל במיון.</li>
</ol>4. הכנת ספריית Smart-seq2
<ol><li>כתוצאה מכמות הקלט הנמוכה במיוחד, בצע בניית ספריית RNA-seq מסוג תא בודד בסביבה נטולת זיהום. לפני תחילת הניסוי, נקו את הספסל עם מזהם משטח8 (ראו טבלת חומרים) ו-75% אתנול.</li>
	<li>הכינו חיץ ליזיס (תערובת A) (טבלה 1) על ידי שילוב של 0.33 μL של 10% Triton X-100, 0.55 μL של מעכב RNase ו-0.22 μL של 0.1 M DTT (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>מוסיפים 1 μL של תערובת A לתוך מדגם ממוין, וטוחנים עם מזיק סטרילי. נפח המדגם המועדף הוא ≤0.5 מיקרוליטר; השתמש במים נטולי RNase כדי לפצות על נפח של 14 μL. העבר כל דגימת תא בודד לתוך צינור PCR דק דופן 0.2 מ"ל.</li>
	<li>הכינו תערובת B המכילה 0.44 מיקרוליטר פריימר תגובה אוליגו-dT30VN (RT) (100 מיקרומטר) ו-4.4 מיקרוליטר של dNTPs (10 מילימטר) (טבלה 2) (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>הוסיפו 4.4 מיקרוליטר של תערובת B ל-14 מיקרוליטר הדגימה בכל צינור, פיפטה בעדינות כדי לערבב את הדגימה, ודגרו על הדגימה בטמפרטורה של 72°C למשך 3 דקות. לאחר הדגירה, מיד לשים את הדגימות על קרח כדי הכלאה oligo-dT זנב פולי A.</li>
	<li>הכינו את תערובת תגובת השעתוק ההפוך (תערובת C) (טבלה 3) (ראו טבלת חומרים). הוסף 21.6 μL של תערובת C לכל צינור המכיל את הדגימות. הפעל את תוכנית RT במכשיר PCR נפוץ (טבלה 4).</li>
	<li>בצע את תגובת ההגברה מראש על קרח. הכינו תערובת D על ידי שילוב של 44 μL של תערובת 2x PCR פולימראז ו-0.88 μL של פריימר IS PCR (10 μM) (טבלה 5) (ראו טבלת חומרים). הוסף 40.8 μL של תערובת D למוצר תגובת RT של 40 μL, והפעל את תוכנית קדם-הגברה (טבלה 6).</li>
	<li>לטהר את מוצרי תגובת קדם-הגברה באמצעות חרוזי Ampure XP (ראה טבלת חומרים). הוסיפו 48 מיקרוליטר חרוזים (יחס של 0.6:1) לכל דגימה משלב 4.7, וערבבו בעדינות את הדגימות על ידי פיפט.</li>
	<li>יש לדגור על הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הניחו את צינורות ה-1.5 מ"ל המכילים את הדגימות על מעמד הפרדה מגנטית למשך 5 דקות. יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט מהדגימות מבלי להפריע לחרוזים.</li>
	<li>שטפו את החרוזים על ידי השעייתם מחדש ב-200 מיקרוליטר של 80% אתנול, והניחו את הדגימות על מעמד ההפרדה המגנטית (ראו טבלת חומרים) למשך 3 דקות נוספות לפני השלכת הסופרנטנט המכיל אתנול.</li>
	<li>ייבשו את הדגימות באוויר למשך 10 דקות, וכסו את הצינורית כדי למנוע זיהום וזיהום צולב במהלך ייבוש האוויר.</li>
	<li>השהה מחדש את החרוזים ב 20 μL של ddH2O, לדגור את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, ולאחר מכן להניח אותם על מעמד ההפרדה המגנטית במשך 5 דקות.</li>
	<li>פיפטה מוציאה 18 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מכל צינור, ומעבירה את הדגימות לצינורות צנטריפוגות חדשים של 1.5 מ"ל. השתמש ב- 1 μL של הדגימה כדי להעריך את איכות ה- cDNA באמצעות ערכת כימות DNA, קבע את התפלגות הגודל של כל קדם-ספרייה באמצעות מנתח מקטעים (ראה טבלת חומרים), ואחסן את הדגימה הנותרת ב- -20 °C.</li>
	<li>בניית ספריית cDNA8 עבור ריצוף Illumina 16 מהמכפלה הקדם-ספרייתית של שלב4.13 באמצעות ערכת הכנת ספריית רצף (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>לטהר את הספריות (משלב 4.14) באמצעות חרוזי Ampure XP, לכמת את הספריות המטוהרות ולקבוע את התפלגות הגודל של כל ספרייה לאחר שלב 4.13. הערה: אחסן ננו-שומות שוות של כל ספרייה, וודא שלאף אחת מהן אין את אותו שילוב של אינדקס Illumina. אחרת, ניתן לאגד את הספריות ביחס המבוסס על פלט הרצף הרצוי ולרצף אותן יחד באותו נתיב של רצף האילומינה. באופן כללי, ריצוף כל ספרייה לעומק של 4-6 GB, המניב >10 מיליון קריאות ממופות, מספק כיסוי פי 20x-30 של גנום Arabidopsis . עומקי רצף נמוכים יותר מקובלים גם הם, אך עשויים להשפיע על משמעות ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי.</li>
</ol>5. ניתוח נתוני RNA-seq
<ol><li>חתוך את הקריאות הגולמיות באמצעות Trim-Galore17 ולאחר מכן מיפוי לגנום הייחוס באמצעות hisat218 (daehwankimlab.github.io/hisat2), והסר את המקטעים המשוכפלים PCR באמצעות Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).</li>
	<li>בצע את עיבוד הספירה הגולמית וניתוח עוקב של הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEG) עם DESeq220 באמצעות לפחות שלושה עותקים ביולוגיים עבור כל דגימה. בצע אשכולות של ביטוי הגנים עם חבילת Pheatmap, והצג באופן חזותי במפת חום של ביטוי. הערה: ערכי RPKM (קריאות לקילו-בסיס למיליון קריאות ממופות) של הגנים וה-TEs (רכיבים הניתנים לטרנספוזיה) חושבו באמצעות Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) והוצגו באופן חזותי בדפדפן גנום.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).</li>
<li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li>
<li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li>
<li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li>
<li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li>
<li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77(2016).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%26T-seq%3A+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li>
<li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li>
<li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+aux%2FIAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li>
<li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li>
<li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li>
<li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510(2017).</li>
<li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT%2C+StringTie+and+Ballgown%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li>
<li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAsik%3A+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Open+Source+Software%22%5BJournal%5D)">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583(2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li>
<li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li>
<li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139(2016).</li>
<li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li>
<li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667(2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול מבוסס Smart-seq2 יכול ליצור ספריות רצף אמינות מכמה מאות תאים8. איכות חומר המוצא חיונית לדיוק ניתוח התמלול. FACS הוא כלי רב עוצמה להכנת תאים מעניינים, אך הליך זה, במיוחד השלב הפרוטו-מתמשך, חייב להיות מותאם ליישומים צמחיים. מיקרודיסקציה ללכידת לייזר (LCM) או תאים מנותחים ידנית יכולים לשמש גם כקלט25,26, כך שהפרוטוקול המסופק כאן יכול לשמש במגוון מיני צמחים וסוגי תאים עם או בלי גני סמן ידועים.
הכנת ...

