Name: הקמה, תחזוקה, בידול, מניפולציה גנטית והשתלה של אורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: למדו כיצד להקים ולתחזק אורגנואידים של בלוטת הדמעות מעכברים ובני אדם. השיטה כוללת עיכול רקמה, בידול תאים ומניפולציה גנטית באמצעות אלקטרופורציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ליוריק פוסט על הפיתוח הראשוני של הפרוטוקול. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרס של האתגר הגדול של חקר הסרטן בבריטניה (C6307/A29058) וקרן מארק לחקר הסרטן לצוות SPECIFICANCER.

<ol><li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+development%3A+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li>
<li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+infection+of+the+external+eye%3A+The+role+of+tears%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li>
<li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+treatment+of+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Deutsches+Arzteblatt+International%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li>
<li>Massie, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+lacrimal+gland+spheroids+for+lacrimal+gland+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li>
<li>Bannier-Hélaouët, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li>
<li>Jeong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+functional+epithelial+organoids+from+human+lacrimal+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands.</a> Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 247(2021).</li>
<li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li>
<li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520(2021).</li>
<li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li>
<li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues%3A+Studies+in+a+C57BL%2F6J+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232(2015).</li>
<li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438(2022).</li>
<li>Lõhmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
<li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvolution+of+complex+DNA+repair+%28DECODR%29%3A+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li>
<li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy%3A+Developmental+aspects+and+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li>
<li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+regeneration%3A+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li>
</ol>

הנס קלברס הוא ראש מחקר פארמה ופיתוח מוקדם ברוש, בזל, ומחזיק במספר פטנטים הקשורים לטכנולוגיית אורגנואידים.

פרוטוקול זה מתאר את ההקמה והשימוש באורגנואידים של בלוטת הדמעות לבדיקות תפקודיות, מידול מוטציות והשתלות. בעת הקמת אורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית, דיסוציאציה של רקמות היא קריטית. אם הרקמה אינה מתעכלת מספיק, תפוקת האורגנואידים תהיה נמוכה. אם הרקמה מתעכלת יתר על המידה, התאים ימותו ולא יגדלו כאורגנואידים. כל רקמה צריכה להיות מעוכלת עם אנזים מסוים לזמן מסוים כדי להבטיח צמיחה אופטימלית של אורגנואידים14,17,18. בלוטת הדמעות היא רקמה רכה למדי שעיכול collagenase של 5-10 דקות בשילוב עם דיסוציאציה מכנית מבוססת פיפטינג מספיק כדי לבודד חתיכות קטנות של רקמה. אם יש צורך להשיג תאים בודדים עבור יישומים כגון ריצוף RNA של תא בודד, הדיסוציאציה יכולה להתבצע למשך זמן רב יותר עד שמגיעים לשלב התא הבודד, אך יש להפסיק את הדיסוציאציה ברגע שמתקבלים תאים בודדים כדי להגביל כל ירידה בכדאיות. מכיוון שדסוציאציה של רקמות היא כה חיונית, עיכול יתר הוא הסיבה הסבירה ביותר לכישלון של הקמת אורגנואידים של בלוטת הדמעות.
תחזוקה מתאימה של אורגנואידים בלוטת הדמעות חשוב לשימוש בהם. תחזוקה לטווח ארוך היא סימן ההיכר של אורגנואידים של בלוטת הדמעות שמקורם בתאי גזע בוגרים, בהשוואה לאורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים 7,17. כדי להשיג תחזוקה לטווח ארוך, יש לבצע פיצול אורגנואידים קבוע ושינויים בינוניים. ללא זאת, אורגנואידים מתחילים להתמיין ולפתח פוטנציאל תאי גזע מופחת, מה שפוגע בתחזוקתם לטווח ארוך7. בשלב זה שוב, עיכול יתר עלול להרוג את תאי הגזע ולפגוע בתחזוקת האורגנואידים. לתחזוקה שוטפת, אין צורך בדיסוציאציה אורגנואידית לתאים בודדים. עם זאת, כדי ליצור קווי אורגנואיד נוק-אאוט משובטים, חיוני להתחיל עם תאים בודדים. אם לא, האורגנואידים יהיו מורכבים מפסיפס של תאים בעלי רקע גנטי שונה, מה שהופך את ניתוח ההשפעה של מוטציה אחת מוגדרת לבלתי אפשרית. כאן, אנו מתארים את השימוש בעורך בסיס C > T כדי ליצור קודוני עצירה. עורך גנום זה מסתמך על נוכחות קודונים של ארגינין, גלוטמין או טריפטופן בטווח של 12-18 בסיסים מ-NGG PAM. כאשר תנאים אלה אינם מתקיימים בתכנון gRNA,ניתן להשתמש בעורכי בסיס Cas9 או C >T קונבנציונליים עם PAMs חלופיים 7,18. עם זאת, Cas9 קונבנציונאלי מציג הפסקות דו-גדיליות הגורמות לאינדלים עם תיקון11. מכיוון ששני האללים עשויים להכיל אינדל שונה, גנוטיפ שיבוט דורש זהירות נוספת. יש לבצע דה-קונבולוציה של השינויים שהוכנסו כדי להבטיח ששני האללים יכילו אינדלים מחוץ למסגרת, ומכאן, ששיבוטי האורגנואידים ייעלמו עבור הגן הממוקד19. היתרון של עורכי בסיס C > T טמון בעובדה שניתן להשתמש בהם כדי למדל מוטציות נקודתיות שאינן בהכרח גורמות לקודוני עצירה. לדוגמה, ניתן להשתמש בהם כדי למדל מוטציות Pax6 ספציפיות שנמצאו בחולים עם אנירידיה כדי לחקור את השפעתן על הפיזיולוגיה של בלוטת הדמעות20.
בלוטת הדמעות מפרישה את החלק המימי של סרט הדמעות1. הפרשת דמעות יכולה להיות reapitulated באורגנואידים אנושיים לאחר התמיינות בתיווך נסיגה גורם גדילה עיכוב NOTCH. בתנאים אלה, אורגנואידים עוברים התמיינות סופנית ולא ניתן להמשיך ולתחזק אותם. עם זאת, אורגנואידים מובחנים של בלוטת הדמעות יכולים להנחות את הפיתוח של תרופות הגורמות לקריעה בהקשר של מחלת העין היבשה, באופן פוטנציאלי במסכים בעלי תפוקה גבוהה. בדיקת הקריעה המוצגת בפרוטוקול זה היא זו שנותנת כרגע את השינוי הגדול ביותר בגודל האורגנואידים בזמן קצר, מה שמקל על הכימות בהקשר של מסך סמים 7,9,17.
טיפול בתאי גזע טומן בחובו הבטחה גדולה להתחדשות בלוטת הדמעות במחלת העין היבשה21. אורגנואידים של בלוטת הדמעות שמקורם בתאי גזע בוגרים יכולים להיות חומר מקור ליישומים כאלה. הפרוטוקול המוצג כאן גורם לקליטת אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית, בעיקר כציסטות. קליטת אורגנואידים נמוכה יכולה להיווצר עקב הזרקת אורגנואידים לאתר הלא נכון. אימון הליך ההזרקה עם צבע מאפשר מעקב אחר אתר ההזרקה, ובסופו של דבר, משפר את דיוק ההזרקה. לחלופין, ניתן לחרוט את האפידרמיס של העכבר כך שתהיה לו גישה ישירה לבלוטת הדמעות, כפי שנעשה בחולדות לפניגיל 22. שיטה זו אורכת זמן רב יותר אך עשויה להיות מדויקת יותר. מצד שני, בפרוטוקול הנוכחי, האורגנואידים לא השתלבו באופן פונקציונלי בבלוטת הדמעות של העכבר. תוצאות דומות נצפו עבור השתלת בלוטת הדמעות שמקורה ב- iPSC22. ניתן לשפר עוד יותר את שיטת ההשתלה על ידי פציעה מראש של בלוטת הדמעות, שימוש במודל עכבר עין יבשה, ו / או הזרקת האורגנואידים כתאים בודדים או גושים קטנים. עם זאת, אורגנואידים של בלוטת הדמעות שמקורם בתאי גזע בוגרים וערכת הכלים הקשורה אליהם יכולים להיות הבסיס ליישומים עתידיים במחקר בלוטת הדמעות וברפואה רגנרטיבית.

