Name: ניטור Stub1-Mediated Pexophagy (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: חקור את מנגנון פקסופאגיה מווסת Stub1 בתאי SHSY5Y ו-NIH 3T3 תחת מתח חמצני. שיטת הדמיה חיה זו מאפשרת מעקב אחר תהליכי פירוק פרוקסיזומים פגועים ושליטה באיכות האורגנלים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק מחקר MOST 111-2311-B-001-019-MY3 מהמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה בטייוואן.

1. הכנת תאים המבטאים diKillerRed או חלבוני תיוג עצמי (SLPs) בלומן הפרוקסיזום
<ol><li>זרעו את התאים הרצויים על צלחות תרבית תאים בעלות תחתית זכוכית. לצורך הניסוי כאן, זרעו 2 x 105 תאי SHSY5Y אנושיים ב-840 מיקרוליטר של מדיום תרבית (DMEM/F-12 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין) או 6 x 104 תאי NIH3T3 עכבריים ב-840 מיקרוליטר של מדיום תרבית (DMEM בתוספת 10% נסיוב בקר ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין) על צלחת תרבית בקוטר 35 מ"מ עם מיקרווול זכוכית בקוטר 20 מ"מ. הערה: יש להתאים את מספר התאים שנזרעו באופן יחסי בהתאם לאזור מיקרווול הזכוכית בעת שימוש בצלחות תחתית זכוכית של מפרטים אחרים.</li>
	<li>גדל את התאים תחת 5% CO2/37 ° C במשך 24 שעות.</li>
	<li>Transfecate התאים עם פלסמידים הרצויים באמצעות מגיב transfection.<ol><li>השתמש PMP34-TagBFP כדי לתייג את peroxisomes בתאים חיים. השתמש ב- diKillerRed-VKSKL או ב- SLP-VKSKL (+ ליגנדות SLP המסומנות בצבע) ליצירת ROS בלומן הפרוקסיזום (באמצעות ייצור ROS המופעל באמצעות אור). בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בחלבון התיוג העצמי HaloTag-VKSKL21. כדי לפקח על טרנסלוקציה של Stub1/Hsp70, הצטברות של חלבונים יוביקוויטינציה, והיווצרות של אוטופגוזומים על peroxisomes ללחץ ROS, transfect EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub, או EGFP-LC3B, בהתאמה. כדי לבדוק את דור ROS בלומן הפרוקסיזומלי, קו-טרנספקט diKillerRed-VKSKL עם בדיקת חמצון-חיזור פלואורסצנטית מקומית roGFP2-VKSKL22.</li>
		<li>עבור טרנספקציה של תאי SHSY5Y, לדלל פלסמידים ב- 55 μL של DMEM/F-12 ללא סרום, ולדלל 1 μL של מגיב טרנספקציה ב- 55 μL של DMEM/F12 ללא סרום. שלב את ה- DNA המדולל עם מגיב מדולל. מערבבים בעדינות ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הוסף את הקומפלקס למיקרווול בקוטר 20 מ"מ שצופה בעבר במדיום תרבית 100 מיקרוליטר עבור SHSY5Y ללא אנטיביוטיקה (DMEM/F-12 עם 10% נסיוב בקר עוברי). נערו בעדינות את המנה קדימה ואחורה.</li>
		<li>עבור טרנספקציה של תאי NIH3T3, יש להחליף את מדיום הסרום המוקטן ב-DMEM/F-12 נטול הסרום לדילול הפלסמידים ומגיב הטרנספקציה. החלף את מדיום תרבית הציפוי ב- SHSY5Y במדיום תרבית עבור תאי NIH3T3 ללא אנטיביוטיקה (DMEM עם 10% סרום בקר).</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר שעתיים של טרנספקציה, להסיר את המדיום המכיל מגיב transfection, ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום תרבית טרי. יש לדגור על תאי NIH3T3 או SHSY5Y בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 24 שעות. הערה: קווי תאים אחרים יכולים לשמש גם לחקר פקסופאגיה בתיווך Stub1 (למשל, תאי HeLa).</li>
</ol>2. צביעת פרוקסיזומים בליגנדות SLP עם תווית צבע (לייצור ROS מופעל באור)
<ol><li>24 שעות לאחר הטרנספקציה, הסר את מדיום התרבית, והוסף 100 μL של 200 ננומטר HaloTag TMR ligand או 200 nM Janelia Fluor 646 HaloTag ligand על מיקרווול זכוכית 20 מ"מ. הערה: יש לדלל את ליגנדות SLP המסומנות בצבע עם מדיום התרבית המתאים לכל קו תאים. בחירה בליגנדות המסומנות על ידי Janelia Fluor 646 תשחרר את התעלות הכחולות, הירוקות והאדומות להדמיית פלואורסצנטיות במורד הזרם.</li>
	<li>מעבירים את המנה לאינקובטורCO2 בטמפרטורה של 37°C, 5%. מכתים למשך שעה. לאחר שעה יש להסיר היטב את מצע הכתמים ולהוסיף 1 מ"ל מדיום תרבית טרי.</li>
</ol>3. לחץ ROS של פרוקסיזומים במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר
<ol><li>מניחים צלחת בעלת תחתית זכוכית המכילה את התאים הרצויים על מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר המצויד באינקובטור על גבי במה.</li>
	<li>לחצו על חלון הכלי, בחרו Ocular ולחצו על כפתור DIA (איור 2A) כדי להדליק את האור המשודר. צפו בצלחת דרך עינית המיקרוסקופ, והביאו את התאים למיקוד על ידי סיבוב ידית המיקוד.</li>
	<li>בחרו LSM ולחצו על הלחצן Dye & Detector Select (איור 2B). לחצו פעמיים על הצבעים הרצויים בחלון הנפתח כדי לבחור את הגדרות הלייזר והסינון המתאימות להדמיית התאים (איור 2C). לחצו על Livex4 בחלונית Live כדי להתחיל סריקת לייזר מהירה כדי להתחיל בסינון אותות הפלואורסצנטיות של התאים (איור 2D).</li>
	<li>הזז את הבמה באמצעות בקר הג'ויסטיק, ואתר את התאים המבטאים diKillerRed-VKSKL- או SLP-VKSKL המדיום כדי להפעיל לחץ ROS (על הפרוקסיזומים). לרכוש תמונה של התא הרצוי.</li>