תאים הם היחידה הבסיסית של כל האורגניזמים החיים ומבצעים פונקציות מבניות ופיזיולוגיות. למרות שהתאים באורגניזמים רב-תאיים מראים סינכרוניות לכאורה, תאים מסוגים שונים ותאים בודדים מציגים הבדלים בתעתיק שלהם במהלך ההתפתחות ובתגובות סביבתיות. ריצוף RNA חד-תאי בתפוקה גבוהה (scRNA-seq) מספק עוצמה חסרת תקדים להבנת הטרוגניות תאית. יישום scRNA-seq במדעי הצמח תרם לבנייה מוצלחת של אטלס תאי צמח1, שימש לזיהוי טקסים תאיים נדירים ברקמות צמח2, סיפק תובנה לגבי הרכב סוגי התאים ברקמות צמחים, ושימש לזיהוי זהות תאית ופונקציות חשובות המשמשות במהלך התפתחות והתמיינות צמחים. בנוסף, ניתן להסיק מסלולי התפתחות מרחביים-זמניים ברקמות צמחים 1,2,3 כדי לגלות גנים חדשים של סמן4 ולחקור את תפקודם של גורמי שעתוק חשובים5 באמצעות scRNA-seq כדי לחשוף את השימור האבולוציוני של אותו סוג תא בצמחים שונים3. עקה אביוטית היא בין ההשפעות הסביבתיות החשובות ביותר על גדילה והתפתחות של צמחים. על ידי חקירת השינויים בהרכב סוגי התאים ברקמות צמחים בתנאי טיפול שונים באמצעות ריצוף שעתוק חד-תאי, ניתן גם לפתור את מנגנון תגובת העקה הא-ביוטית6.
הפוטנציאל לפתרון הטרוגניות שעתוק בין סוגי תאים באמצעות ריצוף scRNA תלוי בשיטת בידוד התאים ובפלטפורמת הריצוף. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) היא טכניקה נפוצה לבידוד תת-אוכלוסייה של תאים עבור scRNA-seq בהתבסס על פיזור האור והתכונות הפלואורסצנטיות של התאים. פיתוח קווי סמן פלואורסצנטיים על ידי טכנולוגיה טרנסגנית שיפר מאוד את יעילות בידוד התאים על ידי FACS7. ביצוע scRNA-seq באמצעות Smart-seq28 משפר עוד יותר את היכולת לנתח את ההטרוגניות התאית. לשיטת Smart-seq2 יש רגישות טובה לזיהוי גנים והיא יכולה לזהות גנים גם עם קלט תעתיק נמוך9. בנוסף לאיסוף סוגי תאים בתפזורת, ממייני תאים מודרניים מספקים תבנית מיון אינדקס של תא יחיד, המאפשרת ניתוח תעתיק ברזולוציה של תא בודד באמצעות Smart-seq210 או שיטות RNA-seq מרובות אחרות, כגון CEL-seq211. מיון תא בודד או סוג תא יכול לשמש פוטנציאלית עבור יישומים רבים אחרים במורד הזרם, כגון מחקרי מולטי-אומיקה מקבילים12,13. מוצג כאן פרוטוקול חזק ורב-תכליתי לבידוד סוגי תאי צמחים, כגון תאי פריסייקל בקוטב קסילם, תאי כובע שורש רוחביים, תאי שורש ראשוניים רוחביים, תאי קליפת המוח ותאים אנדודרמליים משורשי קווי תאי סמן Arabidopsis thaliana על ידי FACS. הפרוטוקול כולל גם בניית ספריית Smart-seq2 לניתוח תמלול במורד הזרם.

