Name: מיטוב תפוקת טובולין מרקמת מוח חזירית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: למדו שיטה לבידוד טובולין בטוהר של מעל 99% מרקמת מוח חזירית תוך שמירה על דינמיקה טבעית. הפרוטוקול משמש לחקר מבנה עצבוני, נוירופלסטיות ומחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד טובולין יעיל מרקמה עצבית

<ol><li>Verhey, K. J., Gaertig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The tubulin code.</a> Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).</li>
<li>Murphy, D. B., Hiebsch, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+microtubule+protein+from+beef+brain+and+comparison+of+the+assembly+requirements+for+neuronal+microtubules+isolated+from+beef+and+hog%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of microtubule protein from beef brain and comparison of the assembly requirements for neuronal microtubules isolated from beef and hog.</a> Anal Biochem. 96 (1), 225-235 (1979).</li>
<li>Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+and+associated+high+molecular+weight+proteins+from+porcine+brain+and+characterization+of+microtubule+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro.</a> Ann NY Acad Sci. 253, 1 The Biology o 107-132 (1975).</li>
<li>Weisenberg, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+formation+in+vitro+in+solutions+containing+low+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations.</a> Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).</li>
<li>Roychowdhury, S., Gaskin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+assembly-competent+tubulin+from+brain+microtubule+protein+preparations+using+a+fast-performance+liquid+chromatography+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Separation of assembly-competent tubulin from brain microtubule protein preparations using a fast-performance liquid chromatography procedure.</a> J Neurochem. 46 (5), 1399-1405 (1986).</li>
<li>Weingarten, M. D., Suter, M. M., Littman, D. R., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+depolymerization+products+of+microtubules+from+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Properties of the depolymerization products of microtubules from mammalian brain.</a> Biochemistry. 13 (27), 5529-5537 (1974).</li>
<li>Souphron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles.</a> Nat Protoc. 14 (5), 1634-1660 (2019).</li>
<li>Jacobs, M., Huitorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-associated+nucleoside+diphosphokinase%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tubulin-associated nucleoside diphosphokinase.</a> Eur J Biochem. 99 (3), 613-622 (1979).</li>
<li>Munguía, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+native+M.+vogae+and+H.+contortus+tubulin+by+TOG+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Purification of native M. vogae and H. contortus tubulin by TOG affinity chromatography.</a> Exp Parasitol. 182, 37-44 (2017).</li>
<li>Castoldi, M., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+brain+tubulin+through+two+cycles+of+polymerization-depolymerization+in+a+high-molarity+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+ExpPurif%22%5BJournal%5D)">Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.</a> Protein ExpPurif. 32 (1), 83-88 (2003).</li>
<li>Minoura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression%2C+purification%2C+and+functional+analysis+of+recombinant+human+tubulin+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer.</a> FEBS Lett. 587 (21), 3450-3455 (2013).</li>
<li>Liu, C., Yao, J., Yin, J., Xue, J., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+%CE%B1-+and+%CE%B2-tubulin+from+Echinococcus+granulosus%3A+Expression%2C+purification+and+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Recombinant α- and β-tubulin from Echinococcus granulosus: Expression, purification and polymerization.</a> Parasite. 25, 62(2018).</li>
<li>Ti, S. -C., Wieczorek, M., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+affinity+tag-free+recombinant+tubulin+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of affinity tag-free recombinant tubulin from insect cells.</a> STAR protoc. 1 (1), 100011(2020).</li>
<li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+and+isotypes+from+limited+sources+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22JVisExp%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles.</a> JVisExp. (165), e61826(2020).</li>