בלוטת הדמעות היא אפיתל הבלוטות האחראי לייצור רוב השכבה המימית של סרט הדמעות1. השכבה המימית של סרט הדמעות מכילה לא רק מים כדי לשמן את פני השטח של העין, אלא גם רפרטואר גדול של רכיבים מיקרוביאליים המגנים על פני השטח של העין מפני זיהומים2. כאשר בלוטת הדמעות ניזוקה או דלקתית, מתרחשת מחלת עין יבשה, אשר גורמת לאי נוחות לחולים ויכולה בסופו של דבר להוביל לאובדן ראייה3. במהלך השנים, מערכות מודל לחקר בלוטת הדמעות, במיוחד בלוטת האדם, היו מוגבלות 4,5,6. זה תרם לפער ידע לגבי תפקוד בלוטת הדמעות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
לאחרונה, מודלים במבחנה פותחו כדי לחקור את בלוטת הדמעות בצלחת 7,8,9. אורגנואידים אלה של בלוטת הדמעות נגזרים מתאי גזע בוגרים הגדלים כמבנים תלת-ממדיים במטריצה חוץ-תאית בתוספת קוקטייל של גורמי גדילה המקיימים את יכולות ההתחדשות שלהם במבחנה7. היתרון של אורגנואידים שמקורם בתאי גזע בוגרים (ASC) הוא שניתן לשמור עליהם במשך זמן רב מאוד תוך שחזור תכונות רקמות בריאות. סוג זה של אורגנואיד מורכב אך ורק מתאי אפיתל, בניגוד לאורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC), אשר עשויים להכיל גם תאי סטרומה, למשל. שלא כמו אורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC), אורגנואידים של ASC נוצרים ישירות מרקמה בוגרת ואינם דורשים שינויים גנטיים כלשהם כדי להיות מורחבים. אורגנואידים ASC מבטאים מאפיינים בוגרים10.
פרוטוקול זה מכיל ארגז כלים להפקת אורגנואידים של בלוטת הדמעות מרקמה ראשונית של עכבר ואדם. הפרוטוקול מתאר כיצד לשפר עוד יותר את הפונקציונליות של האורגנואידים על ידי נסיגה פשוטה של גורם גדילה וכיצד לעורר את האורגנואידים להפריש נוזל דמעות על ידי ביצוע בדיקת נפיחות. פרוטוקול זה כולל בנוסף שיטת טרנספקציה מבוססת אלקטרופורציה להנדסה גנטית של אורגנואידים עכבריים באמצעות עורכי בסיס הנגזרים מקריספר. שלא כמו Cas9 קונבנציונאלי, השימוש בעורכי בסיסים מאפשר שינוי של בסיסים בודדים בגנום מבלי ליצור שבר דו-גדילי11,12. לבסוף, מתוארת השתלה אורתוטופית של אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית בעכברים מדוכאי חיסון וההערכה ההיסטולוגית שלאחר מכן של ההשתלה. ערכת כלים זו לאורגנואיד בלוטת הדמעות יכולה לשמש במחקר על התחדשות ותפקוד בלוטת הדמעות ולמידול מחלות גנטיות ודלקתיות.