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; מסננת m</td><td>Sorfa&nbsp;</td><td>622110</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Yeasen</td><td>70101ES76</td><td></td></tr><tr><td>מנתח שברים זריזים</td><td>Aglient</td><td>5200</td><td></td></tr><tr><td>ערכת DNA גמישה ברגישות גבוהה</td><td>Aglient</td><td>DNF-474-0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP חרוזים</td><td>BECKMAN</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Betaine</td><td>yuanye</td><td>S18046-100g</td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה</td><td>מר שריר</td><td>FnBn83BK</td><td>20% (v/v) אקונומיקה</td></tr><tr><td>BSA</td><td>sigma</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>yuanye</td><td>S24109-500g</td><td></td></tr><tr><td>צלולאז R10</td><td>יאקולט (יפן)</td><td>9012-54-8</td><td></td></tr><tr><td>צלולאז RS</td><td>Yakult (יפן)</td><td>9012-54-8</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה (1.5 מ"ל)</td><td>אפנדולף</td><td>30121589</td><td></td></tr><tr><td>DNase, RNase, DNA ו-RNA רחוקים מטהרי משטח</td><td>Beyotime</td><td>R0127</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (10 מ"מ)</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (0.1 מ')</td><td> invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ</td><td>100092680</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD FACS מלודי</td><td>BD-65745</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Sony</td><td>SH800S</td><td></td></tr><tr><td>טיפ לסינון&nbsp; (1000 ומיקרו; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TF112-1000-Q</td><td></td></tr><tr><td>קצה מסנן&nbsp; (200 ומיקרו; L)</td> קצה מסנן <td>Thermo Scientific</td><td>TF140-200-Q</td><td></td></tr><tr><td>(10 ומיקרו; L)</td> קצה מסנן <td>Thermo Scientific</td><td>TF104-10-Q</td><td></td></tr><tr><td>(100 ומיקרו; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TF113-100-Q</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>מיקסר מסתובב ארבעה מימדים</td><td>Kylin -Bell</td><td>BE-1100</td><td></td></tr><tr><td>Hemicellulase</td><td>sigma</td><td>9025-56-3</td><td></td></tr><tr><td>IS PCR פריימר</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3'KAPA</td></tr> <tr><td>HiFi HotStart ReadyMix( 2X)</td><td>רוש&nbsp;</td><td></td><td></td>7958935001</tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R10</td><td>Yakult (יפן)</td> <td>9032-75-1</td><td></td></tr><tr><td>מעמד הפרדה מגנטית</td><td>invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>מניטול</td><td>אלאדין</td><td>69-65-8</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>אלאדין</td><td>145224948</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>yuanye</td><td>R21455-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגות</td><td>אפנדורף</td><td>צנטריפוגה 5425</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מיני צנטריפוגה</td><td>טיטאן</td><td>Timi-10k</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Phytotech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT ערכת הכנת ספריית DNA illumina</td><td></td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>oligo-dT30VN פריימר</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT מכשיר TTTTTTTTTTVN-3'PCR</td></tr> <tr><td></td><td>Thermal cycler</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase</td><td>Yakult (יפן)</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>קווי סמן צמחים</td><td>מרכז המניות נוטינגהאם ארבידופסיס (NASC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1x dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>invitrogen</td><td>Q33231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 פלואורומטר</td><td>invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0382</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת 10977023</td><td></td><td></td><td></td>מים ללא RNase</tr><tr><td>A</td><td></td><td></td><td>400 מ"מ מניטול, 0.05% BSA , 20 מ"מ MES (pH5.7), 10 מ"מ CaCl2, 20 מ"מ תמיסת KCl</td></tr><tr><td>B</td><td></td><td></td><td>1% (w/v) צלולאז R10, 1% (w/v) צלולאז RS, 1 %&nbsp; (w/v)המיצלולאז, 0.5%&nbsp; פקטוליאז ו-1%&nbsp; (עם / נ) Macerozyme R10 במנה טרייה של תמיסה מסננת</td></tr><tr><td>453463</td><td></td><td>עלי סטרילי</td><td>BIOTREAT</td></tr><tr><td>(40 ומיקרו; m )</td><td>Sorfa&nbsp;</td><td>251100</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV טרנסקריפטאז הפוך (200 U/&micro; L)</td><td>מאגר invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV (5x)</td><td>מבחנה invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>(5 מ"ל)</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PCR דקי דופן עם פקקים (0.5 מ"ל)</td><td>AXYGEN</td><td>PCR-05-C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600198-0500</td><td></td></tr><tr><td>TSO פריימר</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3'מערבולת</td></tr> <tr><td></td><td>טיטאן</td><td>VM-T2</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

