Name: הערכת רמות אוטופגיה בשני מודלים שונים של תאי לבלב באמצעות LC3 immunofluorescence (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: למדו להעריך רמות אוטופגיה בתאי לבלב באמצעות שיטת immunofluorescence של LC3. פרוטוקול זה מדגים כיצד לכמת נקודות LC3 ולחקור את השפעת גמציטאבין על פעילות האוטופגיה בתאי סרטן הלבלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מאוניברסיטת בואנוס איירס (UBACyT 2018-2020, 20020170100082BA), המועצה הלאומית למחקר מדעי וטכנולוגיה (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; ו- PUE 22920170100033) והסוכנות הלאומית לקידום מדעי וטכנולוגי (PICT 2019-01664).

1. הכנת תאים
<ol><li>משרים כיסויים עגולים בקוטר 12 מ"מ באתנול מוחלט, ומניחים אותם במאונך בבארות של צלחת בת 24 בארות.</li>
	<li>הסר את הכיסוי, ולחשוף את צלחת רב באר לקרינה אולטרה סגולה במשך 15 דקות.</li>
	<li>מקמו את הכיסויים בצורה אופקית, וכבסו אותם עם מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco.</li>
	<li>זרע מספר מעבר נמוך של תאי הלבלב. יש להתאים את הסכום לקבלת מפגש של 50%-75% ביום הקיבוע16. הערה: מומלץ לזרוע 2.5 × 104 PANC-1 או 4 × 104 תאי AR42J לכל באר כדי לקבע את התאים לאחר 3 ימים.</li>
	<li>תרבית את התאים ב-DMEM המכילים 10% נסיוב בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין באינקובטור בטמפרטורה של 37°C תחת אטמוספירה לחה עם 5% פחמן דו-חמצני (CO2). הערה: עבור תאי PANC-1, מומלץ לדגור על התאים במשך יומיים בין זריעת התאים לבין השלבים הבאים. לאחר זמן זה, התאים יכולים להיות נגועים, מטופלים, או מקובעים. פרוטוקול זה מדגים את הטיפול בגמציטאבין בתאי PANC-1 שאינם נגועים ואת התמיינות וטיפול PP242 בתאי AR42J שאינם נגועים.</li>
</ol>2. טיפול בתאים
<ol><li>טיפול בגמציטאבין לתאי PANC-1<ol><li>הכינו תמיסה של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר גמציטאבין ב-DMEM יומיים לאחר הזריעה. טפל בכל באר עם 2.6 μL של 1 מיקרוגרם / μL תמיסת gemcitabine כדי להשיג דילול סופי של 20 μM.</li>
		<li>דוגרים על התאים במשך 24 שעות באינקובטור.</li>
	</ol></li>
	<li>התמיינות AR42J וטיפול PP242<ol><li>הכן תמיסה של 4 מיקרוגרם / מ"ל dexamethasone ב DMEM.</li>
		<li>טפל בכל באר עם 4.9 μL של 4 מיקרוגרם / מ"ל dexamethasone פתרון כדי לקבל דילול סופי של 100 ננומטר.</li>
		<li>דוגרים על התאים במשך 48 שעות באינקובטור.</li>
		<li>הסר את המדיום, ולטפל בכל באר עם 0.5 μL של 1 mM PP242 כדי לקבל דילול סופי של 1 μM.</li>
		<li>דוגרים על התאים במשך שעתיים באינקובטור.</li>
	</ol></li>
</ol>3. תיקון וחדירה של התאים
<ol><li>הכינו צלחת 24 בארות עם מתנול קר וצלחת 6 בארות עם מלח חוצץ פוספט קר (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH2PO4). שמור אותם על קרח.</li>
	<li>קחו כל כיסוי בפינצטה, שטפו אותו פעמיים ב-PBS ודגרו במשך 6 דקות במתנול.</li>
</ol>4. חסימת התאים
<ol><li>יש לשטוף כל כיסוי פעמיים ב-PBS, ולדגור במשך שעה אחת בסרום בקר עוברי 10% ב-PBS (תמיסת חסימה). הערה: בשלב זה, ייתכן שהפרוטוקול יושהה. את הכיסויים ניתן לאחסן למשך הלילה במקרר בתמיסת החסימה, ולהמשיך את הפרוטוקול למחרת.</li>
</ol>5. דגירה על הכיסויים עם הנוגדן הראשוני
<ol><li>הכינו תמיסה ביחס 1:1,000 של אנטי-LC3 בתמיסת החסימה, ותחזקו אותה על קרח.</li>
	<li>הניחו פיסת סרט איטום מעבדה על מכסה רב בארות.</li>
	<li>יש להניח טיפה אחת (25 μL) לכל כיסוי של תמיסת אנטי-LC3 מעל סרט האיטום.</li>
	<li>קח כל כיסוי עם פינצטה, ומניחים אותו מעל טיפת הנוגדנים הראשונית, דואג שצד התא יהיה במגע עם התמיסה.</li>
	<li>הכינו תא לח על ידי הנחת פיסת נייר לחה בקופסת פלסטיק בעלת תחתית שטוחה.</li>
	<li>מכניסים את הצלחת מרובת הבארות לתא הלחות, מכסים אותה בנייר כסף ודורים לילה במקרר.</li>
</ol>6. דגירה על הכיסויים עם הנוגדן המשני
<ol><li>מוציאים את הצלחת מרובת הבארות מתא הלחות, ומחזירים את הכיסויים לצלחת מרובת הקידוחים.</li>
	<li>בצע שלוש שטיפות עם PBS.</li>
	<li>הכינו תמיסה של אנטי-ארנב עם תווית פלואורסצנטית עם דילול של 1:800 בתמיסת החסימה, ושמרו אותה על קרח מוגן מפני אור.</li>
	<li>הניחו פיסת סרט איטום על המכסה הרב-באר.</li>
	<li>יש להניח טיפה (25 μL) לכל כיסוי של תמיסת אנטי-ארנב מעל סרט האיטום.</li>
	<li>קח כל כיסוי עם פינצטה, ומניחים אותו מעל טיפת הנוגדנים הראשונית, דואג שצד התא יהיה במגע עם התמיסה.</li>
	<li>דגרו על הצלחת מרובת הבארות בתא הלחות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT) המוגנת מפני אור.</li>
