הקמה, תחזוקה, בידול, מניפולציה גנטית והשתלה של אורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית

עם אורגנואידים של בלוטת הדמעות, ניתן לבדוק כיצד גנים מסוימים שולטים בהומאוסטזיס של בלוטת הדמעות. בנוסף, ניתן להשתמש באורגנואידים לרפואה רגנרטיבית. היתרון העיקרי של טכנולוגיית אורגנואיד בלוטת הדמעות שמקורה בתאי גזע בוגרים הוא שהיא מאפשרת צמיחה ולימוד של תאי אפיתל בריאים ולא מותמרים של בלוטת הדמעות.

אורגנואידים אלה יכולים לשמש בסופו של דבר לטיפול בחולים עם מחלת עין יבשה. התחל בהכנת המדיום והחומר הדרושים לניסוי, ולאחר מכן שלב את כל מרכיבי מדיום העיכול לפני הניסוי. הרטיבו מראש את האזמלים בתווך זה כדי למנוע חתיכות רקמה להידבק אליהם.

שלפו את רקמת בלוטת הדמעות של העכבר מהמדיום, הניחו אותה בצלחת הפטרי וטחנו אותה בעזרת אזמלים שהורטבו מראש. ברגע שחתיכות הרקמה הן פחות מ -0.5 מילימטרים מעוקבים, מגרדים אותם מצלחת הפטרי עם האזמל, ומעבירים אותם לצינור של 15 מיליליטר המכיל את מדיום העיכול. עבור ביופסיה אנושית קטנה מאוד, מניחים אותה ישירות במדיום העיכול ללא טחינה.

לדגור על צינור 15 מיליליטר שיש חתיכות רקמה עד 15 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. בינתיים, צרים קצה פיפטה של פסטר בלהבה, והרטיבו אותו מראש בתווך הבסיס. כדי להקל על תהליך הדיסוציאציה, פיפטה את התערובת הטחונה למעלה ולמטה כל חמש דקות עם פיפטת פסטר רטובה מראש וצרה.

כאשר תאים בודדים רבים וגושים קטנים נראים מתחת למיקרוסקופ, עצרו את הדיסוציאציה על ידי הוספת 10 מיליליטר של תווך הבסיס. לאחר סיבוב במשקל של 400 גרם במשך חמש דקות, מסירים את הסופרנטנט, ומרחפים מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר ממדיום הבסיס כדי לחזור על השטיפה והגלולה במורד התאים. הסר את חתיכות הרקמה הגדולות והלא מעוכלות ואת סיבי הקולגן הנותרים על ידי סינון התערובת הטחונה דרך מסננת של 70 מיקרומטר.

סובבו את הפולט במשקל של 400 גרם למשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של מטריצה חוץ-תאית קרה, או ECM, עבור בלוטת דמעות עכבר בודדת ו-50 מיקרוליטר של ECM קר עבור ביופסיה אנושית, מבלי ליצור את הבועות. זרעו עד 100 מיקרוליטר תאים לכל באר של צלחת תרחיף של 12 בארות באמצעות P200 כדי ליצור טיפות של כ -20 מיקרוליטר בבאר.

הניחו את הצלחת הפוכה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות כדי לאפשר התמצקות ECM. לאחר מיצוק ה-ECM, הוסף כמיליליטר אחד של מדיום הרחבת עכבר בטמפרטורת החדר לכל באר של צלחת בעלת 12 בארות. מכינים טרייה מיליליטר אחד של מדיום התמיינות אנושי המכיל רכיבים בודדים הגורמים להפרשה על ידי אורגנואידים של בלוטת הדמעות.

במיקרוסקופ אוטומטי של קיטועי זמן של שדה בהיר, הגדר את המיקומים לצילום בלוח, את מרווח הזמן של חמש דקות ואת משך הזמן של ארבע שעות. ודא שטיפת ECM שלמה גלויה בכל מיקום. לפני תחילת הצילום, הסר את מדיום התרבית מהבארות שיש לצלם מבלי להזיז את הצלחת מהמיקרוסקופ, והחלף אותו במדיום התמיינות אנושי טרי שהוכן מחדש היטב המכיל תרכובות, כולל פורסקולין ונוראדרנלין.

כבקרה שלילית, כלול באר עם מדיום בידול רענן. לחץ על כפתור ההפעלה במיקרוסקופ, ונתח את התוצאות לאחר ארבע שעות. לאחר ניתוק האורגנואידים כפי שהוזכרו בטקסט, השליכו את הסופרנטנט.