באורגניזמים רב-תאיים, תכנות התפתחותי ותגובות סביבתיות יכולים להיות שונים מאוד בסוגי תאים שונים או אפילו בתוך תאים, מה שידוע בשם הטרוגניות תאית. בשנים האחרונות, בידוד תא בודד וסוג תא בשילוב עם טכניקות ריצוף הדור הבא (NGS) הפכו לכלים חשובים לחקר תהליכים ביולוגיים ברזולוציה של תא יחיד. עם זאת, בידוד תאי צמח הוא יחסית קשה יותר בשל נוכחותם של קירות תאי הצמח, אשר מגביל את היישום של גישות חד-תאיות בצמחים. פרוטוקול זה מתאר הליך חזק למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) המבוסס על בידוד תא בודד וסוג תא עם תאי צמחים, המתאים לניתוח מולטי-אומיקס במורד הזרם ולמחקרים אחרים. באמצעות שימוש בקווי סמן פלואורסצנטיים של שורש Arabidopsis אנו מדגימים כיצד סוגי תאים מסוימים, כגון תאי פריסייקל של קוטב קסילם, תאי שורש ראשוניים רוחביים, תאי כובע שורש רוחביים, תאי קליפת המוח ותאים אנדודרמליים, מבודדים. יתר על כן, שיטת ניתוח תמלול יעילה במורד הזרם באמצעות Smart-seq2 מסופקת גם כן. שיטת בידוד התאים וטכניקות ניתוח התעתיק ניתנות להתאמה לסוגי תאים אחרים ולמיני צמחים ויש להן פוטנציאל יישום רחב במדעי הצמח.