	<li>לחצו על Tool Window ובחרו LSM Stimulation (איור 2E). לחצו על כפתור האליפסה , ובחלון התמונה החיה, השתמשו בעכבר כדי לצייר החזר השקעה מעגלי בקוטר 15 מיקרומטר (איור 2F) המכיל את הפרוקסיזומים הרצויים שנרכשו בשלב 3.4 שעליו יופעל לחץ ROS (ראו איור 3 לדוגמה).</li>
	<li>כדי להחיל לחץ ROS, השתמש ב- 561 ננומטר עבור תאים עם ליגנד SLP שכותרתו diKillerRed-PTS1 או TMR, והשתמש ב- 640 ננומטר עבור תאים המוכתמים בליגנד SLP עם תווית Janelia Fluor 646.</li>
	<li>בחר את אורך גל הלייזר להחלת מתח ROS. הזן את אחוז הלייזר הרצוי ואת משך הזמן (איור 2G).</li>
	<li>לחצו על Acquire, ולחצו על כפתור הגירוי (איור 2H) כדי להתחיל את הסריקה עם אור של 561/640 ננומטר דרך החזר ההשקעה במשך 30 שניות כל אחת. זה מתאים להגדרת עוצמת לייזר ~ 5% הן עבור 561 ננומטר והן עבור 640 ננומטר במיקרוסקופ הקונפוקלי המשמש כאן. פעולה זו תוביל לייצור ROS בפרוקסיזומים. הערה: ניתן לבחור ROI בגדלים שונים. יש להתאים באופן פרופורציונלי את זמן ההארה לכל החזר השקעה בהתאם לשטחו.</li>
	<li>לאחר 30 שניות של תאורת לייזר, פרוקסיזומים בתוך החזר ההשקעה יאבדו את אותות diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646 שלהם. אובדן אות זה מאפשר להבחין בין הפרוקסיזומים המוארים לבין הפרוקסיזומים הלא מוארים (פגומים לעומת בריאים) בתוך התא.</li>
</ol>4. ניטור פקסופאגיה בתאים חיים על ידי הדמיה בהילוך מהיר
<ol><li>עקבו אחר הטרנסלוקציה של Stub1, Hsp70, Ub, p62 או LC3B המתויגים ב-EGFP על הפרוקסיזומים המוארים/בעלי הלחץ של ROS באמצעות הדמיה בהילוך מהיר במרווחים של 10 דקות בין מסגרות (לדוגמה, ראו איורים 3-7). הערה: אותות EGFP-Stub1 או EGFP-Hsp70 מתחילים להופיע 10-20 דקות לאחר ההארה ונשארים על כל הפרוקסיזומים הפגומים עד ~ 40 דקות לאחר ההארה. אותות EGFP-Ub מופיעים 30 דקות לאחר ההארה ונמשכים 2-3 שעות. טרנסלוקציה של EGFP-p62 מופיעה 60 דקות לאחר ההארה, ואותות EGFP-LC3B נראים ~ 3 שעות לאחר התאורה.</li>
	<li>כמת את אותות ה-EGFP על הפרוקסיזומים הפגומים (מ-Stub1, Ub, p62 או LC3B) באמצעות ImageJ. בצע את השלבים הבאים לשימוש ב- ImageJ לכימות תמונה תלת-ערוצית (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).<ol><li>פתחו את התמונה והחילו בחירות אליפטיות או בחירות חופשיות כדי להקיף את האזור הכולל את כל הפרוקסיזומים המוארים (אות PMP34-TagBFP חיובי ואות ליגנד HaloTag מולבן; איור 8A).</li>
		<li>לחץ על שכפל כדי לבחור את ערוץ PMP34-TagBFP (איור 8A). הגדר סף באמצעות התפריט הנפתח תמונה > התאם סף > כדי לסמן את הפרוקסיזומים (איור 8B).</li>
		<li>בחר נתח > נתח חלקיקים כדי לקבוע את האזורים המדויקים של הפרוקסיזומים המוארים. ImageJ מתעדת את אזורי העניין האלה (ROIs) במנהל החזר ההשקעה (איור 8C).</li>
		<li>לחצו על ' שכפל ' כדי לבחור את ערוץ ה-EGFP לניתוח האות הפלואורסצנטי מ-Ub מצומד ל-EGFP, עמ' 62 או LC3B (איור 8D). בחר את כל החזר ההשקעה במנהל החזר ההשקעה (איור 8E).</li>
		<li>החל מדידה במנהל החזר ההשקעה כדי למדוד את אותות ה-EGFP על הפרוקסיזומים (איור 8E). מצא את הערך של השטח והצפיפות המשולבת (סכום כל עוצמות הפיקסלים) עבור כל החזר השקעה בטבלת התוצאות (איור 8E).</li>
		<li>כדי לקבל את העוצמות הפלואורסצנטיות הממוצעות של EGFP בנקודות זמן שונות לאחר התאורה, חלק את עוצמת ה-EGFP המשולבת בשטח הכולל של פרוקסיזומים מוארים (PMP34-TagBFP אות חיובי ואזורי ליגנד שליליים של אות HaloTag). כדי לקבל את האות המצטבר על הפרוקסיזומים, הפחיתו את העוצמה הממוצעת בנקודת זמן בעוצמה הממוצעת בזמן = 0, ולאחר מכן נרמלו בעוצמה הממוצעת בזמן = 0.</li>
	</ol></li>
</ol>5. פגיעה גלובלית בכל הפרוקסיזומים (בכל תא) על צלחת תרבית
<ol><li>בצע את שלב 1 (הכנת תאים המבטאים diKillerRed ממוקד פרוקסיזום [diKillerRed-VKSKL] או SLP [SLP-VKSKL]) ושלב 2 (צביעת פרוקסיזומים עם ליגנד SLP [לייצור ROS מופעל אור]).</li>
	<li>לאחר שעה אחת של צביעת ליגנד המסומן בתווית TMR, הסר את מדיום הצביעה והוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית המכיל 30 mM 3-AT (3-amino-1,2,4-triazole; מעכב קטלאז). הערה: קטלאז הוא מסלק ROS המתבטא בלומן פרוקסיזום, כך שטיפול 3-AT עוזר להגדיל את נזקי החמצון הנובעים מאור על הפרוקסיזומים.</li>
	<li>מניחים את צלחת התרבית מעל LED (555-570 ננומטר). להאיר את כל התאים בצפיפות הספק של 1.8 W/cm2 למשך 9 שעות באינקובטור. הערה: כדי לבצע שלב זה מחוץ לאינקובטור, הניחו את צלחת התרבית על פלטת חימום בטמפרטורה של 37°C. הוסיפו HEPES של 20 מ"מ למדיום המכיל 3 AT, וכסו את צלחת התרבית בסרט שקוף כדי למזער את חילוף הגזים. HEPES הוא חומר חציצה השומר על pH פיזיולוגי בתרבית תאים מחוץ לאינקובטור CO2 במהלך תאורת LED.</li>
	<li>אמת את ההצלחה של נזק הנגרם על-ידי LED על-ידי הדמיה של אותות EGFP-Ub, EGFP-p62 או EGFP-LC3B על הפרוקסיזומים. באמצעות תנאי ההארה המתוארים לעיל, 82% מתאי SHSY5Y המבטאים ביציבות את HaloTag-VKSKL הציגו פקסופאגיה בתיווך Stub1.</li>
	<li>קצור את התאים לניתוח ביוכימי במורד הזרם.</li>
</ol>