<li>Sackett, D. L., Werbovetz, K. A., Morrissette, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+tubulin+from+nonneural+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolating tubulin from nonneural sources.</a> Methods Cell Biol. 95, 17-32 (2010).</li>
<li>Modig, C., Strömberg, E., Wallin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+stability+of+posttranslationally+modified+brain+microtubules+isolated+from+cold-temperate+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Different stability of posttranslationally modified brain microtubules isolated from cold-temperate fish.</a> Mol Cell Biochem. 130 (2), 137-147 (1994).</li>
<li>Fourest-Lieuvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+from+limited+volumes+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Exp+Purif%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin from limited volumes of cultured cells.</a> Protein Exp Purif. 45 (1), 183-190 (2006).</li>
<li>MacRae, T. H., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+assembly+in+vitro+of+tubulin+from+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Purification and assembly in vitro of tubulin from Trypanosoma brucei.</a> Biochem J. 265 (1), 87-93 (1990).</li>
<li>Lazar, I. GelAnalyzer 19.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.gelanalyzer.com">www.gelanalyzer.com</a> (2024).</li>
<li>Jansen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+microtubule-associated+protein+2c+%28MAP2c%29+phosphorylation+and+regulatory+protein+14-3-3%CE%B6-binding+sites+reveals+key+differences+between+MAP2c+and+its+homolog+Tau%5BTitle%5D)+AND+%22JBiol+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of microtubule-associated protein 2c (MAP2c) phosphorylation and regulatory protein 14-3-3ζ-binding sites reveals key differences between MAP2c and its homolog Tau.</a> JBiol Chem. 292 (24), 3-3 (2017).</li>
<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+microtubule+associated+proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of microtubule associated proteins Tau and MAP2c: Similarities and differences.</a> Biomolecules. 9 (3), E105(2019).</li>
<li>Herzog, W., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+brain+microtubule-associated+proteins%3A+Isolation+of+two+different+proteins+which+stimulate+tubulin+polymerization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fractionation of brain microtubule-associated proteins: Isolation of two different proteins which stimulate tubulin polymerization in vitro.</a> Eur J Biochem. 92 (1), 1-8 (1978).</li>
<li>Castle, A. G., Crawford, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+tubulin+from+pig+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Isolation of tubulin from pig platelets.</a> FEBS Lett. 51 (1), 195-200 (1975).</li>
<li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> Int J Mol Sci. 18 (10), E2207(2017).</li>
<li>Lafanechère, L., Job, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+tubulin+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">The third tubulin pool.</a> Neurochem Res. 25 (1), 11-18 (2000).</li>
<li>Arai, T., Ihara, Y., Arai, K., Kaziro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+from+bovine+brain+and+its+interaction+with+guanine+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin from bovine brain and its interaction with guanine nucleotides.</a> J Biochem. 77 (3), 647-658 (1975).</li>
<li>Mahaddalkar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+investigations+into+the+binding+mode+of+a+novel+noscapine+analogue%2C+9-%284-vinylphenyl%29+noscapine%2C+with+tubulin+by+biochemical+analyses+and+molecular+dynamic+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Structural investigations into the binding mode of a novel noscapine analogue, 9-(4-vinylphenyl) noscapine, with tubulin by biochemical analyses and molecular dynamic simulations.</a> J Biomol Struct Dyn. 35 (11), 2475-2484 (2017).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+study+of+novel+6-Aryl-2-benzoyl-pyridines+as+tubulin+polymerization+inhibitors+with+potent+antiproliferative+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship study of novel 6-Aryl-2-benzoyl-pyridines as tubulin polymerization inhibitors with potent antiproliferative properties.</a> J Med Chem. 63 (2), 827-846 (2020).</li>