בידוד פרוטופלסט פרוטוקול זה יעיל למיון פרוטופלסטים של קווי סמן שורש פלואורסצנטי A. thaliana . קווי הסמנים האלה פותחו על-ידי מיזוג של חלבונים פלואורסצנטיים עם גנים שמתבטאים באופן ספציפי בסוגי תאי מטרה, או על-ידי שימוש בקווי מלכודת משפרים (איור 1). רקמות ואיברים רבים נותחו לסוגי תאים המבטאים סמנים פלואורסצנטיים ספציפיים בצמחי מודל ובגידולים.
אוכלוסיית FACS, תאים ממוינים ו- QC ספריה על-ידי שימוש בצמח מסוג בר כבקרה והצב...

ההיתכנות והיעילות של שיטות scRNA-seq בעלות תפוקה גבוהה מבשרות על עידן חד-תאי בחקר צמחים. מוצג כאן הליך חזק ומלא לבידוד סוגי תאי שורש ספציפיים של Arabidopsis thaliana ובנייה וניתוח של ספריית שעתוק לאחר מכן.

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

ניתוח שעתוק על תאים בודדים או סוגי תאים יכול לזהות את ההבדל העדין של ביטוי גנים להיות מוסווה על ידי הטרוגניות, שהוא כלי רב עוצמה כדי לחשוף את מנגנוני הבקרה התוך-תאיים המשוכללים. מיון תאים מופעל פלואורסצנטי ואחריו ניתוח RN-seq יכול להתבצע במצב תא בודד או סוג תא בתפזורת עם רגישות גבוהה לזיהוי תעתיק ותאימות עם גישות מולטי-אומיות אחרות. משתמשים בפעם הראשונה של פרוטוקול זה צריכים לשים לב כמה שלבים במיון protoplast והכנת ספריית RNA-seq.יחד עם ג'ון ג'אנג, ד"ר Rongrong Xie, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלנו, יעזור להדגים את ההליך. כדי להתחיל, לשים את Arabidopsis thaliana סוג בר סמן קו זרעים פלואורסצנטי ב 20% אקונומיקה לדגור באמצעות אינקובטור מסתובב בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לעקר את הזרעים. בזמן העבודה על ספסל סטרילי, שוטפים את הזרעים שלוש עד חמש פעמים במים מזוקקים כפולים.צלחת את סוג הבר ואת זרעי קו כתב על מדיום MS חצי חוזק עם 0.8% משקל לכל אגר נפח. לרבד את הצמחים במשך יומיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן גדל אותם אנכית במשך חמישה ימים ב 23 מעלות צלזיוס תחת 16 שעות אור ו 18 שעות חושך מחזורים.הפשירו בעדינות את התמיסות הפרוטו-עמידות המכונות תמיסה A ותמיסה B על קרח לפני הניסוי. חותכים את השורשים מהצמחים בעזרת להב נקי או מספריים וקוצצים את השורשים לחתיכות של כ-0.5 ס"מ. השקיעו את השורשים הקצוצים במיליליטר 1.5 של תמיסה B ולאחר מכן סיבוב עדין בטמפרטורת החדר למשך שעה וחצי עד שעתיים.מסננים את פרוטופלסטי השורש המתקבלים דרך רשת מסננת של 40 מיקרון ושוטפים את הרשת במיליליטר אחד עד שניים של תמיסה A.צנטריפוגה התסנין המשולב ב 300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה, השהו מחדש את גלולת התא ב-500 עד 600 מיקרוליטר של תמיסה A, והניחו אותה מיד על קרח. למיון תאים, העבר את תמיסת התאים המרחפים למבחנה חדשה של חמישה מיליליטר.מלאו את מיכל נוזל הנדן ובדקו את מיכל האשפה. לאחר מכן הפעל את מיון התאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות או את מכונת FACS. בצע את שלבי הגדרת המכשיר והכיול האוטומטי במיון.בחר את תעלות הפלואורסצנטיות והשתמש בצמח מסוג בר ללא פלואורסצנטיות כבקרה בסיסית. התאימו את שער המיון בהתאם לעוצמת הפלואורסצנטיות ולפיזור הקדמי ולפיזור הצדדי. לאחר הוספת 500 מיקרוליטר של פתרון A לתוך צינור איסוף 1.5 מיליליטר, להתחיל מיון ולאסוף 2, 000 עד 3, 000 תאים לכל צינור.לאחר המיון, מיד מניחים את הדגימות על קרח. צנטריפוגה את צינור האיסוף המכיל את התאים ב 300 G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולהסיר את supernatant עם פיפטה. קחו שני מיקרוליטרים של תאים ממוינים ובדקו אם יש פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.אחסן את התאים הממוינים בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס אם לא נעשה בהם שימוש מיידי. למיון אינדקס תא יחיד, מקם את צלחת 96 הבארות עם הממברנה למתאם. כיילו את מיקום הצלחת כך שהטיפה תיפול בחור המרכזי של הצלחת.