<ol><li>Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+interplay+between+peroxisomes+and+other+subcellular+organelles+including+mitochondria+and+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83(2016).</li>
<li>He, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-CoA+derived+from+hepatic+peroxisomal+%CE%B2-oxidation+inhibits+autophagy+and+promotes+steatosis+via+mTORC1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation.</a> Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).</li>
<li>Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+dysfunction+in+age-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal dysfunction in age-related diseases.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).</li>
<li>Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFransen%2C+M+%22Peroxisomes+and+their+Key+Role+in+Cellular+Signaling+and+Metabolism%22">Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism</a>. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).</li>
<li>Puri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasma+lipidomic+signature+of+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).</li>
<li>Law, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peroxisomal+AAA+ATPase+complex+prevents+pexophagy+and+development+of+peroxisome+biogenesis+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).</li>
<li>Nazarko, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy+is+responsible+for+65%25+of+cases+of+peroxisome+biogenesis+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders.</a> Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).</li>
<li>Eberhart, T., Kovacs, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy+in+yeast+and+mammals%3A+An+update+on+mysteries%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).</li>
<li>Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+role+of+pexophagy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological role of pexophagy.</a> FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).</li>
<li>Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy%3A+The+selective+degradation+of+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 512721(2012).</li>
<li>Germain, K., Kim, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pexophagy%3A+A+model+for+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pexophagy: A model for selective autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578(2020).</li>
<li>Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+signals+autophagic+degradation+of+cytosolic+proteins+and+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).</li>
<li>Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+peroxin+PEX3+induces+peroxisome-ubiquitination-linked+pexophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy.</a> Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).</li>
<li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export-deficient+monoubiquitinated+PEX5+triggers+peroxisome+removal+in+SV40+large+T+antigen-transformed+mouse+embryonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts.</a> Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+functions+at+the+peroxisome+to+induce+pexophagy+in+response+to+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS.</a> Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).</li>
<li>Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsc70%2FStub1+promotes+the+removal+of+individual+oxidatively+stressed+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 5267(2020).</li>
<li>Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+induction+of+autophagy-mediated+lysosome+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover.</a> Nature Communications. 4, 2111(2013).</li>
<li>Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryo-electron+tomography+workflow+reveals+protrusion-mediated+shedding+on+injured+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane.</a> Science Advances. 7 (13), eabc6345(2021).</li>
<li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+initiation+of+parkin-mediated+mitophagy+within+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells.</a> Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).</li>
<li>Yang, J. Y., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bit-by-bit+autophagic+removal+of+parkin-labelled+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria.</a> Nature Communications. 4, 2428(2013).</li>
<li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+novel+protein+labeling+technology+for+cell+imaging+and+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis.</a> ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
<li>Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+subcellular+redox+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+RoGFP2-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).</li>
<li>Nordgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+limitations+in+the+use+of+KillerRed+for+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