</ol>7. צביעת התאים עם 4′ ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)
<ol><li>מוציאים את הצלחת מרובת הבארות מתא הלחות, ומחזירים את הכיסויים לצלחת מרובת הקידוחים.</li>
	<li>בצע שלוש שטיפות עם PBS.</li>
	<li>הכן תמיסה של 300 ננומטר של DAPI ב-PBS (מוגן מפני אור).</li>
	<li>יש לדגור על כל מכסה עם תמיסת DAPI למשך 10 דקות.</li>
	<li>בצע שלוש שטיפות עם PBS. שמור על צלחת רב באר מוגן מפני אור.</li>
</ol>8. מונטאז'
<ol><li>הכינו שתי כוסות עם מים ופיסת נייר.</li>
	<li>יש להניח טיפה אחת (10 μL) לכל כיסוי של תמיסת פוליוויניל אלכוהול-Bis(trimethylaluminum)-1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane adduct (PVA-DABCO) על שקופית. הערה: PVA-DABCO מוכן על-ידי שילוב של 0.25 M DABCO, 10% W/V PVA, 20% גליצרול ו-50% Tris HCl (1.5 M, pH 8.8) במים טהורים במיוחד.</li>
	<li>קחו כל כיסוי בפינצטה, שטפו אותו בכל מים, ייבשו אותה בנייר והניחו אותה מעל טיפת PVA-DABCO (כשהתאים באים במגע עם התמיסה).</li>
	<li>תן לו להתייבש במשך הלילה, מוגן מפני אור.</li>
</ol>9. צפייה במיקרוסקופ קונפוקלי ולכידת תמונה
<ol><li>דמיינו את הכיסויים במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך באמצעות מטרה של סביב 63x17.</li>
	<li>צלם תמונות מייצגות של התאים המסומנים בתוויות.</li>
</ol>10. כימות נקודות LC3
<ol><li>גרור ושחרר כל קובץ תמונה המכיל את הערוצים שנלכדו, כגון ".czi", במסך ImageJ (FIJI) כדי להיפתח. לחץ על אישור בתיבת הדו-שיח וסגור את חלון המסוף .</li>
	<li>בכרטיסייה תמונה , בחרו ' צבע' &gt;'פיצול ערוצים'.</li>
	<li>סגור את התמונות המתאימות לערוצים שאינם תמונת LC3.</li>
	<li>בכרטיסיה תמונה , בחר התאם &gt; איזון צבע</li>
	<li>הזיזו את המחוון ' מרבי' שמאלה עד לרוויית התמונה כדי להציג באופן חזותי את קווי המתאר של התא.</li>
	<li>ציירו את קו המתאר של התא בעזרת הכלי בחירה חופשית .</li>
	<li>לחץ על לאפס כפתור כדי לאפס את התאמת הצבע.</li>
	<li>בכרטיסיה עריכה , בחר גזור כדי לגזור את הפריט שנבחר.</li>
	<li>סגור את התמונה מבלי לשמור אותה.</li>
	<li>בכרטיסיה עריכה , בחר הדבק.</li>
	<li>בתפריט ' נתח' , בחרו בכלי 3D Objects Counter.</li>
	<li>הגדר את הסף. בדוגמה המובאת במחקר זה, הסף נקבע על 2,000.</li>
	<li>הגדר את מסנן הגודל. במחקר זה, הוא מוגדר בין 50 ל 500.</li>
	<li>ודא שהתיבות אובייקטים וסיכום מסומנות.</li>
	<li>לחץ על אישור. מספר הנקודות יתואר כאובייקטים שזוהו בסיכום.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65005/65005fig01.jpg"> איור 1: דיאגרמה סכמטית של פרוטוקול LC3 immunofluorescence. דיאגרמה סכמטית המייצגת את הפרוטוקול הכללי שסופק עבור LC3 immunofluorescence. איור שנוצר באמצעות BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65005/65005fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<ol><li>Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+steps+in+mammalian+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146(2018).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+definitions+of+autophagy+and+related+processes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular definitions of autophagy and related processes.</a> EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).</li>
<li>Kitada, M., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+metabolic+disease+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autophagy in metabolic disease and ageing.</a> Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).</li>
<li>Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digesting+the+expanding+mechanisms+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Digesting the expanding mechanisms of autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).</li>
<li>Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">LC3 and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).</li>
<li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p%2C+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+interpret+LC3+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">How to interpret LC3 immunoblotting.</a> Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).</li>
<li>Vanasco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+VMP1-related+selective+mitophagy+in+experimental+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094(2021).</li>