<table><tbody><tr><td>צינורות צנטריפוגה נעילה בטוחה 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td>CAS: 868272-85-9, זהירות, ניתן לאחסן תמיסה של 6 גרם/ליטר בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>5x ירוק GoTaq Flexi buffer</td><td>חנות Promega</td><td>M891A</td><td>ב -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>חנות ב -20 מעלות; C, מלאי ב-30 מ"מ, 10000x</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>חנות ב-4 מעלות; </td></tr><tr><td>C צלחות אגר המכילות Ampicillin</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin מלח נתרן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave VADI-Line lite</td><td>VWR כימיקלים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 תוסף</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>חנות ב -20 & deg; C, 50x</td></tr><tr><td>BD מחט אינסולין מיקרו-עדינה 1 מ"ל</td><td>BD Bioscience</td><td>324825</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שולחני DMI1</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine סרום אלבומין (BSA)</td><td>MP ביו-רפואי</td><td></td><td>160069 חנות ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>BTXpress</td><td>BTX</td><td>MDS450805</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 עכברים</td><td>מכון האברכט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קלטות</td><td>Klinipath</td><td>410-02S</td><td></td></tr><tr><td>CellBanker 1</td><td>amsbio</td><td>11910</td><td>מדיום שימור קריו, הקפידו על ההוראות</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון מונוהידראט</td><td>J.T. Baker</td><td>0088</td><td>CAS: 5949-29-1</td></tr><tr><td>קולגנאז I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9407</td><td>Aliquots ב-20 מ"ג/מ"ל, פי 20, יש לאחסן ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל</td><td>Corning</td><td>CLS430828-500EA</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים 24 מ"מ x 50 מ"מ</td><td>Menzel-Gl&auml; zer</td><td>BB024050S1</td><td></td></tr><tr><td>תמצית קרום הבסיס של Cultrex (BME), גורם גדילה מופחת, סוג 2 - מטריצה חוץ-תאית</td><td>R& D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td>חנות ב -20 & deg; C, שמור על 4 מעלות; C למשך עד חודש</td></tr><tr><td>חנות DAPT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5942</td><td>ב-20 מעלות; C, מלאי ב-10 מ"מ, 1000x</td></tr><tr><td>דיסודיום מימן פוספט נטול מים</td><td>כימיקלים VWR</td><td>28026.292</td><td>CAS: 7558-79-4</td></tr><tr><td>Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td>CAS:10028-24-7</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17105-041</td><td>Aliquots ב-50 U/mL, אחסן ב-20 מעלות; C עד השימוש, 400x</td></tr><tr><td>אזמל סטרילי חד פעמי N&deg; 10</td><td>Swann Morton</td><td>3033838</td><td></td></tr><tr><td>DM4000 מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPs 25 מ"מ</td><td>Promega</td><td>U1420</td><td>מערבבים את כל 4 הנוקלאוטידים יחד, מאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט (DPBS) של Dulbecco</td> <td>Gibco</td><td>14190144</td><td>1x</td></tr><tr><td>מסננים קלים 70 ומיקרו; m</td><td>Greiner</td><td>542170</td><td></td></tr><tr><td>קובטה אלקטרופורציה</td><td>Nepagene</td><td>EC002S</td><td></td></tr><tr><td>EnVision+/HRP</td><td>עכבר Agilent</td><td>K400111-2</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 100%</td><td>BOOM</td><td>84045206; 5000</td><td>זהירות, השתמש להכנת דילול אתנול אחר</td></tr><tr><td>אתנול 70%</td> <td>BOOM</td><td>84010059.5000</td><td>זהירות</td></tr><tr><td>אתנול 96%</td> <td>BOOM</td><td>84050065.5000</td><td>זהירות</td></tr><tr><td>EVOS FL AUTO מערכת הדמיה 2 תאים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Live-imaging brightfield microscrope</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>חנות ב -20 & deg; C, מלאי ב-100 מ"ג/מ"ל במדיום בסיס, 100x</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH, מפתחי</td><td></td><td></td>פיג'י</tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד 4%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1.00496</td><td>CAS: 50-00-0, זהירות</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris</td><td>1099</td><td>חנות ב-20 מעלות; C, מלאי ב-10 מ"מ, 10000x</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td>חנות ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Haematoxylin</td><td>VWR כימיקלים</td><td>10047105</td><td>לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>חנות בטמפרטורה של 4 מעלות; C, 100x</td></tr><tr><td>Histocore H ו-C, מכונת הטמעת רקמות</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Meidax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטיגן גרעין אנושי</td><td>Abcam</td><td>ab-190710</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית 5 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10605882</td><td>CAS: 7647-01-0, זהירות</td></tr><tr><td>מימן פרוקסיד 30%</td> <td>Chem-lab</td><td>CL00.2308.1000</td><td>CAS: 7722-84-1, זהירות</td></tr><tr><td>Hygromycin B-gold</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg</td><td>מלאי ב-100 מ"ג/&מיקרו; L, 1000x</td></tr><tr><td>קלטת עמידות להיגרומיצין המכילה פלסמיד</td><td></td><td></td><td>אנדרסון-רולף ואחרים, שיטות טבע, 2017. doi: 10.1038 / nmeth.4156</td></tr><tr><td>IsoFlo 100%</td> <td>Mecan</td><td>5960501</td><td></td></tr><tr><td>LB בינוני</td><td>מכון</td><td></td><td></td>האברכט</tr><tr><td>MgCl2 25 מ"מ</td><td>Promega</td><td>A351H</td><td>חנות ב -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Microtome RM2235</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midiprep ערכת בידוד DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210005</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep ערכת בידוד DNA</td><td>ThermoFisher מדעית</td><td>K210003</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>חנות ב-20 מעלות; C, מלאי ב-500 מ"מ, 400x</td></tr><tr><td>NEPA21 אלקטרופורטור</td><td>Nepagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td>חנות ב-20 מעלות; C, מלאי ב-1M, 100x</td></tr><tr><td>NOD Scid Gamma (NSG) עכברים</td><td>מושבת מכון הוברכט Noggin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום מותאם</td> אישית <td>U-Protein Express</td> חנות <td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>חנות Noradrenaline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7257</td><td>ב -20 מעלות; C, מלאי ב-100 מ"מ</td></tr><tr><td>סט תנור</td><td>ממרט</td><td></td><td>ב-58 מעלות; פיפטות C</td></tr><tr><td>P20, P200 ו-P1000</td><td>גילסון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרפין</td><td>VWR</td><td>כימיקלים 10048502</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר, זכוכית מחוברת</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific 1150-6973</td><td></td></tr><tr><td>Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&nbsp;</td><td>Pax6_C>T_R IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td><td>Addgene</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>חנות ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>פרטקס</td><td>קליניפת</td><td>AM-08010</td><td></td></tr><tr><td>pFYF1320&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>47511</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1000X, יש לאחסן ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>פרוסטגלנדין E2 (PGE2)</td><td>Tocris</td><td>2296</td><td>חנות ב-20 מעלות; C, מלאי ב-10 מ"מ, צלחת פטרי 10000x</td></tr><tr><td>, 10 ס"מ</td><td>גריינר</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>מאגר Q5</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 פולימראז DNA בנאמנות גבוהה</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick ערכת מיצוי ג'ל</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract תמיסת מיצוי DNA</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td>חנות ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>R-spondin 3 בינוני מותאם</td> אישית <td>U-Protein Express</td> חנות <td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>ב-20 מעלות; </td></tr><tr><td>פריימר הפוך C sgRNA: TCTGCGCCCATCTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTCCACAG</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>StarFrost</td><td>MBB-0302-55A</td><td>דבק,</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>טחון Merck</td><td>8.22335.1000</td><td>CAS: 26628-22-8, זהירות</td></tr><tr><td>נתרן ציטראט דיהידראט</td><td>J.T. Baker</td><td>0280</td><td>CAS: 6132-04-3</td></tr><tr><td>פריימר קדימה סטנדרטי: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>יעילות שיבוט תאים מוכשרים DH5alpha</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>לוחות תרבית תאי השעיה (24 בארות)</td> <td>Greiner Bio-One</td><td>662102</td><td>24 בארות</td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאי השעיה (12 בארות)</td> <td>Greiner Bio-One</td><td>665102</td><td>12 בארות</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TAE מאגר ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>B49</td><td>מלאי ב-50x, מדלל ל-1x עם מים טהורים במיוחד</td></tr><tr><td>המכיל פלסמיד</td><td></td><td></td> המכיל טרנספוזאז <td>אנדרסון-רולף ואחרים, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td>חנות ב-4 מעלות; </td></tr><tr><td>פריימר C U6_Forward: GGGCAGGAAGAGGCCTAT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose 1000</td><td>Invitrogen</td><td>16550</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>Tulabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Klinipath</td><td>4055-9005</td><td>CAS: 1330-20-7, זהירות</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>Y-27632 דיהידרוכלוריד</td><td>אחסן ב-20 מעלות; C, מלאי ב-10 מ"מ, פי 1000</td></tr></tbody></table>