פרוטוקול זה מפרט כיצד להפעיל פקסופאגיה בתיווך Stub1 בתוך תרביות תאים על ידי העלאת רמות ROS פרוקסיזומליות עם אור. מכיוון שהפרוטוקול מסתמך על ייצור ROS בעזרת צבע, יש להבטיח ביטוי מספיק של diKillerRed-VKSKL או צביעת ליגנד SLP מסומן בצבע בתוך התאים המעניינים. בהתחשב בכך שסוגי תאים שונים או תאים בעלי רקע גנטי שונה יכולים להכיל פרוקסיזומים בעלי תכונות מעט שונות, ייתכן שיהיה צורך לכוונן את תנאי ההארה המדויקים כדי להבטיח את השראת הפקסופגיה. אמצעי חזק לסינון ההפעלה של פקסופאגיה בתיווך Stub1 הוא לפקח אם EGFP-Ub עובר טרנסלוקציה לפר...

פרוקסיזומים הם אברונים הקשורים לקרום יחיד הנמצאים ברוב התאים האיקריוטים. פרוקסיזומים הם תא מטבולי חיוני לביצוע חמצון בטא של חומצות שומן ארוכות שרשרת מאוד, קטבוליזם פורין, וסינתזה של פוספוליפידים וחומצות מרה באתר1. אצטיל-CoA המופק מפרוקסיזום שולט בהומאוסטזיס שומנים על ידי ויסות האיתות המרכזי בחילוף החומרים2. לכן, אין זה מפתיע כי תפקודים peroxisomal נפגע משתמע במחלות שונות, כולל הפרעות נוירודגנרטיביות, הזדקנות, סרטן, השמנת יתר, סוכרת 3,4,5. תהליך חיוני בשמירה על פעולה peroxisomal הוא pexophagy. פקסופאגיה היא תהליך קטבולי לתחלופה סלקטיבית של פרוקסיזומים על ידי אוטופגיה. תאים משתמשים בפקסופאגיה כדי לסייע בשליטה על כמות ואיכות הפרוקסיזומים, ובכך להבטיח תפקוד פרוקסיזומלי תקין. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי אובדן פרוקסיזום שנגרם על ידי מוטציות בגורמים הביולוגיים PEX1 peroxisomal 1 ו -6 נובע מפקסופאגיה בלתי מבוקרת6. יש לציין כי 65% מכלל החולים בהפרעת ביוגנזה פרוקסיזומית (PBD) סובלים מליקויים בקומפלקס פרוקסיזומלי AAA ATPase, המורכב מ-PEX1, PEX6 ו-PEX26 בתאי יונקים7.
ניתן להשתמש במספר שיטות כדי ליזום וללמוד פקסופגיה. בשמרים, פקסופאגיה מופעלת כאשר חומרי המזון המסופקים עוברים ממקורות פחמן תלויי פרוקסיזום למקורות פחמן שאינם תלויים בפרוקסיזום (כדי להוריד את מספר הפרוקסיזום בתאים)8. לדוגמה, העברת תאי Pichia pastoris הגדלים מתנול ממדיום מתנול למדיום גלוקוז ומדיום אתנול משרה micropexophagy ו macropexophagy, בהתאמה 8,9,10. ממברנות מיקרופקסופאגיה קיבצו פרוקסיזומים לפירוק על ידי עיצוב מחדש של הוואקול ליצירת קרומי קיבוע ואקולריים דמויי גביע ומבנה דמוי מכסה המכונה מנגנון הממברנה הספציפי למיקרופקסופאגיה (MIPA). ב macropexophagy, peroxisomes בודדים נבלעים על ידי מבנים קרום כפול המכונה pexophagosomes, ואחריו איחוי עם vacuole עבור השפלה 8,9,10. הזרחן של קולטני פקסופגיה, כגון Atg36p ב- Saccharomyces cerevisiae ו- Atg30p ב- Pichia pastoris, הוא קריטי עבור הקולטנים לגייס מכונות אוטופגיה ליבה ולהקל על מיקוד פרוקסיזומלי לאוטופגוזומים 8,11.
בתאי יונקים, פקסופאגיה יכולה להיגרם על ידי יוביקוויטינציה. תיוג חלבוני הממברנה הפרוקסיזומלית PMP34 או PEX3 עם יוביקוויטין בצד הציטוסולי גורם לפקסופאגיה12. ביטוי היתר של PEX3 גורם לאוביקוויטינציה של פרוקסיזום וסילוק פרוקסיזום על ידי ליזוזומים13. בנוסף, המיזוג של PEX5 עם EGFP מסוף C פוגע בייצוא של PEX5 מונוביקוויטינציה וגורם לפקסופאגיה14. מצד שני, pexophagy יכול גם להיות מופעלות על ידי טיפול H 2 O2. פרוקסיזומים מייצרים מיני חמצן תגובתי (ROS); באופן ספציפי, האנזים הפרוקסיזומלי Acox1, אשר מזרז את השלב הראשוני של חמצון בטא של חומצות שומן ארוכות שרשרת מאוד (> 22 פחמן), מייצר לא רק אצטיל-CoA אלא גם ROS פרוקסיזומלי. בתגובה לרמות ROS מוגברות תחת טיפול H 2 O2, תאי יונקים מפעילים פקסופאגיה כדי להפחית את ייצור ה- ROS ולהקל על הלחץ. דווח כי טיפול H 2 O2מניע את הגיוס של אטקסיה-telangiectasia מוטציה (ATM) peroxisomes. כספומט לאחר מכן phosphorylates PEX5 כדי לקדם מחזור peroxisomal על ידי pexophagy15.
