ייצור ותחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי פרימטים שמקורם בשתן

IPSCs פרימטים הם שימושיים אך לעתים קרובות קשה להשיג אותם בשל בעיות אתיות וטכניות. פרוטוקול זה נותן נתיב נגיש ביותר ליצירה ותחזוקה של IPSCs פרימטים. לשימוש בתאי שתן כמקור עיקרי של IPSCs יש יתרון גדול מכיוון שניתן להשיג אותם באופן לא פולשני לחלוטין ללא כל טכניקות מיוחדות.

מי שתדגים את ההליך תהיה ג'סיקה רדמר, דוקטורנטית מוולפגנג M.S.Laboratory. כדי להתחיל, צנטריפוגה את הצינור המכיל שתן ב 400G במשך 10 דקות. לאחר מכן בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר כמיליליטר אחד בצינור להשעות מחדש את הגלולה בו.

לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מיליליטר של חיץ שטיפת שתן המכיל אמפוטריצין בזהירות לערבב את התרחיף באמצעות פיפטה סרולוגית. לאחר צנטריפוגה, בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר בערך 0.2 מיליליטר בצינור. השהה מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיום שתן ראשוני המכיל אמפוטריצין לכל 50 מיליליטר של שתן מעובד בתחילה.

מוציאים את הג'לטין ומוסיפים מיליליטר אחד של המתלה לבאר של ג'לטין מצופה 12 צלחת באר. לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. כדי להכין מטריצת קרום מרתף מצופה 12 צלחת באר, להוסיף 500 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף לכל באר.

הזיזו את הצלחת כדי לפזר את הנוזל ולדגור עליו ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, להחליף את מטריצת קרום המרתף עם 900 מיקרוליטר של מדיום REMC ולאחסן אותו ב 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. חישוב נפח נגיפי סנדאי הדרוש לריבוי הדבקה של חמישה באמצעות המשוואה.

הפשירו במהירות את רכיבי ערכת התכנות מחדש של סנדאי באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הוסף מדיום REMC עבור סך של 100 מיקרוליטר לצינור לפני הוספת נפח מחושב של וירוסי סנדאי וערבוב. לאחר דיסוציאציה של תאי השתן כמתואר בכתב היד, סופרים את התאים באמצעות מונה התאים ומעבירים את מספר התאים הרצוי לצינור של 1.5 מיליליטר.

להשיג את הגלולה על ידי צנטריפוגה ולהשעות אותו מחדש ב 100 מיקרוליטר של תערובת וירוס סנדאי מוכן. לדגור על הצינור במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס עבור זיהום תרחיף. לאחר הדגירה, מוסיפים את REMC לסך של מיליליטר אחד לפני זריעת תרחיף התא במטריצת קרום המרתף המצופה 12 צלחת באר.

לאחר הטרנסדוקציה, יש להחליף את המדיום כל יומיים עד להתפתחות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, או IPSC, מושבות עם מעבר למדיום דור PSC ביום החמישי. כאשר מושבות IPSC גדלות מספיק כדי לעבור גושים, לשאוף את המדיום מן התאים בתרבית בזהירות לשטוף את התאים עם 500 מיקרוליטר של DPBS. לאחר הסרת DPBS, להוסיף 500 מיקרוליטר של 0.5 מילימולרי EDTA לבאר לדגור במשך שתיים עד חמש דקות.

התבוננו היטב בתאים מתחת למיקרוסקופ עד שהמושבות מתחילות להתנתק. כאשר הקצוות של המושבות מתחילים להתקלף ורווחים בין התאים הופכים גלויים, להסיר את EDTA בזהירות להוסיף 500 מיקרוליטר של DPBS. שאפו את ה-DPBS ושטפו את הבאר ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית PSC באמצעות פיפטה P-1000.

פיפטה למעלה ולמטה כדי לפזר את המושבות לגושים בגודל מתאים. בהתאם למפגש, הצפיפות הרצויה של תאי הזרעים והעדפת השבט IPSC, מעבירים 1/10 עד 1/50 מתרחיף גוש התא לבארות החדשות. הזיזו בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה מספר פעמים כדי לפזר את הגושים באופן שווה בבאר.

דוגרים על הצלחת לפחות 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס כדי לתת לגושים להיחבר. החליפו את המדיום כל יומיים-שלושה עד שהמושבות יגדלו מספיק למעבר. לאחר הבידוד, ניתן לראות תאי קשקש ותאים עגולים קטנים יותר שהופראו עם השתן.

ניתן לראות את התאים המתרבים הדבקים הראשונים, ותאים אלה גדלים למושבות גדולות שניתן לעבור. ניתן לראות שני סוגי תאים נפרדים, האחד בעל פנוטיפ דמוי אפיתל והשני מראה פנוטיפ דמוי מזנכימלי יותר עם צורה מוארכת. לאחר המעבר הראשון, תאי השתן לגדול כמו monolayer.

במהלך יצירת IPSC ניתן לראות כמה תאים דבקים ותאים אלה מתחילים להראות שינויים מורפולוגיים, המעידים על תכנות מחדש של התאים. יתר על כן, התאים היוצרים מושבות מציגים את המורפולוגיה האופיינית של תאי גזע עובריים. כל ה- IPSCs הנוצרים חולקים את המורפולוגיה הטיפוסית של מושבת תאי גזע עובריים, המאופיינת בתאים צפופים עם קצוות מוגדרים בבירור.

אימונוציטוכימיה שימשה לבדיקת הביטוי של סמנים הקשורים לפלוריפוטנציה בגורילה IPSCs. יתר על כן, ניתוח ציטומטריית זרימה הראה כי האורנגאוטן IPSCs שניתחו חיוביים עבור TRA-1-60. יתר על כן, הגורילות IPSCs מסוגלים להתמיין לשושלות אנדודרם (endoderm), מזודרם (mesoderm) ואקטודרם (ectoderm).

מספר גדל של תאים ממוינים ואובדן שלמות ואחידות הגבול מצביעים על איכות IPSC ירודה. לעומת זאת, גבולות מוגדרים, אריזה סלולרית הדוקה וגרעינים בולטים מסמלים IPSCs באיכות גבוהה. בשל השתנות העטרה, יש לייעל את התנאים הספציפיים לשיבוט כגון יחס פיצול, תזמון מעבר וגודל גושים כדי לשמור על פרימטים IPSCs גדלים בריאים.

כבקרות איכות של IPSCs מבוססים, ניתן לאמת קדם-עוצמה על ידי השראת התמיינות ישירה או עקיפה כגון התמיינות EV במבחנה, מלבד בדיקת ביטוי גנים בסמן.