עריכת בסיס יעילה ללא PAM עבור דגי זברה מידול של מחלות גנטיות אנושיות עם zSpRY-ABE8e
17 בפברואר 2023
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע עריכה יעילה של בסיס אדנין ללא הגבלת PAM כדי לבנות מודל מדויק של מחלת דגי זברה באמצעות zSpRY-ABE8e.
פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לבנות מספר מודלים של דגי זברה שלא היו זמינים בעבר של וריאנטים חד-נוקלאוטידים רלוונטיים למחלות. מגבלות PAM הן מכשול עיקרי ליצירת מודלים מדויקים של בעלי חיים, ו- zSpRY-ABE8e מאפשר המרה יעילה של אדנין לבסיס גואנין עם אינטרמוטציה נמוכה והגבלת PAN רגועה. כלי זה יכול לשמש לבניית מודלים מדויקים של דגי זברה לחקר המאפיינים הפתוגניים של מנגנוני מחלה הקשורים לנחתים בעלי נוקלאוטיד יחיד, כמו גם סינון תרופות למחלה זו.
כדי להתחיל, להגדיר את מערכת מושך micropipette לחמם מראש לפחות 30 דקות. כדי למשוך את נימי הזכוכית, בחר תוכנית, הגדר את ערך בדיקת הרמפה כחום, 50 כמשיכה, את המהירות ב- 100, את הזמן כ- 50 ואת הלחץ כ- 30. לאחר מכן, התקן את צינור הנימים וודא שהוא נמצא בחריץ.
לחץ על משוך, הפעל/עצור"כדי להפעיל את התוכנית. כדי לשמר את הנימים שנמשכו, הכניסו אותם לקצף המכיל רווחים השומרים על המחט מרחפת. לניסויים, השתמש ב- zSpRY-ABE8e mRNA המתואר בכתב היד, וערוך בקלות sgRNA שונה עם 2'O-methyl phosphorothioate בשני הקצוות.
עבור תכנון gRNA, העדיפו לבחור NRN כרצף PAM, מכיוון ש-zSpRY-ABE8e מראה העדפה גבוהה יותר ל-NRN PAM מאשר ל-NYN PAM. הזן את נוקלאוטיד המטרה אדנין נמצא בחלון העריכה הפעיל ביותר מהנוקלאוטיד השלישי לתשיעי לאורך הפרוטוספייסר. הקימו מיכלי רבייה בלילה שלפני ההזרקה.
הכניסו מחיצה, והניחו שתי נקבות וזכר אחד של דגי זברה בכל מיכל. הניחו מכסה מעל כל מיכל. למחרת בבוקר, באמצעות טיפים, צינורות וכפפות נטולי RNase, מערבבים את ה-mRNA המופשר ואת ה-EEgRNA על קרח לריכוז סופי של 400 ו-200 ננוגרם למיקרוליטר, בהתאמה.
כדי להגדיר את המיקרו-מזרק הפנאומטי, ראשית, סגור את שסתום הלחץ החלקי של משאבת האוויר. לאחר מכן, פתח את השסתום הראשי, פתח את בלון הגז והתאם את הלחץ של שסתום הלחץ החלקי ל -0.2 מגה-פסקל. עכשיו, להפעיל את microinjector ולהגדיר את המצב טיימר.
התאם את שסתום לחץ הפרמטר ל- 20 פאונד לאינץ 'מרובע ואת ערך הטיימר ל- 0.040 שניות. באמצעות מלקחיים עדינים, שוברים באופן זוויתי את המחטים של נימי הזכוכית שנמשכו תחת מיקרוסקופ סטריאו. באמצעות קצה פיפטה microloader, להוסיף את תערובת mRNA/gRNA לקצה של נימי זכוכית ולחבר את המחט micromanipulator.
הגדר את ערך הלחץ והטיימר כדי לייצר תערובת של שני ננוליטרים בכל הזרקה באמצעות microcap. לאחר גידול הדג במשך 10 עד 15 דקות, לאסוף את הביצים במסננת. בחנו את שלב התא ואת איכות הביצים תחת מיקרוסקופ סטריאו.