מאחר שפרוקסיזומים הם מרכזים המייצרים ROS, הם גם מועדים לנזק ל-ROS. פציעות פרוקסיזומליות המעוררות ROS מאלצות תאים להפעיל פקסופאגיה כדי ליזום מסלולי בקרת איכות פרוקסיזום (הסרת הפרוקסיזום הפגום על ידי אוטופגיה). כאן, אנו מתארים גישה להפעלה לפי דרישה של פגיעה פרוקסיזומלית הנגרמת על ידי ROS. הפרוטוקול מנצל את ייצור ה-ROS המופעל באמצעות אור בתוך אברונים 16,17,18,19,20 (איור 1). פרוקסיזומים המסומנים בצבע מוארים ומובילים לייצור ROS בלומן הפרוקסיזומלי, מה שגורם באופן ספציפי לפגיעה פרוקסיזומלית. באמצעות פרוטוקול זה, נראה כי פרוקסיזומים בסטרס של ROS מוסרים דרך מסלול פירוק תלוי יוביקוויטין. פרוקסיזומים בלחץ ROS מגייסים את היוביקוויטין E3 ליגאז Stub1 כדי לאפשר את בליעתם לתוך אוטופגוזומים להסרה פרטנית על ידי פקסופאגיה16. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות את גורלם של פרוקסיזומים פצועים ובריאים באותו תא באמצעות מיקרוסקופ בהילוך מהיר. השיטה יכולה לשמש גם לפגיעה גלובלית בכל הפרוקסיזומים (בכל התאים) על צלחת תרבית, מה שמאפשר ניתוח ביוכימי של מסלול הפקסופגיה.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבית 35 מ"מ עם מיקרווול זכוכית בקוטר 20 מ"מ&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>20 מ"מ זכוכית עם תחתית</td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16170060</td><td></td></tr><tr><td>חממת תרביות תאים</td><td>Nuaire</td><td>NU-4750</td><td></td></tr><tr><td>diKillerRed-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>תוצרת על ידי הוספת דימר טנדם KillerRed עם PTS1 (VKSKL)</td></tr><tr><td>מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>תערובת הנשר/חומרים מזינים F-12 (DMEM/F-12) של Dulbecco</td> <td>Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>pEGFP-C1</td><td>עמוד השדרה של EGFP-C1 שימש לשיבוט EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td></tr><tr><td>EGFP-Hsp70</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>גן Hsp70 (HSPA1A) PCR מוגבר מ-HeLa cDNA ושובט ל-EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-LC3B</td><td>Addgene</td><td>11546</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-p62</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>שנוצר על ידי החדרת הגן SQSTM1 האנושי (באמצעות הגברת PCR של ה-cDNA של תא HeLa) לתוך EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-Stub1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>שנוצר על ידי החדרת הגן Stub1 של העכבר (באמצעות הגברת PCR של סך ה-cDNA של כליות העכבר) לתוך EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-Ub</td><td>Addgene</td><td>11928</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag TMR ligand&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8252</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PTS1 מצורף ומשובט לתוך עמוד השדרה EGFP-C1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך&nbsp;</td><td>אולימפוס</td><td>FV3000RS</td><td>405 ננומטר Ex, 488 ננומטר Ex, 561 ננומטר Ex, &nbsp; מיקרוסקופ עם חממת תא TOKAI HIT וחיבור הכלים UNIV2-D35</td></tr><tr><td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td><td>Promega</td><td>GA1120</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>VitaStar</td><td>PAR64</td><td>80 W, 555-570 ננומטר</td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>NIH3T3 תא</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td>דבק</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>319850</td><td>מדיה מופחתת בסרום</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PMP34-TagBFP</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PMP34 PCR מוגבר מ-HeLa cDNA ומשובט intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td></tr><tr><td>roGFP2-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>נוצר על ידי הוספת eroGFP (נלקח מ-Addgene plasmid 20131) עם רצף חומצות האמינו VKSKL, ושובט לתוך תא EGFP-C1</td></tr><tr><td>SHSY5Y</td><td>דבק</td> <td>ATCC</td><td>CRL-2266</td></tr></tbody></table>

