ניתוח הסתיידות כלי דם חוץ-תאית בתיווך שלפוחית באמצעות מודלים In Vitro ו-In Vivo

פרוטוקול זה מספק שיטה שניתן להשתמש בה כדי לסייע בהערכה, ובעתיד, לסייע בפיתוח טיפולים להסתיידות כלי דם, שהיא המנבא המשמעותי ביותר למחלות לב וכלי דם. היכולת לבודד כלי רכב חשמליים מאפשרת לנו להמשיך ולחקור את המנגנונים המובילים להסתיידות כלי הדם, ואת השינוי הפנוטיפי של תאי שריר חלק בכלי הדם. טכניקה זו מספקת תובנה לגבי מנגנונים מולקולריים מוקדמים של הסתיידות תאי שריר חלק וסקולרית.

הבנה זו מאפשרת ללמוד אפשרויות טיפוליות עבור המנגנון המובן. כל כלי רכב חשמליים מעניינים ניתן ללמוד בשיטה זו. הוא אינו בלעדי לתאי שריר חלק של כלי הדם, אוסטאובלסטים או הסתיידות כלי דם.

לאחר המתת העכבר, הרימו את העור באמצעות פינצטה, ובצעו חתך לאורך קו האמצע. הסירו עודפי עור או שומן. לאחר מכן הסר את איברי הרבייה, שלפוחית השתן והשומן מחוץ לקו האמצע.

לאחר מכן להזיז את איברי העיכול לצד ימין ולעקוב אחר המעיים בקו האמצע. לאחר המציאה, להרים את קו האמצע, ו הבלו את מערכת העיכול עד הבטן. הבלו את הכליות על ידי הרמת אותם מקו האמצע.

לחתוך קרוב ככל האפשר לכליה. הסר את הכבד על ידי הרמת האונות וחיתוך מקו האמצע. לאחר מכן לחורר את הלב ואת אבי העורקים על ידי הזרקת PBS קר לחדר הימני באמצעות מזרק 10 מיליליטר.

חכו שהריאות יתנפחו, ויהפכו ללבנות. הסר את הריאות וכל עודף דיאפרגמה, או כלוב צלעות. כדי להסיר את העצם, פתח זוג מספריים לרוחב והנח אותם באזור התחתון של העכבר מעל הזנב.

חותכים כלפי מטה, מרימים את עמוד השדרה מהעור ומסירים את השומן מצידי קו האמצע. ברגע שהעור מנותק, הבלו את עמוד השדרה ואת האיברים השלמים על ידי חיתוך ממש מעל הלב. הניחו את עמוד השדרה ואת האיברים השלמים בכוס של PBS בדלי הקרח אם מעבירים אותם לסטריאוסקופ.

לאחר העברת עמוד השדרה והאיברים לתוך צלחת הניתוח, מלאו אותו ב-PBS קר כקרח, וננעצו את עמוד השדרה וכלוב הצלעות באמצעות מחטים. תחת מיקרוסקופ דיסקציה מרימים את הלב בזהירות באמצעות פינצטה, ומתחילים לחתוך מעל עמוד השדרה, ומתחת לאבי העורקים. המשיכו בכך עד שמגיעים לתחתית עמוד השדרה.

הסר את עמוד השדרה מצלחת הניתוח, ונעץ את הלב וכל שומן חיצוני, או שריר. החל מהאזור ממש מתחת ללב, זהה את הוושט, הווריד הנבוב ואבי העורקים. הסר את הוושט ואת נבוב הווריד כדי לקבל שדה ראייה ברור של אבי העורקים.

בעזרת מלקחיים מיקרו-דיסקציה ומספריים, מתחילים להרים את רקמת השומן, ולחתוך קרוב ככל האפשר לאבי העורקים. יש להמשיך בקו המדיאלי עד לחשיפת כל אבי העורקים ועורקי הירך. בלב, להסיר את כל רקמת השומן לחשוף את שלושת הענפים בקשת אבי העורקים.

הסר את שורש אבי העורקים מהחדר השמאלי על ידי החדרת מספריים מיקרו דיסקציה לחדר שמאל, וחיתוך השריר המקיף את אבי העורקים. לאחר בידוד וניקוי אבי העורקים, דמיינו את אבי העורקים באמצעות סורק אינפרא אדום קרוב כדי להמחיש הסתיידות כלי דם. באמצעות סקריפט MATLAB מותאם אישית, כמת את האות הכולל של עוקב הסידן המנורמל לאזור אבי העורקים הסרוק הכולל.

כוונו את ה- MATLAB למיקום קובצי TIF מסריקת כמעט אינפרא-אדום של אבי העורקים, פתחו את הקבצים הבודדים וחלצו את ערכי עוצמת הפיקסלים מקובצי TIF. בחרו באבי העורקים עם ההסתיידות הגדולה ביותר כגודל המידה המרבי בתמונה הממופה בצבע. כאשר הפקודה כמה דגימות יש בתמונה מופיעה על החלון, הזן את מספר אבי העורקים בתמונה הנוכחית ובחר כל אבי עורקים בזה אחר זה.