<li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+in+pancreas+and+salivary+acini%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini.</a> Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).</li>
<li>Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer.</a> Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+autophagy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer.</a> Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).</li>
<li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+E2F1-EP300-VMP1+pathway+mediates+gemcitabine-induced+autophagy+in+pancreatic+cancer+cells+carrying+oncogenic+KRAS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 411(2020).</li>
<li>Pardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gemcitabine+induces+the+VMP1-mediated+autophagy+pathway+to+promote+apoptotic+death+in+human+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells.</a> Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).</li>
<li>Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+increase+amylase+mRNA+levels%2C+secretory+organelles%2C+and+secretion+in+pancreatic+acinar+AR42J+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells.</a> Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%284th+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1(2021).</li>
<li>Segeritz, C. -P., Vallier, L. Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSegeritz%2C+C-P+%22Basic+Science+Methods+for+Clinical+Researchers%22">Basic Science Methods for Clinical Researchers</a>. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , Academic Press. Cambridge, MA. 151-172 (2017).</li>
<li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy%3A+Principles+and+modern+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).</li>
<li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62%2C+prevents+pancreatic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li>
<li>Ropolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreatitis-induced+vacuole+membrane+protein+1+triggers+autophagy+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).</li>
<li>Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+early+autophagy+events%3A+Omegasomes+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50484(2013).</li>
<li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+an+autophagosome+marker%2C+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy%3A+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li>
<li>Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+of+autophagy+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection of autophagy in mammalian cells.</a> Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).</li>
<li>Yoshii, S. R., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+measuring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monitoring and measuring autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865(2017).</li>
<li>Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erlotinib+promotes+ligand-induced+EGFR+degradation+in+3D+but+not+2D+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers. 13 (18), 4504(2021).</li>
<li>Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+is+downregulated+by+microenvironmental+changes+in+pancreatic+cancer+and+induces+EMT%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT.</a> Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).</li>
<li>Kim, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+and+plasticity+of+cancer+cell+migration+in+a+pancreatic+tumor+three-dimensional+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model.</a> Cancers. 12 (5), 1305(2020).</li>
<li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+EpCAM+over-expression+is+associated+with+favorable+clinical+outcomes+in+pancreatic+cancer+patients+with+Hepatitis+B+virus+negative+infection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).</li>
<li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