ניטור stub1-mediated pexophagy

Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

תאי יונקים יכולים להפוך פרוקסיזומים באמצעות פקסופאגיה בתיווך Stub1. המסלול מאפשר בקרה תאית על כמות ואיכות הפרוקסיזומים. במהלך תהליך זה, חלבון הלם חום 70 ויוביקוויטין E3 ליגאז, Stub1, עוברים לפרוקסיזומים כדי להפוך אותם כדי להתחיל פקסופגיה. פעילות ליגאז Stub1 מאפשרת הצטברות של יוביקוויטין ומודולים אחרים הקשורים לאוטופגיה על פרוקסיזומים ממוקדים. העלאת רמות החמצן הריאקטיבי (ROS) בלומן הפרוקסיזומלי יכולה להפעיל פקסופאגיה בתיווך Stub1. ניתן, אם כן, להשתמש ביצירת ROS בסיוע צבע כדי להפעיל ולנטר מסלול זה. מאמר זה מתאר את ההליכים לשימוש בשני סוגים של צבעים, חלבונים פלואורסצנטיים ופלואורופורים סינתטיים, כדי ליזום פקסופאגיה בתוך תרביות תאים של יונקים. פרוטוקולים מבוססי יצירת ROS בסיוע צבע אלה יכולים לשמש לא רק כדי להתמקד בכל הפרוקסיזומים באוכלוסיית תאים ברחבי העולם, אלא גם יכולים לאפשר מניפולציה של פרוקסיזומים בודדים בתוך תאים בודדים. אנו גם מתארים כיצד ניתן לעקוב אחר פקסופאגיה בתיווך Stub1 באמצעות מיקרוסקופ תאים חיים.

סכמת השראת הפקסופגיה בתיווך Stub1 המוצגת כאן מנצלת את היתרון של יצירת ROS בסיוע צבע בתוך לומן פרוקסיזום. פעולה זו דורשת עוצמות אור מינימליות. לכן, ניתן להאיר פרוקסיזומים המכילים חלבונים או צבעים פלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופים קונפוקליים סטנדרטיים לסריקת לייזר. הארה מוקדית מובילה לייצור ROS מיידי ומקומי בתוך פרוקסיזומים בודדים, כפי שמצוין על-ידי הכתב הפלואורסצנטי roGFP2-VKSKL (איור 9). לא צילמנו את diKillerRed-VKSKL במדידות roGFP2-VKSKL כדי למנוע יצירת ROS נוספת במהלך ההדמיה. התמונה הימנית...

פרוטוקול זה מספק הוראות להפעלה ולניטור של פקסופאגיה בתיווך Stub1 בתאים חיים.