<li>Yao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferulin+C+triggers+potent+PAK1+and+p21-mediated+anti-tumor+effects+in+breast+cancer+by+inhibiting+Tubulin+polymerization+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Ferulin C triggers potent PAK1 and p21-mediated anti-tumor effects in breast cancer by inhibiting Tubulin polymerization in vitro and in vivo.</a> Pharmacol Res. 152, 104605(2020).</li>
<li>Sweetnam, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptor+binding+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22JNat+Prod%22%5BJournal%5D)">The role of receptor binding in drug discovery.</a> JNat Prod. 56 (4), 441-455 (1993).</li>
<li>Qi, Z. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+evaluation+of+1-%28benzofuran-3-yl%29-4-%283%2C4%2C5-trimethoxyphenyl%29-1H-1%2C2%2C3-triazole+derivatives+as+tubulin+polymerization+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological evaluation of 1-(benzofuran-3-yl)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-1,2,3-triazole derivatives as tubulin polymerization inhibitors.</a> Bioorg Chem. 94, 103392(2020).</li>
<li>Sáez-Calvo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triazolopyrimidines+are+microtubule-stabilizing+agents+that+bind+the+vinca+inhibitor+site+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Bio%22%5BJournal%5D)">Triazolopyrimidines are microtubule-stabilizing agents that bind the vinca inhibitor site of tubulin.</a> Cell Chem Bio. 24 (6), 737-750 (2017).</li>
<li>Bellocq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+assembly-competent+tubulin+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22EurJ+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of assembly-competent tubulin from Saccharomyces cerevisiae.</a> EurJ Biochem. 210 (1), 343-349 (1992).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל צינורות</td><td>---</td><td>---</td><td>חומר נפוץ</td></tr><tr><td>10 מ"ל צינורות</td><td>------</td><td></td><td>חומר נפוץ</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות</td><td>---</td><td>---</td><td>חומר נפוץ</td></tr><tr><td>ATP</td><td>ROTH</td><td>HN35.2</td><td>כיתה אנליטית</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.2</td><td>דרגה אנליטית</td></tr><tr><td>הומוגנייזר זכוכית Dounce</td><td>P-LAB</td><td>H244043</td><td>הומוגנייזר</td></tr><tr><td>DTT</td><td>ROTH</td><td>6908.1</td><td>ציון אנליטי</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td>ציון אנליטי</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>PENTA</td><td>70390-11001</td><td>ציון אנליטי</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>ROTH</td><td>6967.2</td><td>כיתה אנליטית</td></tr><tr><td>כוסות בוגרות</td><td>---</td><td>---</td><td>ציוד נפוץ</td></tr><tr><td>סילינדרים מדורגים</td><td>---</td><td>---</td><td>ציוד נפוץ</td></tr><tr><td>GTP</td><td>MERCK</td><td>36051-31-7</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>PENTA</td><td>19360-11000</td> קופסה מאיזולט <td>באיכות אנליטית</td></tr><tr><td>להובלת רקמות</td><td>------</td><td></td><td>ציוד נפוץ</td></tr><tr><td>בלנדר מטבח</td><td>Waring</td><td>7011HB</td><td>כלי זכוכית או פלסטיק</td></tr><tr><td>חנקן נוזלי</td><td>---</td><td>---</td><td>חומר נפוץ</td></tr><tr><td>MES&nbsp;</td><td>ROTH</td><td>6066.4</td><td>MgCl</td></tr><tr><td>2</td><td>MERCK</td> בדרגה אנליטית <td>814733&nbsp;</td><td>ציון אנליטי</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PENTA</td><td>43180-31000</td><td>ציון אנליטי</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>PENTA</td><td>15650-11000</td><td>ציון אנליטי</td></tr><tr><td>Optima XPN100</td><td>בקמן קולטר&nbsp;</td><td>A94469</td><td>אולטרה צנטריפוגה</td></tr><tr><td>פוספוצלולוזה עמודה</td><td>VWR</td><td>GENO786-1291</td><td>עמודה ריקה</td></tr><tr><td>שרף פוספוצלולוזה</td><td>יצירתי - Biomart, inc</td><td>פוספט-001C</td><td>שרף חילופי יונים</td></tr><tr><td>צינורות</td><td>ROTH</td><td>9156.2</td><td>סכררוז בדרגה אנליטית</td></tr><tr><td></td><td>PENTA</td><td>24970-31000</td> סולמות <td>כיתה אנליטית</td></tr><tr><td></td><td>---</td><td>--- </td><td>ציוד נפוץ</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>---</td><td>---</td><td>ציוד נפוץ</td></tr><tr><td>כפות&nbsp;</td><td>---</td><td>---</td><td>פלסטיק או זכוכית</td></tr><tr><td>רוטור Ti45</td><td>בקמן קולטר&nbsp;</td><td>339160</td><td>רוטור לפינצטה אולטרה-צנטריפוגה</td></tr><tr><td></td><td>------</td><td></td><td>ציוד נפוץ</td></tr><tr><td>אולטרה טורקס IKA T18 בסיסי</td><td>IKA</td><td>356 1000</td><td>מתקן מעבדה</td></tr><tr><td>אמבט מים 37 & deg; C</td><td>---</td><td>---</td><td>מעורבב</td></tr></tbody></table>