השיטה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת להמחיש את התפלגות LC3 האנדוגנית בתא ולכמת את הרמות האוטופגיות בתנאים שונים. שיטה דומה נוספת המשמשת לניתוח התפלגות LC3 ולקביעת הפעלת אוטופגיה כוללת טרנספקציה LC3 עם תווית פלואורסצנטית (כגון RFP-LC3)19. RFP-LC3 transfection יש את היתרונות של לא צריך קיבוע (המאפשר ליישם שיטה זו הדמיה תאים חיים20), להיות זול יותר, ולא תלוי תגובת נוגדנים LC3. מצד שני, immunofluorescence של LC3 יש את היתרון של מתן תמונה של LC3 אנדוגני, ובכך למנוע בעיות אפשריות הק...

מקרואוטופגיה (המכונה בדרך כלל אוטופגיה) הוא תהליך קטבולי מיוחד המפרק באופן סלקטיבי רכיבים ציטופלזמיים, כולל חלבונים ואברונים פגומים 1,2. אוטופגיה מאפשרת לתאים להגיב פיזיולוגית לגירויי לחץ, ובכך לשמור על הומאוסטזיס תאי3. במהלך אוטופגיה נוצרת שלפוחית קרום כפולה: האוטופגוזום. האוטופגוזום מכיל את מולקולות המטען ומניע אותן לליזוזום לפירוק 1,4.
אוטופגוזומים מעוטרים על ידי שרשרת אור החלבון האוטופגית המשויכת למיקרוטובול 3 (LC3)5. כאשר אוטופגיה אינה מושרית, LC3 מפוזר בציטופלסמה ובגרעין בקונפורמציה LC3-I. מצד שני, כאשר אוטופגיה מושרית, LC3 מצומד עם phosphatidylethanolamine בקרום של מבנים אוטופגיים6. קונפורמציה LC3 חדשה זו ידועה בשם LC3-II1. שינוי הקונפורמציה LC3 גורם לשינויים בלוקליזציה התאית שלו ובנדידת האלקטרופורזה של ג'ל דודציל נתרן סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE), אשר ניתן לזהות באמצעות טכניקות כגון אימונופלואורסנציה וכתם מערבי 5,7. בדרך זו, צימוד LC3 הוא אירוע מפתח בתהליך האוטופגי שניתן להשתמש בו כדי למדוד פעילות אוטופגית.
תא acinar הלבלב הוא תא ממוין מאוד, אשר, בתנאים בריאים, יש שיעור נמוך של אוטופגיה. עם זאת, בתנאים פיזיולוגיים שונים או תחת גירוי תרופתי, הם יכולים להפעיל אוטופגיה. לכן, קביעת רמות אוטופגיות בקו תאים זה שימושית לחקר ההשפעות הישירות או העקיפות האפשריות של סוכנים פרמקולוגיים או ביולוגיים שונים על אוטופגיה 8,9.
אדנוקרצינומה של הלבלב היא אחד מסוגי הסרטן הקטלניים ביותר, בהתחשב באבחנה המאוחרת שלה ובעמידות הגבוהה שלהלכימותרפיה 10. לתאי סרטן הלבלב יש פעילות אוטופגיה גבוהה עקב הגברת השעתוק וההפעלה שלאחר התרגום של חלבונים הקשורים לאוטופגיה11. תאי סרטן הלבלב עשויים להתאים את רמות האוטופגיה שלהם בתגובה לתנאים שליליים כמו היפוקסיה, מחסור בחומרים מזינים או נזק הנגרם על ידי כימותרפיה11. לפיכך, ניתוח רמות האוטופגיה בתאי סרטן הלבלב יכול לעזור להבין כיצד הם מסתגלים לסביבות משתנות ולהעריך את היעילות של טיפולים המווסתים אוטופגיה.
מחקר זה מראה שיטה לביצוע LC3 immunofluorescence בשני מודלים שונים של תאי הלבלב. המודל הראשון, תאי PANC-1, שימש כמודל לאדנוקרצינומה של צינור הלבלב. תאים אלה טופלו בגמציטאבין, חומר כימותרפי שהוכח בעבר כגורם לאוטופגיה, במיוחד בתאי סרטן הלבלב הנושאים את הגן האונקוגני Kirsten rat sarcoma virus (KRAS)12,13. המודל השני, תאי AR42J, שימש כמודל פיזיולוגי יותר של תאי לבלב אקסוקריניים. תאים אלה התמינו עם dexamethasone כדי להיות דומים יותר לתאי לבלב acinar14. בתאים אלה, אוטופגיה הושרה פרמקולוגית באמצעות שימוש ב- PP242, שהוא מעכב mTORרב עוצמה 15. במחקר זה אנו מדגימים את תחולת הפרוטוקול המתואר בשני מודלים שונים של הלבלב ואת יכולתו להבחין בין מצבים של אוטופגיה נמוכה וגבוהה.