הסר את הממברנה מהצלחת של 96 בארות והכנס את צלחת 96 הבארות למתאם. בחר מצב מיון של תא בודד בעת המיון. הזן את מספר היעד של התאים הממוינים כאחד והתחל במיון.לפני תחילת הניסוי, נקו את הספסל עם מזהם פני השטח ואתנול 75%. השתמש בכל הציוד רק להכנת רצף הספרייה. לאחר הוספת מיקרוליטר אחד של תערובת טרייה מוכנה A לתוך מדגם ממוין, לטחון אותו עם מזיק סטרילי.באמצעות מים נטולי RNAse, לפצות את נפח 14 מיקרוליטר. לאחר מכן להעביר כל דגימה לתוך 0.2 מיליליטר דק דופן PCR צינור. לאחר מכן מכינים תערובת B.מוסיפים 4.4 מיקרוליטר בתערובת B לכל צינור PCR המכיל דגימות ומערבבים בפיפטינג עדין.לדגור על הדגימות ב 72 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לאחר הדגירה, מיד לשים את הדגימות על קרח כדי הכלאה של אוליגו dT לזנב poly-A. הכינו את תערובת תגובת השעתוק ההפוך או תערובת C ב-21.6 מיקרוליטר ממנה לכל צינור המכיל את הדגימות.הכפיפו את הדגימות לתגובת שעתוק לאחור במכשיר PCR נפוץ לפי תוכנית התמלול ההפוך. הוסף 40.8 מיקרוליטר של תערובת תגובת קדם-הגברה טרייה שהוכנה מראש או תערובת D למוצר תגובת השעתוק לאחור והפעל את תוכנית קדם-הגברה. מחזור ההגברה יכול להיקבע על ידי PCR כמותי כאשר התגובה רק נכנסת לשלב המעריכי.כדי לטהר את תוצרי התגובה לפני הגברה, העבר את המוצרים המוגברים מראש מצינור PCR לצינור 1.5 מיליליטר. הוסיפו 48 מיקרוליטר של חרוזי AMPure XP לכל דגימה וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג לפני הדגירה. הניחו את צינורות ה-1.5 מיליליטר המכילים את הדגימות והחרוזים על מעמד הפרדה מגנטית למשך חמש דקות.יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט מהדגימות מבלי להפריע לחרוזים. לאחר השעייתם מחדש ב -200 מיקרוליטר של 80% אתנול, הניחו אותם על מעמד ההפרדה המגנטית למשך שלוש דקות נוספות. לאחר השלכת האתנול המכיל סופרנטנט, יש לייבש את הדגימות באוויר בצינור למשך 10 דקות.מרחפים מחדש את החרוזים ב-20 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ודגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן הניחו אותם על מעמד ההפרדה המגנטית למשך חמש דקות. בעזרת פיפטה מעבירים 18 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מכל צינור לצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר.לבסוף, בצע את השלבים המתוארים בטקסט כדי לאפיין את הספרייה המוקדמת, ולאחר מכן בנייה, טיהור וכימות הספרייה. קווי הסמנים הפלואורסצנטיים Arabidopsis thaliana פותחו על ידי התכה של חלבונים פלואורסצנטיים עם גנים המבוטאים באופן ספציפי בסוגי תאי מטרה או על ידי שימוש בקווי מלכודת משפרים. הפרוטופלסטים המסומנים הספציפיים לפלואורסצנטיות מוינו בהצלחה בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנטיות וסינגלטים של פיזור קדמי ופיזור צדדי.התאים הממוינים הודגמו באמצעות שדה בהיר והדמיית פלואורסצנטיות. התוצאות המייצגות של ספריית ריצוף הרנ"א של כ -2, 000 תאי פריסייקל קוטב קסילם, תאי שורש קדמוניים רוחביים, תאי אנדודרמיס או קליפת המוח, ותאי כובע שורש רוחביים מוצגים. ספריה בגודל קטן עם פסגות דימר של פריימר או מתאם עדיין יכולה להיות מרוצפת לאחר בחירת גודל.ספרייה עם התפלגות בגודל חריג הצביעה על הכנה לא מוצלחת של הספרייה. דפוסי ביטוי הגנים נותחו. הגנים המועשרים בכל אחד מארבעת סוגי תאי השורש קובצו ותוארו במפת חום המראה את הספציפיות של ביטויי גנים בין סוגי תאים שונים.איכות גבוהה וטוהר של תאי המטרה באמצעות גיטוט נכון ומיון ומניעה של פירוק RNA הם המפתח לבניית ספרייה מוצלחת. עבור RNA-seq במצב תא בודד, דווחו לאחרונה מספר שיטות המשולבות עם המזהה המולקולרי הייחודי אשר שיפרו באופן משמעותי את הביצועים.