הקמה, תחזוקה, בידול, מניפולציה גנטית והשתלה של אורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

בלוטת הדמעות היא איבר חיוני להומאוסטזיס פני העין. על ידי ייצור החלק המימי של סרט הדמעות, הוא מגן על העין מפני לחץ התייבשות ועלבונות חיצוניים. מעט ידוע על פיזיולוגיה של בלוטת הדמעות (פתו) בגלל היעדר מודלים מתאימים במבחנה . טכנולוגיית אורגנואיד הוכיחה את עצמה כפלטפורמה ניסיונית שימושית עבור איברים מרובים. כאן, אנו חולקים פרוטוקול כדי לקבוע ולתחזק אורגנואידים של בלוטת הדמעות של עכברים ובני אדם החל מביופסיות של בלוטת הדמעות. על ידי שינוי תנאי התרבית, אנו משפרים את פונקציונליות האורגנואידים של בלוטת הדמעות. ניתן לחקור את הפונקציונליות של אורגנואידים באמצעות בדיקת "בכי", הכוללת חשיפת אורגנואידים של בלוטת הדמעות למוליכים עצביים נבחרים כדי לגרום לשחרור דמעות בלומן שלהם. אנו מסבירים כיצד לדמיין ולכמת את התופעה. כדי לחקור את תפקידם של גנים מעניינים בהומאוסטזיס של בלוטת הדמעות, אלה יכולים להיות מהונדסים גנטית. אנו מתארים ביסודיות כיצד לשנות גנטית אורגנואידים של בלוטת הדמעות באמצעות עורכי בסיס - החל מתכנון RNA מנחה ועד גנוטיפ שיבוט אורגנואידים. לבסוף, אנו מראים כיצד לחקור את פוטנציאל ההתחדשות של אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית על ידי השתלה אורתוטופית בעכבר. יחד, ערכת כלים מקיפה זו מספקת משאבים לשימוש באורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית כדי לחקור פיזיולוגיה של בלוטת הדמעות (פתו).