<table><tbody><tr><td>10x מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS)</td> <td>קורנינג</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>12 מ"מ כיסויים עגולים</td><td>HDA</td><td>CBR_OBJ_6467</td><td></td></tr><tr><td>24 צלחת תרבית תאים באר</td><td>Sorfa</td><td>220300</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>Biopack</td><td>2207.10.00</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 חמור נגד ארנב IgG (H+L)</td> <td>Invitrogen</td><td>R37119</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEN</td><td>Sartorius</td><td>01-052-1A</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>NATOCOR&nbsp;</td><td>Lintc-634</td><td></td></tr><tr><td>Gemcitabina</td><td>Eli Lilly</td><td>VL7502</td><td></td></tr><tr><td>LC3B (D11) XP Rabbit</td><td>mAb Cell Signaling Technology</td><td>3868S</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>אנדרה</td><td>6197</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M" (סרט איטום מעבדה)</td><td>Bemis/Curwood</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת עט-סטרפטוקוקוס</td><td>Sartorius</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>PP242</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-301606</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין EDTA</td><td>Gibco</td><td>11570626</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת רמות אוטופגיה בשני מודלים שונים של תאי לבלב באמצעות lc3 immunofluorescence

Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

אוטופגיה היא תהליך קטבולי מיוחד המפרק באופן סלקטיבי רכיבים ציטופלזמיים, כולל חלבונים ואברונים פגומים. אוטופגיה מאפשרת לתאים להגיב פיזיולוגית לגירויי לחץ, ובכך לשמור על הומאוסטזיס תאי. תאים סרטניים עשויים לווסת את רמות האוטופגיה שלהם כדי להסתגל לתנאים שליליים כגון היפוקסיה, מחסור בחומרים מזינים או נזק שנגרם על ידי כימותרפיה. אדנוקרצינומה של הלבלב היא אחד מסוגי הסרטן הקטלניים ביותר. לתאי סרטן הלבלב יש פעילות אוטופגיה גבוהה עקב הגברת השעתוק וההפעלה שלאחר התרגום של חלבוני אוטופגיה.
כאן, קו התאים PANC-1 שימש כמודל של תאי סרטן אנושיים בלבלב, וקו תאי הלבלב AR42J שימש כמודל פיזיולוגי של תאי יונקים ממוינים מאוד. מחקר זה השתמש באימונופלואורסנציה של שרשרת אור של חלבון הקשור למיקרוטובול 3 (LC3) כאינדיקטור למצב הפעלת אוטופגיה. LC3 הוא חלבון אוטופגיה אשר, בתנאי בסיס, מראה דפוס מפוזר של התפלגות בציטופלסמה (המכונה LC3-I במצב זה). השראת אוטופגיה מעוררת את הצמידות של LC3 לפוספטידיל-אתנולמין על פני השטח של אוטופגוזומים שזה עתה נוצרו ליצירת LC3-II, חלבון הקשור לקרום המסייע בהיווצרות ובהרחבה של אוטופגוזומים. כדי לכמת את מספר המבנים האוטופגיים המסומנים, נעשה שימוש בתוכנת הקוד הפתוח FIJI בעזרת הכלי "3D Objects Counter".
מדידת הרמות האוטופגיות הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתאים סרטניים מאפשרת לנו לחקור את אפנון האוטופגיה בתנאים מגוונים כגון היפוקסיה, טיפול כימותרפי או הפלת חלבונים מסוימים.