מיטוב תפוקת טובולין מרקמת מוח חזירית

Optimizing Tubulin Yield from Porcine Brain Tissue

במהלך שלבי ההפרדה והטיהור נלקחו דגימות עבור אלקטרופורזה SDS-PAGE ולאחר מכן נותחו באמצעות צביעה כחולה קומאסית (איור 2). 20 μL מכל דגימה עורבבו עם 10 μL של חיץ דגימת Laemmli (188 mM Tris-HCl pH 6.8, 3% SDS (w/w), 30% גליצרול (v/v), 0.01 ברומופנול כחול (w/w), 15% β-מרקפטואתנול) והודגרו ב-95°C למשך 15 דקות. 4 μL מכל דגימה הועמסו על 12.5% ג'ל SDS אקרילאמיד והופרדו תחת זרם קבוע של 30 mA לג'ל בתנאי הפחתה ודנטורציה.
התוצאות אישרו עלייה הדרגתית בריכוז הטובולין היחסי המלווה בירידה בחלבונים מזהמים. יתר על כן, לא היה אובדן משמעותי של טובולין בליזט מזוקק בצנטריפוגה הראשונה (שלב 3.2.7) בהשוואה להשמטת שלב זה (איור 2A,B).
ריכוז החלבון נקבע באמצעות שלוש שיטות עצמאיות: בדיקת BCA, בדיקת חלבון ברדפורד וניתוח דנסיטומטריה בג'ל SDS-PAGE19 (איור 3). התשואה הכוללת של טובולין באמצעות ההליך המתואר הייתה 123 מ"ג של טובולין מטוהר מ 250 גרם של רקמה עצבית. במהלך המדידות יש לקחת בחשבון שלריכוז ה-DTT הגבוה במאגר האחסון יש השפעה משמעותית על בדיקת BCA. הן מאגר PEM והן מאגר PBS, בתוספת DTT, מגדילים את ספיגת הרקע בכ- 0.900 A595, מה שמקטין באופן משמעותי את קיבולת בדיקת BCA (איור 3A). ההשפעה השלילית של DTT ניתנת לזיהוי גם לאחר דילול פי עשרה עם מים טהורים (הנתונים אינם מוצגים). נראה כי בדיקת ברדפורד לא הושפעה ממאגר האחסון (איור 3B), כפי שאושר על-ידי ניתוח צפיפות.
טוהר הכנת טובולין אומת על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסות בשני מתקנים עצמאיים (VRI Brno, צ'כיה; CEITEC MU Brno, צ'כיה) באמצעות יינון אלקטרוספריי ו- MALDI-TOF. שני הניתוחים אישרו את נוכחותם של טובולינים חזיריים אלפא ובטא במספר איזופורמים. הטוהר הכללי היה יותר מ-97.07% (PSMs 1065), כאשר הזיהומים הנפוצים ביותר מקורם בהומו ספיינס קרטין סוג II (PSMs 246, 2.24% מהזיהומים) אשר הוכנסו ככל הנראה במהלך בידוד טובולין והכנת הדגימה לניתוח MS/MS. זיהומים אחרים המורכבים מ-322 PSMs ורק אלבומין בסרום, גמא אקטין וטריפסינוגן שמקורם ב-Sus scrofa זוהו ברזולוציה פפטידית אחת (0.0069%).