בעקבות הדיסקציה של בלוטת הדמעות של העכבר (איור 2A), העיכול האנזימטי והמכני יצר שברי רקמות קטנים, שביניהם ניתן היה להבחין בין האסיני לתעלות (איור 2B). חתיכות הרקמה הגדולות הנותרות יערערו את יציבות ה- ECM, מה שיפחית את צמיחת האורגנואידים הראשונית. הפקת אורגנואיד בלוטת הדמעות של העכבר הייתה מוצלחת כאשר אורגנואידים ציסטיים בקוטר ~500 מיקרומטר נמצאו לאחר ~7 ימים, השלב שבו האורגנואידים היו מוכנים לפיצול (איור 2C). אפילו אם הנגזרת הכוללת של אורגנואידים מוצלחת, חלק מהאורגנואידים עשויים להתחיל לגדול לפני שיפסיקו בסופו של דבר. אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית גדלו כציסטות תוך 3-4 ימים והגיעו לגודל מלא תוך 10-14 יום לאחר בידוד רקמות (איור 2D). הן עבור עכברים והן עבור בני אדם, גזירת אורגנואידים נכשלה לעתים, ללא אורגנואידים או מעטים שצמחו החוצה; זה נגרם בדרך כלל על ידי עיכול יתר של הרקמה. אורגנואידים של בלוטת הדמעות של העכבר יכולים לעבור לפחות פי 40 והאורגנואידים האנושיים לפחות פי 20. המעבר נעשה כל 7-10 ימים בממוצע, בהתאם לגידול האורגנואידים.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> איור 2: התבססות אורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית. (A) תצלומים של השלבים השונים של דיסקציה של בלוטת הדמעות בעכבר. החץ מצביע על בלוטת הדמעות שמתחת לקרום המגן שלה. (B) תמונות ברייטפילד של תאי בלוטת הדמעות של עכבר מיד לאחר עיכול הרקמות, עם כניסות המציגות אסינוס וצינור. (C) תמונות ברייטפילד של נגזרת אורגנואיד מוצלחת ולא מוצלחת של בלוטת הדמעות של עכבר. (D) תמונות ברייטפילד של צמיחת אורגנואידים אנושיים במשך 14 יום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
אורגנואידים בלוטת הדמעות מכילים חלק גדול של תאי גזע כאשר הם מתורבתים בתווך ההתפשטות. כדי להגדיל את רמת הבידול שלהם, הקמנו עכבר ומדיום בידול אנושי עם תוכן מופחת של גורם גדילה. לאחר 5 ימים ו-7 ימים, בהתאמה, במדיום ההתמיינות, אורגנואידים של העכבר ובלוטת הדמעות האנושית נעשו צפופים יותר (איור 3A-B). שינוי מורפולוגי זה היה בקורלציה עם תכונות פונקציונליות מוגברות. הפעלת AMP מחזורית פורסקולין או המוליך העצבי נוראפינפרין גרמה לנפיחות אורגנואידים (כלומר, הפרשת מים אפיים) תוך פחות מ-3 שעות (איור 3C). כאשר הנפיחות נמשכה יותר מ 3-4 שעות, זה הציע כי האורגנואידים לא היו מובחנים מספיק ו / או לא ביטאו סמנים פונקציונליים, כגון קולטנים עבור נוירוטרנסמיטורים.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> איור 3: התמיינות בין אורגנואידים של בלוטת הדמעות של עכבר ושל בני אדם ובדיקת נפיחות תפקודית באורגנואידים אנושיים. (A) תמונות ברייטפילד של אורגנואידים של בלוטת הדמעות של עכבר שגודלו בתרבית בתווך התפשטות במשך 7 ימים ובמדיום התמיינות במשך 5 ימים לאחר יומיים בתווך התפשטות. (B) תמונות שדה בהיר של אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית שגודלו בתרבית בתווך התפשטות במשך 11 יום ובתווך התמיינות במשך 9 ימים לאחר יומיים בתווך התפשטות. (C) תמונות ברייטפילד של אורגנואידים מובחנים של בלוטת הדמעות האנושית שנחשפו למדיום התמיינות טרי (בקרה), ל-1 מיקרומטר פורסקולין ול-100 מיקרומטר נוראפינפרין במשך 3 שעות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כדי לחסל את Pax6 באורגנואידים של בלוטת הדמעות של עכברים, פלסמיד שהכיל את ה-gRNA המכוון ל-Pax6 שנבחר נוצר על-ידי PCR וקשירה (איור 4A). פלסמיד זה המכיל gRNA התחשמל יחד עם פלסמידים Piggy-Bac (פלסמידים המכילים טרנספוזון התנגדות היגרומיצין ופלסמידים המכילים טרנספוזאז) ועורך הבסיס C &gt; T Cas9 באורגנואידים של בלוטת הדמעות של עכברים שנותקו לתאים בודדים. לאחר 3 ימים, כאשר האורגנואידים החלימו, הם נחשפו להיגרומיצין כדי לבחור שיבוטים ששילבו את קלטת העמידות להיגרומיצין. באלקטרופורציות מוצלחות צמחו אורגנואידים עמידים להיגרומיצין (איור 4B). השיבוטים האורגנואידים הגדלים שהיו גדולים מ~300 מיקרומטר נקטפו, באופן אידיאלי לפני שהם התחילו להתמיין באופן ספונטני (איור 4C). DNA הופק מחלק מהאורגנואיד תוך שמירה על השאר בתרבית. הגברת ה-PCR של מוקד Pax6 שאליו מכוון ה-gRNA הניבה פס של 367 bp עבור כל אחד מהשיבוטים שנבחרו (איור 4D). לאחר ריצוף הלוקוס המוגבר, נשמרו שיבוטים שהיו הומוזיגוטיים C &gt; T ערוכים (n = 1). מצד שני, שיבוטים שלא נערכו (n = 4), נערכו באופן הטרוזיגוטי או נערכו באופן שגוי (n = 1) הושלכו (איור 4E). בסך הכל, באמצעות gRNA זה המכוון ל-Pax6, התקבל שיבוט הומוזיגוטי אחד של בלוטת הדמעות של עכבר מתוך שישה רצפים. חלק מהשיבוטים גדלו היטב, אולם חלק משיבוטי האורגנואידים אבדו לאחר שנקטפו או החלו להתמיין (איור 4F). מתוך 10 שיבוטים אורגנואידים שנבחרו, 7 צמחו היטב.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> איור 4: נוק-אאוט בתיווך עריכה בסיסית של Pax6 באורגנואידים של בלוטת הדמעות של עכבר. (A) מעקב ריצוף סנגר של pFYF1320 לאחר אינטגרציה נכונה של ה-gRNA המכוון למוקד Pax6. (B) תמונות ברייטפילד של אורגנואידים של בלוטת הדמעות של עכבר 5 ימים לאחר החשיפה להיגרומיצין בעקבות אלקטרופורציה. האורגנואידים גודלו בתרבית במדיום התפשטות עכבר. משמאל דוגמה להתחשמלות כושלת, ללא שיבוט עמיד להיגרומיצין. מימין דוגמה להתחשמלות מוצלחת, עם כמה שיבוטים אורגנואידים עמידים להיגרומיצין ששרדו. (C) תמונות ברייטפילד של שיבוטים שיש לבחור ושיבוטים שאין לקטוף. (D) ג'ל אגרוז המראה את ההגברה של מוקד Pax6 הממוקד עם gRNA. בירוק, הרצועה בגודל הצפוי של 367 bp מודגשת. (E) מעקב אחר ריצוף סנגר של שלושה שיבוטים אורגנואידים שהיו עמידים להיגרומיצין. השיבוט העליון אינו ערוך. השיבוט האמצעי הוא מהדורת C &gt; T הומוזיגוטית, ומכאן נוק-אאוט הומוזיגוטי. השיבוט התחתון מציג שתי מוטציות נקודתיות הטרוזיגוטיות והוא נוק-אאוט הטרוזיגוטי או שיבוט מעורב ונערך באופן שגוי. (F) תמונות ברייטפילד של שיבוטים אורגנואידים שנבחרו עם רמות שונות של גידול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
לבסוף, כדי לבצע השתלה אורתוטופית אורתוטופית של בלוטת הדמעות האנושית בעכברים, נעשה שימוש באורגנואידים שפוצלו 3 ימים מראש (&lt; בקוטר 100 מיקרומטר). קליטת אורגנואידים אושרה חודש לאחר הזרקת האורגנואידים לבלוטת הדמעות של העכבר על-ידי צביעה של סמן ספציפי לאדם, האנטיגן הגרעין האנושי (איור 5). היעדר כתמי ניקוב מכל חלקי בלוטת הדמעות של העכבר סימל חוסר בקליטת אורגנואידים אנושיים.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> איור 5: השתלת אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית בבלוטת הדמעות של העכבר. צביעה של בלוטות דמעות עכבר מושתלות עבור סמן הגרעין האנושי כדי לפקח על קליטה 1 חודש לאחר ההשתלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה משלימה 1: הרכב המדיה והחוצצים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