פרוטוקול זה מבצע immunofluorescence של LC3 בשורות תאי הלבלב כדי לקבוע את רמות autophagy בתנאים שונים. התוצאה של ניסוי זה הייתה קבלת תמונות סלולריות מהערוצים האדומים והכחולים, המתאימים ל-LC3 ול-DAPI. תמונות LC3 מציינות את ההתפלגות התאית של חלבון זה, בעוד DAPI מראה את הלוקליזציה הגרעינית. איור 2A מראה תמונה מייצגת של האימונופלואורסנציה של LC3 והתמזגותה עם צביעת DAPI בתאי PANC-1 בתנאי טיפול בסיסיים או בגמציטאבין. קבוצה של תמונות של צביעת LC3 נותחה באמצעות הכלי 3D Objects Counter</strong...

מטרת פרוטוקול זה היא לקבוע רמות אוטופגיות בסרטן הלבלב ובתאי אסינר בלבלב באמצעות אימונופלואורסנציה LC3 וכימות נקודות LC3.

הערכת רמות אוטופגיה בשני מודלים שונים של תאי לבלב באמצעות LC3 immunofluorescence

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

האימונופלואורסנציה LC3 מאפשרת קביעת רמות אוטופגיה בתאי הלבלב. זה מאפשר ללמוד את ההשפעות האפשריות של סוכנים שונים על אוטופגיה של תאי הלבלב. אימונופלואורסנציה היא טכניקה המשמשת לזיהוי חלבון LC3 אנדוגני, אשר מונע בעיות הנגרמות על ידי ביטוי יתר של LC3, כגון יצירת אגרגטים חלבוניים שאינם קשורים לאוטופגיה.מי שידגימו את ההליך יהיו פליפה רנה, בוגר דוקטורט, ומלנה הררה לופז, דוקטורנטית מהמעבדה של מריה אינס ואקארו. כדי להתחיל בהכנת התא, יש להשרות את החלקות הכיסוי העגולות בקוטר 12 מ"מ באתנול מוחלט. לאחר הסרת הכיסוי, מניחים את הכיסוי הספוג בצורה אנכית בצלחת בעלת 24 הבארות.חשוף את צלחת רב באר לקרינה אולטרה סגולה במשך 15 דקות. לאחר מכן מקם את הכיסוי להחליק אופקית ולשטוף אותו עם DMEM. כעת ראו את מספר המעבר הנמוך של תאי הלבלב, התלויים מחדש ב-DMEM, המכילים 10% FBS, פניצילין וסטרפטומיצין, ודגרו על התאים במשך יומיים.יומיים לאחר זריעת תאים, הכינו תמיסת גמציטאבין ב-DMEM בריכוז של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר. לאחר מכן שואפים מחצית הנפח מכל באר בצינור נפרד, ומוסיפים כמות מתאימה של תמיסת גמציטאבין. מחזירים את חצי הנפח המתאים לכל באר בחזרה לבארות המטופלות, ודגרים על התאים למשך 24 שעות.לקיבוע וחדירה של התאים, מוסיפים מתנול קר לצלחת בת 24 בארות המכילה תאים. הכינו גם צלחת שש בארות עם PBS קר. בעזרת מחט מזרק ופינצטה, קחו כל מכסה ושטפו אותו פעמיים ב-PBS.ואז לדגור מתנול במשך שש דקות. לאחר שטיפה פעמיים עם PBS, יש לדגור על החלקות הכיסוי בתמיסת חסימה למשך שעה. הוסף אנטי LC3 בתמיסת החסימה ביחס של אחד עד 1000, ושמור על קרח.הניחו פיסת סרט איטום מעבדה מעל המכסה הרב-באר, והוסיפו 25 מיקרוליטר של תמיסת אנטי-LC3 לכל כיסוי מעל סרט האיטום. בעזרת מחט מזרק ופינצטה, הניחו כל כיסוי על טיפת הנוגדנים הראשונית, וודאו שצד התא נמצא במגע עם התמיסה. הכניסו את הצלחת מרובת הבארות לתא הלחות.מכסים אותו בנייר כסף ודוגרים לילה במקרר. למחרת, הסר את הצלחת מרובת הבארות מתא הלחות. הניחו את החלקות הכיסוי בחזרה על הצלחת מרובת הבארות ושטפו אותן עם PBS שלוש פעמים.