בניסויים הבאים אומת שימור יכולת הפילמור לאחר הקפאת בזק ואחסון בחנקן נוזלי. האליקוט 10 מ"ג/מ"ל הוסר מחנקן נוזלי והופשר לאט על קרח. דגימות בריכוזים שונים (10 מ"ג/מ"ל, 8 מ"ג/מ"ל, 6 מ"ג/מ"ל, 4 מ"ג/מ"ל ו-2 מ"ג/מ"ל) הוכנו על ידי דילול האליציטוטים במאגר PEM המכיל DTT, ATP ו-GTP לצורך ניסוי ההרכבה העצמית. סדרת דילול אחת הודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, והשנייה הודגרה על קרח במשך 60 דקות. שתי הסדרות היו צנטריפוגות במשך 60 דקות בטמפרטורה של 21,000 x גרם ובטמפרטורה המתאימה (4°C או 37°C). 30 μL של supernatant הוסר ושימש עבור SDS-PAGE. הסופרנאטנט שנותר הוסר בזהירות באמצעות פיפטה והושלך לפח. הכדוריות נשטפו לזמן קצר על ידי הוספת 100 מיקרומטר של חיץ PEM, ולאחר מכן הסרה מיידית באמצעות פיפטה. לאחר מכן, הכדורים הושעו מחדש ב-50 מיקרוליטר של חיץ העמסת SDS מרוכז פי 1, כך שהריכוז היחסי של הגלולה והסופרנאטנט נשמר. 10 μL של חיץ העמסת SDS נוסף לכל סופרנטנט. כל הדגימות נותחו באמצעות SDS-PAGE וצביעת קומאסי (איור 4). נפח כל דגימה שנטענה ל- SDS-PAGE הותאם בהתאם לריכוז ההתחלתי, ולכן ההבדל במשקעים עקב הריכוז בולט יותר. בדיקת ההרכבה העצמית של טובולין במאגר PEM אישרה את היכולת ליצור סיבי טובולין באופן תלוי טמפרטורה.
בדיקת ההרכבה של טובולין20,21 המונעת על ידי MAP2c המאמתת את יכולתו של טובולין לתקשר עם חלבונים אחרים בוצעה22. הדילולים הסדרתיים של MAP2c הוכנו כאשר 100 μL של 1 מ"ג / מ"ל טובולין aliquots עורבבו עם MAP2c לריכוז הסופי שנע בין 0 μM ל 8 μM. כל הדגימות הוכנו על קרח על ידי דילול במאגר PEM טרי שהוכן עם 1 mM DTT ו- 1 mM GTP. הטובולין הודגר במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C עם ריכוזים שונים של MAP2c, וצנטריפוגה במשך 60 דקות בטמפרטורה של 21,000 x גרם ו-37°C. השטיפה הסופית של הגלולה בוצעה פעמיים עם 100 μL של חיץ PEM. הניסוי אישר את יכולתו של הטובולין המוכן לעבור פילמור מונחה MAP2c, מאחר שרק הדגימה ללא MAP2c לא יצרה גלולה (איור 5).
מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת שימש גם כדי לאשר את נוכחותם של חוטי טובולין מניסויי פילמור משותף. תרחיפים של טובולין מטוהר עם MAP2c הוכנו למיקרוסקופ אלקטרונים שידור באמצעות צביעה שלילית. הדגימות נספגו על רשתות נחושת מצופות פורמבר ומיוצבות פחמן. לאחר מכן הוכתמו הרשתות באופן שלילי עם 2% NH4MoO4 ונבדקו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים בהגדלה של פי 18,000 ובמתח מואץ של 80 קילו וולט. נוכחותם של מיקרוטובולים הומוגניים בעלי מבנה נימה ברור וגודל מתאים הראתה את היכולת ליצור מיקרוטובולים בקונפורמציה טבעית (איור 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig01.jpg"> איור 