להשעות מחדש את התאים ב 80 מיקרוליטר של חיץ electroporation. בצינור של 1.5 מיליליטר, הכינו את הפלסמידים הדרושים לניסוי. מוסיפים את הפלסמידים לתאים, ומערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

הגדר את האלקטרופורטור עם הפרמטרים לדופק נקבוביות ודופק העברה. מניחים את התאים עם הפלסמידים בקובט אלקטרופורציה. מיד למדוד את ההתנגדות, אשר צריך להיות בין 0.3 אמפר ל 0.55 אמפר, אלקטרופורציה מיד.

לאחר שתסיים, להעביר את התאים לצינור 1.5 מיליליטר, ולהוסיף 400 מיקרוליטר של חיץ אלקטרופורציה בתוספת מעכב Rho-kinase. אפשרו לתאים להתאושש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, גלולה את התאים ב 500g במשך חמש דקות.

לאחר השלכת supernatant, צלחת את התאים ב 200 מיקרוליטר של ECM. לאחר התמצקות, הוסף את מדיום הרחבת העכבר. להכנת אורגנואידים, יש לפצל את אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית כשלושה ימים לפני יום ההשתלה.

כדי לחלץ את האורגנואידים מה-ECM, הוסיפו דיספאס למדיום התרבית כדי להגיע לריכוז סופי של 0.125 יחידות למיליליטר, והשעו מחדש ביסודיות את טיפות ה-ECM כדי לשבש אותן באמצעות P1000. מחזירים את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. השהה מחדש את האורגנואידים ב -10 מיליליטר של מדיום הבסיס כדי לשטוף את האנזים.

לאחר הטלת התאים על 400 גרם במשך חמש דקות, להשעות אותם מחדש 50 מיקרוליטר של מדיום התפשטות אנושי קר בתוספת 5% ECM. מניחים את תרחיף האורגנואיד על קרח, וממשיכים מיד להשתלה. להשתלה אורתוטופית בעכברים, שאפו את תרחיף האורגנואיד במחט אינסולין.

כאשר העכבר ישן, מקם אותו במהירות על צדו עם בלוטת הדמעות הראשית נגישה. הזריקו חמישה מיקרוליטרים של תרחיף האורגנואיד ישירות דרך העור לתוך בלוטת הדמעות. אפשר לעכבר להתאושש, ולהעריך את נוכחותה של כל אי נוחות הקשורה להשתלה מדי יום, במיוחד בעין.

בעקבות הדיסקציה של בלוטת הדמעות של העכבר, העיכול האנזימטי והמכני יצר שברי רקמות קטנים, כולל האסיני והצינורות. בגזירה המוצלחת של אורגנואיד בלוטת הדמעות בעכבר, נמצאו אורגנואידים ציסטיים בקוטר של כ-500 מיקרומטר לאחר שבעה ימים. אורגנואידים של בלוטת הדמעות האנושית גדלו כציסטות תוך שלושה עד ארבעה ימים והגיעו לגודל מלא תוך 10 עד 14 ימים לאחר בידוד הרקמות.

לאחר חמישה ימים ושבעה ימים, בהתאמה, במדיום ההבחנה, אורגנואידים של העכבר ובלוטת הדמעות האנושית נעשו צפופים יותר. מריחת מפעיל AMP מחזורי פורסקולין או המוליך העצבי נוראפינפרין הביאה לנפיחות אורגנואיד תוך פחות משלוש שעות. בהתחשמלות מוצלחת צמחו אורגנואידים עמידים להיגרומיצין.

שיבוטי האורגנואידים הגדלים הגדולים מ-300 מיקרומטר נקטפו לפני ההתמיינות שלהם. הגברה PCR של מוקד Pax6 הממוקד על ידי RNA מנחה הניבה רצועת זוג בסיס 367 עבור כל השיבוטים שנבחרו. שיבוט הומוזיגוטי אחד של בלוטת הדמעות של עכבר הנוקאאוט מתוך שישה רצפים התקבל באמצעות הרנ"א המנחה המכוון ל-Pax6.

חלק מהשיבוטים גדלו היטב, אך חלק משיבוטי האורגנואידים אבדו לאחר הקטיף או החלו להתביין. מתוך 10 שיבוטים אורגנואידים שנבחרו, שבעה צמחו היטב. קליטת אורגנואידים אושרה חודש לאחר הזרקת האורגנואידים לבלוטת הדמעות של העכבר על ידי צביעה לסמן ספציפי לאדם, האנטיגן הגרעין האנושי.

דבר אחד שיש לשים לב אליו הוא לא לעכל יתר על המידה את הרקמה, וגם לא את האורגנואידים. אחרת, התאים עלולים למות, וזה יפחית את קצב ההתבססות האורגנואידים. אורגנואידים בלוטת הדמעות ניתן לנתח על ידי היסטולוגיה.

על ידי כך, ניתן לקבל תובנה בהרכב התאי שלהם.