הערכת רמות אוטופגיה בשני מודלים שונים של תאי לבלב באמצעות LC3 immunofluorescence

האימונופלואורסנציה LC3 מאפשרת קביעת רמות אוטופגיה בתאי הלבלב. זה מאפשר ללמוד את ההשפעות האפשריות של סוכנים שונים על אוטופגיה של תאי הלבלב. אימונופלואורסנציה היא טכניקה המשמשת לזיהוי חלבון LC3 אנדוגני, אשר מונע בעיות הנגרמות על ידי ביטוי יתר של LC3, כגון יצירת אגרגטים חלבוניים שאינם קשורים לאוטופגיה.

מי שידגימו את ההליך יהיו פליפה רנה, בוגר דוקטורט, ומלנה הררה לופז, דוקטורנטית מהמעבדה של מריה אינס ואקארו. כדי להתחיל בהכנת התא, יש להשרות את החלקות הכיסוי העגולות בקוטר 12 מ"מ באתנול מוחלט. לאחר הסרת הכיסוי, מניחים את הכיסוי הספוג בצורה אנכית בצלחת בעלת 24 הבארות.

חשוף את צלחת רב באר לקרינה אולטרה סגולה במשך 15 דקות. לאחר מכן מקם את הכיסוי להחליק אופקית ולשטוף אותו עם DMEM. כעת ראו את מספר המעבר הנמוך של תאי הלבלב, התלויים מחדש ב-DMEM, המכילים 10% FBS, פניצילין וסטרפטומיצין, ודגרו על התאים במשך יומיים.

יומיים לאחר זריעת תאים, הכינו תמיסת גמציטאבין ב-DMEM בריכוז של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר. לאחר מכן שואפים מחצית הנפח מכל באר בצינור נפרד, ומוסיפים כמות מתאימה של תמיסת גמציטאבין. מחזירים את חצי הנפח המתאים לכל באר בחזרה לבארות המטופלות, ודגרים על התאים למשך 24 שעות.

לקיבוע וחדירה של התאים, מוסיפים מתנול קר לצלחת בת 24 בארות המכילה תאים. הכינו גם צלחת שש בארות עם PBS קר. בעזרת מחט מזרק ופינצטה, קחו כל מכסה ושטפו אותו פעמיים ב-PBS.

ואז לדגור מתנול במשך שש דקות. לאחר שטיפה פעמיים עם PBS, יש לדגור על החלקות הכיסוי בתמיסת חסימה למשך שעה. הוסף אנטי LC3 בתמיסת החסימה ביחס של אחד עד 1000, ושמור על קרח.

הניחו פיסת סרט איטום מעבדה מעל המכסה הרב-באר, והוסיפו 25 מיקרוליטר של תמיסת אנטי-LC3 לכל כיסוי מעל סרט האיטום. בעזרת מחט מזרק ופינצטה, הניחו כל כיסוי על טיפת הנוגדנים הראשונית, וודאו שצד התא נמצא במגע עם התמיסה. הכניסו את הצלחת מרובת הבארות לתא הלחות.

מכסים אותו בנייר כסף ודוגרים לילה במקרר. למחרת, הסר את הצלחת מרובת הבארות מתא הלחות. הניחו את החלקות הכיסוי בחזרה על הצלחת מרובת הבארות ושטפו אותן עם PBS שלוש פעמים.

לדלל נגד ארנב מסומן פלואורסצנטית בתמיסת חסימה ביחס של אחד עד 800, ולשמור על קרח בחושך. לאחר איטום המכסה הרב-באר, מוסיפים 25 מיקרוליטר של תמיסת אנטי-ארנב לכל כיסוי מחליק על סרט האיטום. ולטפל בתלוש הכיסוי עם נוגדן משני כפי שהודגם בעבר.

לאחר מכן לדגור על הצלחת בתא הלחות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה עם נוגדן, לשטוף את החלקות כיסוי על צלחת רב באר עם PBS שלוש פעמים. יש לדגור על כל מכסה עם תמיסת DAPI מוכנה למשך 10 דקות.

לאחר השטיפה עם PBS, לשמור על צלחת רב באר בחושך. למונטאז' סלולרי, הכינו שתי כוסות עם מים ופיסת נייר. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת PVA-DABCO לכל החלקת כיסוי על שקופית.

לשטוף את הכיסוי להחליק במים, ולאחר מכן לייבש אותו על נייר. לבסוף, הניחו אותו מעל טיפת PVA-DABCO. ויבש לילה בחושך.

למחרת, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, לדמיין את התאים המסומנים וללכוד את התמונות. לאחר לכידת תמונות, גרור ושחרר כל קובץ תמונה המכיל את הערוצים שצולמו במסך פיג'י. בתיבת הדו-שיח, לחץ על אישור כדי לפתוח את התמונה.

לאחר מכן סגור את חלון הקונסולה שנפתח. בכרטיסיה תמונה, בחר צבע ולאחר מכן פצל ערוצים. סגור את התמונה המתאימה לערוצים שאינם תמונת LC3.

לאחר מכן, בכרטיסיה תמונה, בחר התאמה, ולאחר מכן איזון צבע. הזיזו את המחוון המרבי שמאלה עד לרוויית התמונה כדי להציג באופן חזותי את קווי המתאר של התא. השתמש בכלי הבחירה החופשית כדי לצייר את קו המתאר של התא, ולחץ על איפוס כדי להתאים את הצבעים.

כדי לגזור את הפריט שנבחר מהכרטיסיה עריכה, בחר גזור וסגור את התמונה מבלי לשמור אותה. ומהכרטיסייה עריכה, בחר הדבק. בתפריט 'נתח', בחרו בכלי 3D Objects Counter.

הגדר את הסף ל- 2000 ואת מסנן הגודל ל- 50 עד 500. ודא שהאובייקטים ותיבות הסיכום מסומנים, ולחץ על OK.In חלון היומן, מספר הנקודות יתואר כאובייקטים שזוהו. האימונופלואורסנציה הצביעה על התפלגות התא של חלבון LC3, בעוד שה- DAPI הראה לוקליזציה גרעינית בתאי הלבלב.

נקודות LC3 גדלו באופן משמעותי תחת טיפול בגמציטאבין, מה שמצביע על פעילות אוטופגית. תחת מפגש מוגזם, תאי הלבלב האקסוקריניים נוטים להיערם ולגדול זה על גבי זה. שיטת קיבוע תאי הפרפורמלדהיד לא הייתה יעילה לשימור חלבוני LC3, מכיוון שלא שיקפה פיזור מדויק.

כאשר הקיבוע או הטיפול בוצעו ללא המתנה יומיים לאחר הזריעה, תאי PANC1 היו בעלי צורה עגולה. מורפולוגיה זו הפחיתה את הקשר בין הציטופלסמה לגרעין, והקשתה על הבנת ההתפלגות התוך-תאית של LC3. קיבוע מתנול לא שלם עלול להפריע לתיוג חיסוני תקין של LC3, מה שמוביל לתמונות לא ברורות ולכימות תת-אופטימלי.

הדבר החשוב ביותר לזכור במהלך הליך זה הוא כי התאים חייבים להיות קבועים מתנול קר במשך שש דקות, במקום paraformaldehyde. בעקבות הליך זה, ניתן לנתח לוקליזציה בין LC3 וחלבונים אחרים, המאפשרת לימוד מסלולים מולקולריים שונים הקשורים לפונקציות LC3.