פרוטוקול זה מתאר כיצד להקים, לתחזק, לשנות גנטית, להבדיל, לאפיין תפקודית ולהשתיל אורגנואידים של בלוטת הדמעות שמקורם ברקמת עכבר ראשונית ורקמה אנושית.

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

עם אורגנואידים של בלוטת הדמעות, ניתן לבדוק כיצד גנים מסוימים שולטים בהומאוסטזיס של בלוטת הדמעות. בנוסף, ניתן להשתמש באורגנואידים לרפואה רגנרטיבית. היתרון העיקרי של טכנולוגיית אורגנואיד בלוטת הדמעות שמקורה בתאי גזע בוגרים הוא שהיא מאפשרת צמיחה ולימוד של תאי אפיתל בריאים ולא מותמרים של בלוטת הדמעות.אורגנואידים אלה יכולים לשמש בסופו של דבר לטיפול בחולים עם מחלת עין יבשה. התחל בהכנת המדיום והחומר הדרושים לניסוי, ולאחר מכן שלב את כל מרכיבי מדיום העיכול לפני הניסוי. הרטיבו מראש את האזמלים בתווך זה כדי למנוע חתיכות רקמה להידבק אליהם.שלפו את רקמת בלוטת הדמעות של העכבר מהמדיום, הניחו אותה בצלחת הפטרי וטחנו אותה בעזרת אזמלים שהורטבו מראש. ברגע שחתיכות הרקמה הן פחות מ -0.5 מילימטרים מעוקבים, מגרדים אותם מצלחת הפטרי עם האזמל, ומעבירים אותם לצינור של 15 מיליליטר המכיל את מדיום העיכול. עבור ביופסיה אנושית קטנה מאוד, מניחים אותה ישירות במדיום העיכול ללא טחינה.לדגור על צינור 15 מיליליטר שיש חתיכות רקמה עד 15 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. בינתיים, צרים קצה פיפטה של פסטר בלהבה, והרטיבו אותו מראש בתווך הבסיס. כדי להקל על תהליך הדיסוציאציה, פיפטה את התערובת הטחונה למעלה ולמטה כל חמש דקות עם פיפטת פסטר רטובה מראש וצרה.כאשר תאים בודדים רבים וגושים קטנים נראים מתחת למיקרוסקופ, עצרו את הדיסוציאציה על ידי הוספת 10 מיליליטר של תווך הבסיס. לאחר סיבוב במשקל של 400 גרם במשך חמש דקות, מסירים את הסופרנטנט, ומרחפים מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר ממדיום הבסיס כדי לחזור על השטיפה והגלולה במורד התאים. הסר את חתיכות הרקמה הגדולות והלא מעוכלות ואת סיבי הקולגן הנותרים על ידי סינון התערובת הטחונה דרך מסננת של 70 מיקרומטר.סובבו את הפולט במשקל של 400 גרם למשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של מטריצה חוץ-תאית קרה, או ECM, עבור בלוטת דמעות עכבר בודדת ו-50 מיקרוליטר של ECM קר עבור ביופסיה אנושית, מבלי ליצור את הבועות. זרעו עד 100 מיקרוליטר תאים לכל באר של צלחת תרחיף של 12 בארות באמצעות P200 כדי ליצור טיפות של כ -20 מיקרוליטר בבאר.הניחו את הצלחת הפוכה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות כדי לאפשר התמצקות ECM. לאחר מיצוק ה-ECM, הוסף כמיליליטר אחד של מדיום הרחבת עכבר בטמפרטורת החדר לכל באר של צלחת בעלת 12 בארות. מכינים טרייה מיליליטר אחד של מדיום התמיינות אנושי המכיל רכיבים בודדים הגורמים להפרשה על ידי אורגנואידים של בלוטת הדמעות.במיקרוסקופ אוטומטי של קיטועי זמן של שדה בהיר, הגדר את המיקומים לצילום בלוח, את מרווח הזמן של חמש דקות ואת משך הזמן של ארבע שעות. ודא שטיפת ECM שלמה גלויה בכל מיקום. לפני תחילת הצילום, הסר את מדיום התרבית מהבארות שיש לצלם מבלי להזיז את הצלחת מהמיקרוסקופ, והחלף אותו במדיום התמיינות אנושי טרי שהוכן מחדש היטב המכיל תרכובות, כולל פורסקולין ונוראדרנלין.כבקרה שלילית, כלול באר עם מדיום בידול רענן. לחץ על כפתור ההפעלה במיקרוסקופ, ונתח את התוצאות לאחר ארבע שעות. לאחר ניתוק האורגנואידים כפי שהוזכרו בטקסט, השליכו את הסופרנטנט.