בחר ביצים חד-תאיות להזרקה כדי לשפר את יעילות העריכה. מרפדים את הביציות על צלחת הזרקה של 1.5% אגרוז ומזריקים שני ננוליטרים של תערובת הרנ"א לתא העוברים באמצעות מיקרוסקופ. אוספים את הביצים בצלחות פטרי עם E3 Buffer ודגורים עליהן בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס.
הסר את הביציות המתות ושנה את חיץ התרבית כל 12 שעות למשך 48 שעות לאחר ההפריה. לאחר 48 שעות לאחר ההפריה, אספו שלוש בריכות של שישה עוברים מוזרקים שנבחרו באופן אקראי לתוך צינור PCR. לאחר איסוף שישה עוברי ביקורת שנבחרו באופן אקראי, השתמשו בפיפט כדי לשאוף את מאגר E3 השיורי.
הוסף 40 מיקרוליטר של 50 מילימולר נתרן הידרוקסידי לעוברים. הניחו את הצינורות באמבט מתכת בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ולאחר מכן ערבלו במשך 15 שניות. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של טריס הידרוכלוריד טוחנת אחת ב- pH שמונה לכל צינור.
צנטריפוגו את הצינורות ב 2000 גרם למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר. העבירו את הסופרנאטנט לצינור PCR חדש. הוציאו מיקרוליטר אחד של הסופרנאטנט מצינור ה-PCR והשתמשו בו לריצוף סנגר.
לאחר מכן אחסנו את יתרת הסופרנאטנט בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. כדי לנתח את נתוני הרצף של Sanger, התחל בהעלאת קובץ הרצף לתיבת ההעלאה ab1 File"box. הזן את רצף gRNA של 20 זוגות בסיסים בכיוון 5'עד 3', בתיבה הזן gRNA"sequence.
הזן את מיקום הבסיס המתאים בתיבות 5'start ו- 3'end. השגת יעילות העריכה הבסיסית על ידי לחיצה על עריכה חזויה "ובדיקת איכות נתוני הרצף. מודל של דג זברה אנמיה שחורת יהלום נבנה על ידי המרת האדנין של קודון ההתחלה של Tsr2 לגואנין.
ניתוח EditR של נתוני רצף הדגים חפיפה AG בבסיס אדנין של קודון ההתחלה Tsr2. הפנוטיפ של שני עוברי Tsr2 בני היום הראה עיניים קטנות יותר בהשוואה לעוברי הביקורת. קרום הלב נפוח נצפה גם בעוברים המוטנטים.
על מנת להשיג עריכת בסיס יעילה, אנא עקוב בקפידה אחר עקרון התכנון המנחה שהוזכר לעיל, שהוא תנאי מוקדם להצלחת הניסוי. מודלים מדויקים חיוניים לחקר מחלות הקשורות לגרסאות של נוקלאוטיד יחיד. הפיתוח של SprY-ABE8e מספק כלי יעיל למידול מדויק, המסייע לקדם את המחקר של מנגנוני מחלה וטיפולים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה מתקדמת ליצירת מודלים ספציפיים של מחלות בדגי זברה באמצעות מערכת zSpRY-ABE8e, המאפשרת עריכת בסיסי אדנין יעילה ללא הגבלות PAM. חידוש זה חיוני למידול מדויק של מחלות הקשורות לווריאנטים של נוקלאוטיד בודד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- גנטיקה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- מגבלות ה-PAM מעכבות יצירה מדויקת של מודלים של בעלי חיים.
- וריאנטים של נוקלאוטיד בודד חשובים להבנת מנגנוני מחלה.
- מערכת ה-zSpRY-ABE8e מציעה פתרון למגבלות אלו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- המרה של בסיס אדנין לגואנין באמצעות zSpRY-ABE8e.
- דג הזברה כאורגניזם המודל.