1: תרשים סכמטי של הפרדה וטיהור טובולין. המספר בסוגריים מתייחס לשלב הפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig02.jpg"> איור 2: הפרדה וטיהור טובולין. (A) ניתוח SDS-PAGE של דגימות שנלקחו במהלך הפרדת טובולין תוך שימוש בפילמור מונחה טמפרטורה (3 מיקרוליטר לשורה). ניתן לראות את הירידה בזיהומים עם עלייה יציבה בשפע טובולין יחסי (כ -50 kDa). המספרים מעל כל שורה תואמים למספר השלב בפרוטוקול. (B) ניתוח SDS-PAGE של שברים המתקבלים לאחר כרומטוגרפיה של חלבון על שרף פוספו-צלולוז (4 מיקרוליטר לשורה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig03.jpg"> איור 3: ריכוז חלבונים. סדרת הדילול של אלבומין בסרום בקר של עד 1 מ"ג/מ"ל במאגר PEM או PBS הושוותה לסדרת דילול BSA המכילה 0.1 ATP, 1 mM GTP, 1 mM DTT בנפרד או בשילוב (0.1 mM ATP, 1 mM GTP ו-1 mM DTT) במאגר PEM או PBS. (A) כאשר נעשה שימוש בבדיקת BCA, חל שינוי משמעותי ברקע של דגימות המכילות DTT (סמלים מוצקים). (B) השפעה זו לא זוהתה כאשר נמדדו ריכוזים בבדיקת ברדפורד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig04.jpg"> איור 4: בדיקת הרכבה עצמית של טובולין. ניתוח SDS-PAGE של בדיקת ההרכבה העצמית אישר את היכולת של טובולין מאוחסן מודגר ב (A) 4 ° C או (B) 37 ° C כדי להתפלמר באופן תלוי טמפרטורה בספקטרום רחב של ריכוזים. (P - כדור, S - סופרנטנט; ריכוז הטובולין בהתאמה מסומן מעל כל זוג שורות; כמות כל דגימה שהוטענה הייתה 10 מיקרוגרם). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig05.jpg"> איור 5: בדיקת שיקוע משותף של טובולין. ניתוח SDS-PAGE של הרכבת טובולין בסיוע MAP2c אישר את היכולת של טובולין מאוחסן לעבור פילמור המונע על ידי אינטראקציה עם חלבון הקשור למיקרוטובולים באופן תלוי ריכוז. הריכוז המולרי של MAP2c מצוין מעל כל שורה. (P - גלולה, S - supernatant). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig06.jpg"> איור 6: מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. המיקרו-תצלומים של TEM הראו כי טובולין מתכנס (A) למיקרוטובולים בקוטר מתאים (B) המורכבים מחוטי טובולין הומוגניים המעוטרים בחלבוני MAP2c. הסרגל מתאים ל- 1000 ננומטר (A) ו- 200 ננומטר (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Neural tissue from any source is an excellent material for tubulin isolation, as the dendrites and axons of neurons are rich in microtubules. Here, we ...