isolation-and-transcriptome-analysis-of-plant-cell-types

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה לבידוד סוגי תאים מסוימים של חומר צמחי מודגם. טכניקה זו מעסיקה קווי סמן מהונדס המבטא חלבוני ניאון בסוגי תאים מסוימים, הסלולר דיסוציאציה Fluorescence מיון הופעל תא. בנוסף, ההתקנה גידול מוקמת כאן המאפשרת...

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה קצירת של תאים בודדים מתרבויות עכברוש העיקרי העצבית וניתוח transcriptome הבאים באמצעות הגברה ארנה. גישה זו היא להכליל לכל סוג תא.

ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

כאן אנו מציגים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה בסיוע לייזר של סוגי תאי צמחים ספציפיים לפרופיל שעתוק. בעוד שהפרוטוקול מתאים למינים וסוגי תאים שונים, ההתמקדות היא בתאים בלתי נגישים מאוד של קו הנבט הנקבי החשובים לרבייה מינית ואפומית בסוג המצליבים Boechera.

Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הכנת כמויות גדולות של סויה protoplasts ללמוד מנגנוני איתות ולניהולו מורכבים בתאים חיים.

שיטה פשוטה עבור בידוד של סויה Protoplasts, ליישום ניתוחים ביטוי גנים ארעית

מתרגם הריבוכמה אהדה (מלכודת) מציעה את האפשרות לנתח תוכניות התפתחותיות עם עיבוד מינימלי של איברים ורקמות. הפרוטוקול מניב RNA באיכות גבוהה מתאים המיועדים עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-יחידת משנה ריבוזומבית. כלים לניתוח במורד הזרם, כגון רביעיית-PCR או RNA-seq, חושפים פרופילי ביטויים ספציפיים לסוג תאים.

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

מוצג כאן פרוטוקול עבור microdissection לכידת לייזר (LCM) של רקמות צמח. LCM היא טכניקה מיקרוסקופית לבידוד אזורים של רקמות באופן ללא זיהום. ההליך כולל קיבעון רקמות, הטמת פרפין, מקטע, LCM וחילוץ RNA. RNA משמש במורד הזרם ספציפי רקמה, ניתוח נפתר זמנית של transcriptomes.

לכידת לייזר מיקרודיסציה RNA-רצף לניתוח ביטוי גנים ספציפי רקמה מרחבית וזמנית בצמחים

אנו מתארים שיטה פשוטה אך ניתנת לשחזור מאוד לבידוד RNA חוץ-תאי מפני השטח של העלים והאפופלסט של צמחי Arabidopsis.

מדריך מדורג לבידוד וניתוח של משטח העלים ו-RNA אפופלסטי באמצעות רוזטות Arabidopsis

הזדווגות והפרדה הטטרדה נדרשים לניתוח...

הזדווגות והפרדה של הטטרדה Chlamydomonas reinhardtii עבור ניתוח גנטי

למדו שיטה לבידוד סוגי תאי שורש מ-Arabidopsis thaliana באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי ו-RNA-seq חד-תאי. שיטה זו מאפשרת חקירת הבדלי ביטוי גנים ומנגנוני רגולציה תוך-תאיים בצמחים.

בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח

גלה סרטונים נוספים