להשעות מחדש את התאים ב 80 מיקרוליטר של חיץ electroporation. בצינור של 1.5 מיליליטר, הכינו את הפלסמידים הדרושים לניסוי. מוסיפים את הפלסמידים לתאים, ומערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.הגדר את האלקטרופורטור עם הפרמטרים לדופק נקבוביות ודופק העברה. מניחים את התאים עם הפלסמידים בקובט אלקטרופורציה. מיד למדוד את ההתנגדות, אשר צריך להיות בין 0.3 אמפר ל 0.55 אמפר, אלקטרופורציה מיד.לאחר שתסיים, להעביר את התאים לצינור 1.5 מיליליטר, ולהוסיף 400 מיקרוליטר של חיץ אלקטרופורציה בתוספת מעכב Rho-kinase. אפשרו לתאים להתאושש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, גלולה את התאים ב 500g במשך חמש דקות.לאחר השלכת supernatant, צלחת את התאים ב 200 מיקרוליטר של ECM. לאחר התמצקות, הוסף את מדיום הרחבת העכבר. להכנת אורגנואידים, יש לפצל את אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית כשלושה ימים לפני יום ההשתלה.כדי לחלץ את האורגנואידים מה-ECM, הוסיפו דיספאס למדיום התרבית כדי להגיע לריכוז סופי של 0.125 יחידות למיליליטר, והשעו מחדש ביסודיות את טיפות ה-ECM כדי לשבש אותן באמצעות P1000. מחזירים את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. השהה מחדש את האורגנואידים ב -10 מיליליטר של מדיום הבסיס כדי לשטוף את האנזים.לאחר הטלת התאים על 400 גרם במשך חמש דקות, להשעות אותם מחדש 50 מיקרוליטר של מדיום התפשטות אנושי קר בתוספת 5% ECM. מניחים את תרחיף האורגנואיד על קרח, וממשיכים מיד להשתלה. להשתלה אורתוטופית בעכברים, שאפו את תרחיף האורגנואיד במחט אינסולין.כאשר העכבר ישן, מקם אותו במהירות על צדו עם בלוטת הדמעות הראשית נגישה. הזריקו חמישה מיקרוליטרים של תרחיף האורגנואיד ישירות דרך העור לתוך בלוטת הדמעות. אפשר לעכבר להתאושש, ולהעריך את נוכחותה של כל אי נוחות הקשורה להשתלה מדי יום, במיוחד בעין.בעקבות הדיסקציה של בלוטת הדמעות של העכבר, העיכול האנזימטי והמכני יצר שברי רקמות קטנים, כולל האסיני והצינורות. בגזירה המוצלחת של אורגנואיד בלוטת הדמעות בעכבר, נמצאו אורגנואידים ציסטיים בקוטר של כ-500 מיקרומטר לאחר שבעה ימים. אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית גדלו כציסטות תוך שלושה עד ארבעה ימים והגיעו לגודל מלא תוך 10 עד 14 ימים לאחר בידוד הרקמות.לאחר חמישה ימים ושבעה ימים, בהתאמה, במדיום ההבחנה, אורגנואידים של העכבר ובלוטת הדמעות האנושית נעשו צפופים יותר. מריחת מפעיל AMP מחזורי פורסקולין או המוליך העצבי נוראפינפרין הביאה לנפיחות אורגנואיד תוך פחות משלוש שעות. בהתחשמלות מוצלחת צמחו אורגנואידים עמידים להיגרומיצין.שיבוטי האורגנואידים הגדלים הגדולים מ-300 מיקרומטר נקטפו לפני ההתמיינות שלהם. הגברה PCR של מוקד Pax6 הממוקד על ידי RNA מנחה הניבה רצועת זוג בסיס 367 עבור כל השיבוטים שנבחרו. שיבוט הומוזיגוטי אחד של בלוטת הדמעות של עכבר הנוקאאוט מתוך שישה רצפים התקבל באמצעות הרנ"א המנחה המכוון ל-Pax6.חלק מהשיבוטים גדלו היטב, אך חלק משיבוטי האורגנואידים אבדו לאחר הקטיף או החלו להתביין. מתוך 10 שיבוטים אורגנואידים שנבחרו, שבעה צמחו היטב. קליטת אורגנואידים אושרה חודש לאחר הזרקת האורגנואידים לבלוטת הדמעות של העכבר על ידי צביעה לסמן ספציפי לאדם, האנטיגן הגרעין האנושי.דבר אחד שיש לשים לב אליו הוא לא לעכל יתר על המידה את הרקמה, וגם לא את האורגנואידים. אחרת, התאים עלולים למות, וזה יפחית את קצב ההתבססות האורגנואידים. אורגנואידים בלוטת הדמעות ניתן לנתח על ידי היסטולוגיה.על ידי כך, ניתן לקבל תובנה בהרכב התאי שלהם.