optimizing-tubulin-yield-from-porcine-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

הסרטון מדגים בידוד של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים חודרי גידול ממוח עכבר באמצעות דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימטי. זה ואחריו צפיפות הדרגתית צנטריפוגה לאסוף את התאים החיסונית לניתוח נוסף.

בידוד תאי חיסון חודרי גידול ממוח מוריני

סרטון זה מדגים את בידוד הנימים ממוחות חזיריים טריים. התהליך כולל הסרת קרומי המוח, בידוד החומר האפור מרקמת המוח, הומוגניזציה וסינון של החומר האפור כדי לבודד את הנימים, ולבסוף שימוש בעיכול אנזימטי כדי לטהר את הנימים עוד יותר.

טיהור נימים ממוח חזירי

סרטון זה מדגים את תהליך בידוד כלי הדם במוח מחולדות שעברו המתת חסד. הוא כולל דיסקציה של המוח, ניקוי הרקמה, ועיכול מכני, ואחריו צנטריפוגה חוזרת ונשנית כדי לבודד את החלק הטהור של microvessels.

שיטה לבידוד יחידות נוירו-וסקולריות ממוח חולדה

בעוד שמבנה הריבוזום אופיין בהרחבה, ארגון הפוליזומים עדיין לא נחקר. כדי להתגבר על חוסר ידע זה, אנו מציגים כאן פרוטוקול הכנה מפורט להדמיה מדויקת של פוליזומים של יונקים על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) באוויר ובנוזל.

מציץ המוח Polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי

המטרה של הפרוטוקול היא להציג את הליך בלתי אופטימליים להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי הראשי (pBECs). המודל מראה הפארמצבטית גבוהה, אטימות גבוהה, מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת גילוי סמים.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

פרוטוקול זה נועד ביעילות לכמת אוביקוויב-פרוטאסדום מערכת (UPS) פעילות בתאים סלולריים שונים של המוח מכרסם. משתמשים יכולים לבחון את התפקוד UPS בתוך שברים גרעיניים, cytoplasmic וסינפטית באותו בעל חיים, הפחתת כמות הזמן ומספר בעלי החיים הדרושים כדי לבצע ניתוחים אלה מורכבים.

בדיקת כימות משנית אוביקוויאין-פעילות פרוטאסדום במוח מכרסם

אנחנו מציגים פרוטוקול להפקת. קרום המוח של מורציטים פרוטוקול זה הינו כלי רב ערך עבור מחקרים בלתי מתורבת המספקים טוהר גבוה ותשואה גבוהה, ובכך מקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות.

שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר

פרוטוקול זה מתאר טיהור טובולין ממקורות קטנים/בינוניים כגון תאים תרבותיים או מוחות של עכבר יחיד, באמצעות מחזורי פולמור והדפולימוריזציה. טובולין מטוהר מועשר איזוטיפים ספציפיים או יש שינויים פוסט-טרנסלציה ספציפיים והוא יכול לשמש במבחנה reconsays ללמוד דינמיקה microtubule ואינטראקציות.

טיהור טובולין עם שינויים מבוקרים לאחר טרנסלציה ואיזוטיפים ממקורות מוגבלים על ידי מחזורי פידול-דפולימריזציה

אנו מדווחים על בדיקה פשוטה, יעילה בזמן וספקטרוסקופיה מבוססת תפוקה גבוהה לכימות סיבי אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו מרקמות המוח של מכרסמים ונבדקים אנושיים.

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

מיקרוטובולים, שהם פולימרי טובולין, ממלאים תפקיד מכריע כמרכיב שלד ציטוקריוטי בתאים אאוקריוטים וידועים בחוסר היציבות הדינמי שלהם. מחקר זה פיתח שיטה להפרדת מיקרוטובולים כדי להפריד אותם למיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים שפתיים וטובולין חופשי כדי להעריך את יציבותם של מיקרוטובולים ברקמות עכבר שונות.

טכניקת שבירת מיקרוטובולים כמותית להפרדת מיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים לאביליים וטובולין חופשי ברקמות עכבר

אנו מדווחים על טכניקה המאפשרת הדמיה חיה של דינמיקה של מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה (GBM) הפולשים לרקמת מוח של בעלי חוליות. צימוד ההזרקה האורתוטופית של תאי GBM המתויגים באופן פלואורסצנטי למוח שקוף של דגי זברה עם הדמיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה מאפשר מדידה של דינמיקת השלד הציטוסקולרי במהלך פלישת סרטן באתרו .

הדמיה חיה של דינמיקת מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה הפולשים למוח דג הזברה

למדו שיטה לבידוד טובולין בטוהר של מעל 99% מרקמת מוח חזירית תוך שמירה על דינמיקה טבעית. הפרוטוקול משמש לחקר מבנה עצבוני, נוירופלסטיות ומחלות נוירודגנרטיביות.

מיטוב תפוקת טובולין מרקמת מוח חזירית

גלה סרטונים נוספים