לאחר בחירת אבי העורקים, MATLAB תיצור תמונות בינאריות עם מסיכה של השטח הכולל והאזור המסויד של אבי העורקים. הערכים מתמונות מסיכות אלה משמשים לאחר מכן לקביעת השטח הכולל המסויד, השטח הכולל של אבי העורקים, אזור האחוזים החיוביים להסתיידות והעוצמה הממוצעת של האזור המסויד. מיד לאחר סריקת אבי העורקים, אגרו שניים עד שלושה אבי עורקים כדי להניב ריכוז חלבון מספיק.

יש לדגור על שניים עד שלושה אבי עורקים ב-1.5 מיליליטר של תמיסת עיכול למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאסוף את הפתרון ואת הצנטריפוגה ב 1, 000 גרם במשך 15 דקות כדי להסיר פסולת התא. לאחר מכן, כדי להסיר את microvesicles, צנטריפוגה supernatant שוב במשך 30 דקות ב 33, 000 גרם.

לאסוף ולהעריך את supernatant עבור פוטנציאל הסתיידות. לאחר הסרת פסולת התא מן התווך המותנה שנאסף על ידי צנטריפוגה, לסובב את supernatant שנאסף ב 33, 000 גרם במשך 30 דקות. אספו את הסופרנאטנט והעבירו אותו לצינור חדש.

לאחר מכן הוסף 1% של 300 מילימולר נתרן דימימן פוספט לדגימות שלפוחית חוץ-תאית, וערבב את התמיסה על ידי pipetting. מעבירים 200 מיקרוליטר מתמיסת התערובת לצלחת בת 96 בארות, ודגרים על הצלחת בת 96 הקידוחים בקורא המיקרו-צלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הגדר את קורא הלוחות להקליט את הבליעה באורך גל של 340 ננומטר כל דקה.

פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת הקולגן לתוך כל באר של זכוכית בעלת שמונה בארות, ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% במשך 72 שעות. לאחר הדגירה, להוסיף 300 מיקרוליטר של DMEM כבקרה לתוך הבארות. הוסף 300 מיקרוליטר של דגימות בינוניות שלפוחית חוץ-תאית שנאספו בעבר לבארות הנותרות, ודגר במשך שישה ימים, כפי שהודגם קודם לכן.

ביום העשירי, פיפטה 2.5 מיקרוליטר של תערובת OsteoSense ו- DMEM לכל באר, ולדגור במשך 24 שעות. בסוף הדגירה, דמיינו את ההידרוג'לים עם פילטרים לפלואורסצנטיות של OsteoSense דרך החלק התחתון של תא זכוכית כיסוי באמצעות מיקרוסקופ הפוך, או מלמעלה עם מטרה למרחק עבודה ארוך. הערך את מספר ההסתיידויות ואת גודל ההסתיידות ואת התמונות שנאספו באמצעות אפשרויות ניתוח החלקיקים הזמינות ב- ImageJ.

לאחר מכן נווטו אל 'תמונה', בחרו 'התאמה' ולחצו על 'סף' כדי לבצע בינאריזציה של התמונות, כך שרק אות OsteoSense יופיע לבן. לאחר מכן השתמשו בפקודה 'נתח' ולחצו על הפקודה 'נתח חלקיקים' לקבלת מידע לכל הסתיידות בתמונה. השתמש באותם פרמטרי סף לקבלת עקביות עבור כל תמונה שנותחה.

הדמיית סורק אופטי קרוב לאינפרא-אדום של אבי העורקים שנותח הראתה אות OsteoSense גבוה יותר בכל אבי העורקים של עכבר עם מחלת כליות כרונית מאשר שני אבי העורקים מעכברי ביקורת. התווך המותנה שהתקבל מתאי שריר חלק של כלי דם שגודלו בתווך פרו-קלציפיסטי הראה ספיגה גבוהה יותר ב-340 ננומטר מאשר מדיום הביקורת. העלייה בספיגה התרחשה פי 1.5 מהר יותר במדגם פרו-קלציפי בהשוואה לדגימת ביקורת.

התווך המותנה מתאים שגודלו בתרבית בתנאים פרו-קלציפיים הכיל מרבצי מינרלים. בעת ניתוח מיקרו של אבי העורקים, חשוב לחתוך את השומן סביב אבי העורקים בזהירות. אתה רוצה כמה שיותר של אבי העורקים לנתח, אבל זה יכול להיות די מייגע.

לאחר בידוד כלי הרכב החשמליים, ניתן יהיה להשלים בדיקות נוספות, כגון בדיקת פעילות אלקליין פוספטאז, או גוף חיסוני. בדיקות אלה יראו עוד יותר את המנגנונים והחלבונים הקיימים ברכב חשמלי.