establishment-maintenance-differentiation-genetic-manipulation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בלוטת הדמעות (LG) היא איבר הסתעפות שמייצר את הרכיבים מימיים של דמעות הכרחיות לשמירה על חזון ועל בריאות העין. כאן אנו מתארים עכברי נתיחת LG ולשעבר טכניקות תרבות vivo לפענח מסלולי איתות מעורבים בפיתוח LG.

המניפולציה Murine דמעות בלוטת

בלוטת lacrimal (LG) יש שני סוגי תאים המבטא α-השריר החלקה אקטין (αSMA): מיואפיתל תאים (mecs) ו קרום הלב. MECs הם של מוצא העורי, נמצא ברקמות הבלוטות רבות, בעוד קרום הלב הם תאים שריר וסקולריים חלקה של מקור אנדועורי. פרוטוקול זה מבודד מנות וכלי קרום.

בידוד של תאים מיואפיתל מתוך למבוגרים מורנה לקטמל בלוטות הלסת

בלוטת החלב היא מבנה מחודד, המורכב מיואפיתל חיצוני ותאי אפיתל הפנים הפנימיים. המוצג הוא פרוטוקול להכין אורגנואידים. באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית שיטה יעילה זו מאפשרת לחוקרים לטפל באופן נפרד בשני סוגי תאים אלה כדי לחקור שאלות הנוגעות לתפקידם בצורת בלוטת החלב ובתפקוד.

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

מערכת תרבות אורגנויד חוץ גופית חוץ גופית ארוכת טווח הוקמה מהפטוציטים של עכברים. אורגנוידים אלה ניתן לעבור מניפולציה גנטית על ידי זיהום lentivirus של בנייה shRNA / חוץ רחמי, transfection siRNA והנדסת CRISPR-Cas9.

מניפולציה ממסדית וגנטית של אורגנוידים של מורין הפטוציט

שיטת התרבית התלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת דמעה בוגרת (LG) מבוססת היטב על אינדוקציה של היווצרות והתמיינות של אורגנואידים LG לתאים דמויי אצינר או צינור.

מערכת תרבית תלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת הדמעות

כאן, אנו מציגים שיטה לבסס מודל עכברי של עין יבשה חסרה מימית על ידי כריתת בלוטות הדמעות החוץ-אורביטליות והאינפרא-אורביטליות ולהעריך את השינויים במשטח העין בעין יבשה חסרה במימית.

הקמת מודל עכבר של עין יבשה במחסור מימי

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

פרוטוקול זה מדגים כיצד לשמור על בריאות, מובחן האדם גזע עובריים (ES) התאים.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Myocytes לב למבוגרים הם תאים ראשוניים, כי יכול להיות מבודד לבבות בעלי חיים מתורבתים במשך כמה ימים. במהלך תקופה זו תרבות העברת גנים adenoviral ניתן להשתמש בהם כדי להביע biosensors מקודדים גנטית (GEBs) או חלבונים היתוך ניאון. שתי הגישות לאפשר חקירות הסלולר באמצעות מיקרוסקופיה confocal.

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

טכניקה גנטית כדי לתמרן בתוך כל תאי...

שינוי ורקומבינציה גנטי של תרבויות איברי בלוטות רוק

למדו כיצד להקים ולתחזק אורגנואידים של בלוטת הדמעות מעכברים ובני אדם. השיטה כוללת עיכול רקמה, בידול תאים ומניפולציה גנטית באמצעות אלקטרופורציה.

הקמה, תחזוקה, בידול, מניפולציה גנטית והשתלה של אורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית

גלה סרטונים נוספים