לדלל נגד ארנב מסומן פלואורסצנטית בתמיסת חסימה ביחס של אחד עד 800, ולשמור על קרח בחושך. לאחר איטום המכסה הרב-באר, מוסיפים 25 מיקרוליטר של תמיסת אנטי-ארנב לכל כיסוי מחליק על סרט האיטום. ולטפל בתלוש הכיסוי עם נוגדן משני כפי שהודגם בעבר.לאחר מכן לדגור על הצלחת בתא הלחות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה עם נוגדן, לשטוף את החלקות כיסוי על צלחת רב באר עם PBS שלוש פעמים. יש לדגור על כל מכסה עם תמיסת DAPI מוכנה למשך 10 דקות.לאחר השטיפה עם PBS, לשמור על צלחת רב באר בחושך. למונטאז' סלולרי, הכינו שתי כוסות עם מים ופיסת נייר. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת PVA-DABCO לכל החלקת כיסוי על שקופית.לשטוף את הכיסוי להחליק במים, ולאחר מכן לייבש אותו על נייר. לבסוף, הניחו אותו מעל טיפת PVA-DABCO. ויבש לילה בחושך.למחרת, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, לדמיין את התאים המסומנים וללכוד את התמונות. לאחר לכידת תמונות, גרור ושחרר כל קובץ תמונה המכיל את הערוצים שצולמו במסך פיג'י. בתיבת הדו-שיח, לחץ על אישור כדי לפתוח את התמונה.לאחר מכן סגור את חלון הקונסולה שנפתח. בכרטיסיה תמונה, בחר צבע ולאחר מכן פצל ערוצים. סגור את התמונה המתאימה לערוצים שאינם תמונת LC3.לאחר מכן, בכרטיסיה תמונה, בחר התאמה, ולאחר מכן איזון צבע. הזיזו את המחוון המרבי שמאלה עד לרוויית התמונה כדי להציג באופן חזותי את קווי המתאר של התא. השתמש בכלי הבחירה החופשית כדי לצייר את קו המתאר של התא, ולחץ על איפוס כדי להתאים את הצבעים.כדי לגזור את הפריט שנבחר מהכרטיסיה עריכה, בחר גזור וסגור את התמונה מבלי לשמור אותה. ומהכרטיסייה עריכה, בחר הדבק. בתפריט 'נתח', בחרו בכלי 3D Objects Counter.הגדר את הסף ל- 2000 ואת מסנן הגודל ל- 50 עד 500. ודא שהאובייקטים ותיבות הסיכום מסומנים, ולחץ על OK.In חלון היומן, מספר הנקודות יתואר כאובייקטים שזוהו. האימונופלואורסנציה הצביעה על התפלגות התא של חלבון LC3, בעוד שה- DAPI הראה לוקליזציה גרעינית בתאי הלבלב.נקודות LC3 גדלו באופן משמעותי תחת טיפול בגמציטאבין, מה שמצביע על פעילות אוטופגית. תחת מפגש מוגזם, תאי הלבלב האקסוקריניים נוטים להיערם ולגדול זה על גבי זה. שיטת קיבוע תאי הפרפורמלדהיד לא הייתה יעילה לשימור חלבוני LC3, מכיוון שלא שיקפה פיזור מדויק.כאשר הקיבוע או הטיפול בוצעו ללא המתנה יומיים לאחר הזריעה, תאי PANC1 היו בעלי צורה עגולה. מורפולוגיה זו הפחיתה את הקשר בין הציטופלסמה לגרעין, והקשתה על הבנת ההתפלגות התוך-תאית של LC3. קיבוע מתנול לא שלם עלול להפריע לתיוג חיסוני תקין של LC3, מה שמוביל לתמונות לא ברורות ולכימות תת-אופטימלי.הדבר החשוב ביותר לזכור במהלך הליך זה הוא כי התאים חייבים להיות קבועים מתנול קר במשך שש דקות, במקום paraformaldehyde. בעקבות הליך זה, ניתן לנתח לוקליזציה בין LC3 וחלבונים אחרים, המאפשרת לימוד מסלולים מולקולריים שונים הקשורים לפונקציות LC3.