ניטור Stub1-Mediated Pexophagy

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

פרוקסיזומים מבצעים חמצון בטא ומועדים לנזקי ROS. שיטה זו מאפשרת לחקור כיצד תאים מתמודדים עם פרוקסיזומים בסטרס ROS. פרוטוקול זה משמש לא רק כדי להתמקד באופן גלובלי בכל הפרוקסיזומים באוכלוסיית התא, אלא יכול גם לאפשר מניפולציה של הפרוקסיזומים הבודדים בתוך תאים בודדים.ייצור ROS בסיוע צבע יכול לשמש גם כדי להתמקד באברונים מחוץ לפרוקסיזומים כדי לחקור כיצד תאים מתמודדים עם פציעות אברונים. כדי להתחיל, זרעו פעמיים 10 לתאי SHSY5Y האנושיים החמישיים או שש פעמים 10 לעכבר הרביעי תאי NIH H3T3 ב 840 מיקרוליטר של מדיום תרבית על צלחות תרבית 35 מילימטר עם תחתית זכוכית מיקרווול בקוטר 20 מילימטר. לגדל את התאים תחת 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.לאחר מכן, transfect את התאים עם פלסמידים הרצויים באמצעות מגיב transfection או SHSY5Y transfection התא. לדלל פלסמידים ב-55 מיקרוליטר של DMEM/F-12 ללא סרום ולדלל מיקרוליטר אחד של מגיב טרנספקציה ב-55 מיקרוליטר של DMEM/F-12 ללא סרום. שלב את ה- DNA המדולל עם מגיב מדולל.מערבבים בעדינות ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף את הקומפלקס למיקרווול 20 מ"מ מצופה בעבר עם 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית המכיל תאי SHSY5Y ללא אנטיביוטיקה. נערו בעדינות את המנה קדימה ואחורה.בצע טרנספקציה של תאי NIH 3T3 כפי שהודגם קודם לכן, אך החלף את מדיום הסרום המוקטן במקום DMEM/F-12 ללא סרום לדילול פלסמיד ומגיב טרנספקציה. לאחר שעתיים של טרנספקציה, הסר את המדיום המכיל מגיב טרנספקציה והוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי. יש לדגור על תאי NIH 3T3 או SHSY5Y בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 24 שעות.לייצור ROS המופעל באמצעות אור, 24 שעות לאחר הטרנספקציה הסר את מדיום התרבית והוסף 10 מיקרוליטר של ליגנד HaloTag TMR 200 ננו-מולרי או 200 ננו-מולרי Janelia Fluor 646 HaloTag ligand על מיקרו-באר זכוכית 20 מילימטר. מעבירים את התבשיל לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני ומשאירים אותו למשך שעה כדי להכתים את התאים. לאחר שעה, מסירים היטב את מצע הכתמים ומוסיפים מיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי.מניחים צלחת בעלת תחתית זכוכית המכילה את התאים הרצויים על מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר המצויד באינקובטור על הבמה. בתוכנה, לחץ על חלון כלי, בחר Ocular, ולחץ על כפתור DIA כדי להפעיל את האור המועבר. צפו בצלחת דרך עינית המיקרוסקופ והביאו את התאים למיקוד על ידי סיבוב ידית המיקוד.בחר LSM ולחץ על גלאי הצבעים בחר כפתור. לחץ פעמיים על הצבעים הרצויים בחלון הקופץ כדי לבחור את הגדרות הלייזר והסינון המתאימות להדמיית התאים. לחץ על Live4x בחלונית Live כדי להתחיל סריקת לייזר מהירה כדי להתחיל לסנן את האותות הפלואורסצנטיים של התאים.הזז את הבמה באמצעות בקר הג'ויסטיק ואתר את התאים המבטאים diKillerRed VKSKL או SLP-VKSKL המדיום כדי להפעיל לחץ ROS על הפרוקסיזומים. לרכוש תמונה של התא הרצוי. לחץ על חלון הכלי ובחר גירוי LSM.לאחר מכן לחץ על כפתור האליפסה ובחלון Live Image השתמש בעכבר כדי לצייר החזר השקעה בקוטר של 15 מיקרומטר המכיל את הפרוקסיזומים הרצויים שעליהם יופעל לחץ ROS. כדי להחיל לחץ ROS, השתמש ב- 561 ננומטר עבור תאים עם ליגנד SLP שכותרתו diKillerRed VKSKL או TMR והשתמש ב- 640 ננומטר עבור תאים המוכתמים בליגנד SLP של Janelia Fluor 646. בחר את אורך גל הלייזר להחלת מתח ROS.הזן את אחוז הלייזר הרצוי ואת משך הזמן. לייצור ROS בפרוקסיזומים, לחץ על רכש ולאחר מכן על כפתור הגירוי כדי להתחיל את הסריקה עם 561 או 640 ננומטר של אור דרך החזר ההשקעה למשך 30 שניות כל אחד. גירוי זה מתאים לכ-5% הגדרות עוצמת לייזר עבור 561 ו-640 ננומטר.לאחר 30 שניות של תאורת לייזר, פרוקסיזומים בתוך החזר ההשקעה מאבדים את אותות diKillerRed VKSKL, TMR או Janelia Fluor 646. אובדן אות זה מאפשר להבחין בין הפרוקסיזומים המוארים והלא מוארים בתוך התא. כדי לנטר את התאים החיים של הפקסופאג'ים, עקבו אחר הטרנסלוקציה של Stub1, Hsp70, ubiquitin, p62 או LC3B המתויגים ב-EGFP על הפרוקסיזומים המוארים או בעלי הלחץ של ROS על ידי הדמיה בהילוך מהיר תוך שימוש במרווחים של 10 דקות בין פריימים.תאורה מוקדית מובילה לייצור ROS מיידי ומקומי בתוך פרוקסיזומים בודדים, כפי שצוין על ידי כתב הפלואורסצנט roGFP2-VKSKL. תמונת diKillerRed VKSKL צולמה לאחר שכל המדידות של roGFP2-VKSKL נעשו כדי לציין את מיקום הפרוקסיזומים הפגומים. הנתונים מראים גם כי פרוקסיזומים לא מוארים אינם מושפעים, מה שמצביע על דיוק המתודולוגיה.מתודולוגיה זו שימשה לניטור פקסופאגיה בתיווך Stub1. במהלך תהליך זה, Hsp70, Stub1, חלבונים יוביקוויטינציה, מתאמי אוטופגיה p62 ו- LC3B מופיעים לאחר מכן בפרוקסיזומים בסטרס ROS כדי להניע פקסופגיה. באמצעות אותה אסטרטגיה, ניתן היה לפגוע בו זמנית בכל הפרוקסיזומים על צלחת תרבית לצורך אפיון ביוכימי של פקסופאגיה בתיווך Stub1.לפני תאורת ה-LED, פלואורסצנטיות EGFP-ubiquitin הייתה הומוגנית בציטופלסמה ולא התמזגה עם הפרוקסיזומים. לאחר תשע שעות של תאורת LED, אותות EGFP-ubiquitin הצטברו על כל הפרוקסיזומים בתאים שגדלו בצלחת קונפוקלית. באמצעות פרוטוקול זה, מצאנו כי פרוקסיזומים בסטרס של ROS מוסרים דרך מסלול פירוק תלוי יוביקוויטין.פרוקסיזומים בלחץ ROS מגייסים את היוביקוויטין E3 ליגאז Stub1 כדי לאפשר את הסרתם על ידי פקסופגיה.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה כדי לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים מתוארת. Degron-מעורער GFP-(GFP-DGN) וחלבון היתוך יציב GFP-dgnFS נוצר וtransduced לתוך התא באמצעות וקטור ביטוי lentiviral. טכניקה זו מאפשרת ליצור קו יציב GFP-dgn/GFP-dgnFS להביע תא שבו פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום ניתן להעריך בקלות באמצעות epifluorescence או cytometry זרימה.