- טכניקות של מיקרו-הזרקה לעריכה גנומית.
תוצאות עיקריות
- פותח מודל מוצלח לאנמיה של דיימונד-בלאקפאן (Diamond-Blackfan Anemia).
- נצפו פנוטיפים שונים בעוברים, כגון עיניים קטנות יותר ופריקרדיום נפוח.
- המתודולוגיה מספקת מסגרת למחקרים עתידיים על מחלות הקשורות לווריאנטים של נוקלאיד בודד.
מסקנות
- מחקר זה מדגים גישה חדשנית למידול מדויק של מחלות בדגי זברה.
- הממצאים משמעותיים לקידום המחקר על מחלות גנטיות והתערבויות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
עריכה של בסיסים ללא תלות ב-PAM באמצעות zSpRY-ABE8e מאפשרת יצירת מודלים של דגי זברה למחלות הנגרמות מווריאנטים של נוקליאוטיד בודד בבני אדם, אשר לא היו נגישים בעבר לתהליכי עבודה של CRISPR. הדבר מרחיב את התועלת התרגומית של דגי זברה למחקרים מכניסטיים של מחלות ולסריקת תרופות בשלבים מוקדמים. גישה זו נותנת מענה ישיר לצוואר בקבוק מרכזי בדיוק של מודלים פרה-קליניים ובתיקוף מטרות עבור תהליכי פיתוח למחלות גנטיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מידול מדויק של SNVs רלוונטיים למחלה לצורך בחינה תפקודית של מטרות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית באמצעות שכפול של מוטציות פתוגניות אנושיות in vivo.
- משפר את הביטחון החיזויי (predictive confidence) לקשירה בין מטרה למחלה בהפרעות גנטיות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מסייע ביצירת מודלים מאושרים של zebrafish לסריקה פנוטיפית בהמשך התהליך.
- מספק רקעים גנטיים סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- מאפשר הערכה כמותית של השפעות תרופתיות על פנוטיפים רלוונטיים למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים של דגי זברה למנגנוני מחלה המונעים על ידי SNV בבני אדם לצורך רצף תרגומי.
- תומך בגילוי ובתיקוף של סמנים ביולוגיים במערכות מדויקות גנטית.
- מפחית את הסיכון לנשירה בשלבים מאוחרים עקב חוסר רלוונטיות של המודל.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול ה-zSpRY-ABE8e משתלב בממשק שבין הגילוי המוקדם לפיתוח מודלים פרה-קליניים, ומגשר בין שלבי תיקוף המטרה לבין שלבי סריקה פנוטיפית.
- ביולוגיה של תגליות: מאפשרת בדיקת השערות לגבי פתוגניות של SNV ומיפוי מסלולים in vivo.
- סריקה: מספקת מודלים מוגדרים גנטית עבור קמפיינים של סריקה חסונים וניתנים לשחזור.
- אנליטיקה: מספקת יעילות עריכה כמותית ותוצאות פנוטיפיות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר טרנסלציונלי: מבטיחה שמודלים של מחלות ישקפו את הארכיטקטורה הגנטית האנושית לצורך התאמה של ביומרקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה רב-פעמית למידול מחלות מגוונות המונעות על ידי SNV בדגי zebrafish.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במידול מחלות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של יצירת מודלים ואנליזת עריכה עבור תהליכי עבודה ניתנים להרחבה (scalable).
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go והקצאת הון על ידי הגברת הרלוונטיות של המודל.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של תוכניות למחלות גנטיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בדגי zebrafish, מיקרו-הזרקה ותכנון עריכה בבסיס (base editing) באמצעות CRISPR.
- נדרשת גישה לציוד מיקרו-הזרקה, ריצוף Sanger וכלים לניתוח רצפים.
- נדרש סטנדרטיזציה קפדת בין הצוותים לתכנון gRNA וניתוח העריכה.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- יש לתקף באופן אמפירי את יעילות העריכה ואת השפעות המטרה השגויה (off-target effects) עבור כל אתר מטרה.