evaluating-autophagy-levels-two-different-pancreatic-cell-models

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Autophagy היא תהליך בכל מקום שמאפשר לתאים לבזות ולמחזר חלבונים ואת האברונים. אנו מיישמים מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתקדם כדי להמחיש ולכמת קטנים, אבל שינויים מהותיים, פיסיים הקשורים לאינדוקציה של autophagy, כולל הקמת וההפצה של autophagosomes וlysosomes, ומיזוגם בautolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

מיקרוסקופיה זמן לשגות של סמני autophagy כותרתו fluorescently מאפשרת ניטור של תגובת autophagy הדינמית עם רזולוציה גבוהה זמנית. שימוש autophagy ספציפית וסמני אברון בשילוב של 3 צבעים שונים, אנו יכולים לעקוב אחר תרומתו של חלבון להיווצרות autophagosome בהקשר מרחב ובזמן חזק.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

מוצגים כאן שתי שיטות מחקר של אינטראקציה עם נוגדן מבוססי חלבון: immunofluorescence ו- immunoprecipitation. טכניקות אלה מתאימים ללמוד הפיזי אינטראקציות בין חלבונים עבור גילוי הרומן מרכיבי הסלולר איתות המסלולים, הבנה חלבון דינמיקה.<br...

חקר אינטראקציות חלבון במחקר Autophagy

Autophagy פעיל קשורה התחדשות שריר פרודוקטיבי, אשר חיוני עבור תא גזע שריר (MuSC) ההפעלה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לזיהוי באתרה של LC3, סמן autophagy ב MyocS חיובי Myocs של קטעים רקמות שריר מן שליטה ועכברים שנפגעו.

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

Mitophagy, התהליך של פינוי נפגע המיטוכונדריה, הוא הכרחי עבור תחזוקה מיטוכונדריאלי הומאוסטזיס ובריאות. מאמר זה מציג חלק mitophagy האחרונה שיטות זיהוי תאים אנושיים, Caenorhabditis elegansועכברים.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיקרוסקופ אור-אלקטרונים מתאמי אופטימלי על חתך המבוסס על תיוג אנדוגני פלואורסצנטי ככלי לחקר לוקליזציה של חלבונים נדירים ביחס לאולטרה-מבנה תאי. כוחה של גישה זו מודגם על ידי לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני בתאים מורעבים ללא טיפול Bafilomycin.

לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני על ידי מיקרוסקופ אור-אלקטרונים קורלטיבי בחתך

פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לניתוח כמותי של מיטופגיה בתאי β של הלבלב: הראשונה, שילוב של צבעים ספציפיים למיטוכונדריה החדירים, ושנית, כתב מיטופגיה מקודד גנטית. שתי טכניקות אלה משלימות זו את זו וניתנות לפריסה על בסיס צרכים ספציפיים, ומאפשרות גמישות ודיוק בטיפול כמותי בבקרת איכות מיטוכונדריאלית.

גישות משלימות לחקירת שטף מיטופגיה בתאי β הלבלב

כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה להערכה תמציתית של רמות סמן אוטופגוזום LC3-II בשלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) על ידי immunoblotting. ניתוח רמות LC3-II ברכבים חשמליים, היווצרות אוטוליזוזום והיווצרות אומגה מצביע על התפקיד החדש של STX6 בשחרור רכבים חשמליים חיוביים ל-LC3-II כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת שליטה של ​​פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה עם חדירה עמוקה אופטי phototoxicity מופחת. אנו מתארים את השימוש בטכנולוגיה זו עבור תיוג תא חי עוברי דג הזברה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לזירוז, תמונה של אור תגובה מולקולות שונות.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

למדו להעריך רמות אוטופגיה בתאי לבלב באמצעות שיטת immunofluorescence של LC3. פרוטוקול זה מדגים כיצד לכמת נקודות LC3 ולחקור את השפעת גמציטאבין על פעילות האוטופגיה בתאי סרטן הלבלב.

הערכת רמות אוטופגיה בשני מודלים שונים של תאי לבלב באמצעות LC3 immunofluorescence

גלה סרטונים נוספים