ניטור של פעילות יוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים באמצעות ערער-חלבון Degron (DGN) ירוק פלורסנט חלבון (GFP)-מבוסס כתב

מוצגת כאן שיטה נוחה וחזקה לחקר אוטופגיה ב-Penicillium chrysogenum באמצעות רפידות הרעבה (תערובות של אגרוז ומי ברז בשקופית מיקרוסקופ המכילה חלל מרכזי).

ניתוח של Autophagy ב<em&gt; Chrysogenum Penicillium</em&gt; על ידי שימוש ברפידות רעב בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

כאן, אנו מתארים בפירוט גישת מיקרוסקופ וידאו זמן-lapse למדידת הגיוס הזמני של EYFP-Parkin במהלך הסרה סלקטיבית של מיטוכונדריה פגומה. תהליך דינמי זה של הסרה תלויה ב-EYFP-Parkin של מיטוכונדריה פגומה יכול לשמש כאינדיקטור לבריאות התא בתנאי ניסוי שונים.

זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו עבור הערכת EYFP-פרקין Aggregation כסמן לסלולאריות Mitophagy

Mitophagy, התהליך של פינוי נפגע המיטוכונדריה, הוא הכרחי עבור תחזוקה מיטוכונדריאלי הומאוסטזיס ובריאות. מאמר זה מציג חלק mitophagy האחרונה שיטות זיהוי תאים אנושיים, Caenorhabditis elegansועכברים.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח כמותי של היווצרות חלבון mitophagy במיוחד בתאי ביתא מדגימות איון האנושי העיקרי. טכניקה זו ובכך מאפשרת ניתוח של mitophagy מתוך חומר ביולוגי מוגבל, אשר חיוניים בדגימות יקרות של תא הלבלב האנושי.

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

מיחזור אנדוזומים הם חלק מהרשת הצינורית האנדוסומית. כאן אנו מציגים שיטה לכמת את הדינמיקה של מיחזור אנדוזומים באמצעות GFP-STX13 כסמן אברונים.

המיקרוסקופיה מבוססת אסאי ללמוד ולנתח את אנדוזומים מיחזור באמצעות סחר SNARE

חקר מיטופגיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, חיישנים גנטיים ואימונופלואורסנציה דורש ציוד יקר, כוח אדם מיומן והשקעת זמן משמעותית. כאן, אנו מדגימים את היעילות של ערכת צבע פלואורסצנטית מסחרית בכימות תהליך המיטופגיה הן ב- Caenorhabditis elegans והן בקו תאים לסרטן הכבד.

איתור מיטופגיה בתאי Caenorhabditis elegans ובתאי יונקים באמצעות צבעים ספציפיים לאברונים

ליפופגיה היא צורה סלקטיבית של אוטופגיה הכוללת פירוק של טיפות שומנים. תפקוד לקוי בתהליך זה קשור להתפתחות סרטן. עם זאת, המנגנונים המדויקים עדיין לא מובנים במלואם. פרוטוקול זה מתאר גישות הדמיה כמותית כדי להבין טוב יותר את יחסי הגומלין בין אוטופגיה, מטבוליזם של שומנים והתקדמות סרטן.

חקר הוויסות של קטבוליזם טיפות שומנים באמצעות ליפופגיה

כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה להערכה תמציתית של רמות סמן אוטופגוזום LC3-II בשלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) על ידי immunoblotting. ניתוח רמות LC3-II ברכבים חשמליים, היווצרות אוטוליזוזום והיווצרות אומגה מצביע על התפקיד החדש של STX6 בשחרור רכבים חשמליים חיוביים ל-LC3-II כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

גשושי PeroxiSPY משמשים לזיהוי פרוקסיזומים בתאי יונקים. כאן אנו מראים כיצד להשתמש בגשושים כדי לצבוע פרוקסיזומים בתאים חיים וקבועים.

צביעת פרוקסיזום בתאי יונקים באמצעות גלאים ספציפיים לפרוקסיזום

חקור את מנגנון פקסופאגיה מווסת Stub1 בתאי SHSY5Y ו-NIH 3T3 תחת מתח חמצני. שיטת הדמיה חיה זו מאפשרת מעקב אחר תהליכי פירוק פרוקסיזומים פגועים ושליטה באיכות האורגנלים.

ניטור Stub1-Mediated Pexophagy

גלה סרטונים נוספים