הדמיה של אברונים באתרם על ידי טומוגרפיה Cryo-STEM

טומוגרפיית TEM נמצאת בשימוש נרחב להדמיית תאים, אך היא מוגבלת מאוד מבחינת עובי הדגימה. FIB SEM וטומוגרפיית רנטגן רכה יכולים לשמש לדגימות גדולות יותר, אם כי ברזולוציה נמוכה יותר. טומוגרפיית STEM ממלאת את הפער הזה בצורה מושלמת.

טומוגרפיית STEM מספקת מבט על דגימות בעובי מיקרון ברזולוציה של ננומטרים ספורים. השילוב עם הכנה קריוגנית מאפשר לנו להסתכל על דגימות ביולוגיות ומקטעים בתלת-ממד. סקור את היסודות של אופטיקת STEM כדי להבין את היווצרות התמונה ולוודא שמהנדס השירות יישר היטב את מצבי הגזע והגזע של Lomax, וששלבי הכיול נראים כמו אלה שבסרטון.

כדי להתחיל, טען את קובץ יישור העמודות ופתח את ערכי העמודות. אם אתה משתמש במחזיק cryo לכניסה צדדית, פתח את מגן ה- cryo והתחל במצב TEM. הקרן אמורה להופיע על המסך.

הנמיכו את ההגדלה אם הקרן אינה מופיעה. הביאו את המיקרוסקופ למיקוד אאוצנטרי על ידי לחיצה על הכפתור בלוח הבקרה. הגדר את גודל הספוט לערך נוח להצגה חזותית ישירה של מסך הפלואורסצנט, או באמצעות המצלמה המובנית.

הגדר את המיקרוסקופ למצב STEM וודא שהמיקוד משתמש בעדשות המעבה ולא במטרה. בלוח, הגדר מיקוד אאוצנטרי וצא ממצב עקיפה לצורך התאמות ראשוניות. ודא שהקרן אינה ריקה והפחת את ההגדלה עד להופעת הקרן על המסך.

התאם את הסטת הקרן למרכז והגדל את ההגדלה בצעדים עד 70, 000, תוך שמירה על הקרן במרכז. לאחר מכן הכנס את מפתח הצמצם הרצוי, בדרך כלל 50 מיקרומטר למצב בדיקת מיקרו, ובדוק את מרכוז הצמצם. בעת סיבוב ידית הפוקוס קדימה ואחורה, הכתם אמור להתרחב ולהתכווץ, אך להישאר במקומו, כאילו מטוס חותך שעון חול אנכי דמיוני.

אם הצמצם אינו ממורכז, התאורה תזוז לרוחב כאילו שעון החול מוטה. הבא את הקרן למיקוד, לחץ על מיקוד רשימת העוצמה בכרטיסיה יישור או חזור למיקוד אאוצנטרי. התאם מחדש את מיקום הקרן למרכז וכוונן את מרכז הסיבוב.

כעת, סובב את גלגל צעד המיקוד למינימום, או צעד אחד מעל, כך שהקרן פועמת בעדינות וודא שהיא נשארת נייחת כאשר המיקוד נע למעלה ולמטה. בחר את נקודות הציר ושלב את שתי הנקודות באמצעות התאמות X ו- Y. התאימו את סטיגמטי המעבה כדי להפוך את הקרן לעגולה.

עלה וירד באמצעות מיקוד כדי למטב. לא צריכה להיות נטייה להתארך בכיוון זה או אחר כאשר עוברים דרך מיקוד. נרמלו את העדשות, ולאחר מכן הגדילו את ההגדלה בהדרגה לכ- 240,000, תוך שימוש בהיסט הקרן כדי לשמור על המקום ממורכז וחזרו על התאמות מרכז הסיבוב ונקודת הציר.

חזור למצב עקיפה. בשלב זה, הקרן אמורה להופיע כדיסק אחיד על מסך הפלואורסצנט. אורך המצלמה שולט כעת למעשה במרחק האופטי לגלאי כקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן.

שנו אותו וצפו כיצד הדיסק מתכווץ ומתרחב כאילו מיקום המסך נע לכיוון הדגימה או מתרחק ממנה. חרוט זה מייצג את תאורת השדה הבהיר. כדי להפעיל מצב STEM בהגדלה גבוהה, התחל עם גלאי גזע שדה בהיר וכוונן את יישור העקיפה למרכז הקרן באמצעות אורך המצלמה הרצוי.

הפעל את סימון שדה הבהירות על המסך, הקטן את אורך המצלמה ל -330, הרם את המסך והכנס את הגלאים. התחל סריקה בתוכנת המיקרוסקופ. השתמש בתצוגת הטווח כדי לסייע בעת התאמת הגדרות הבהירות והניגודיות כמתואר בכתב היד.

חזור על ההתאמה מספר פעמים. החזר את המיקרוסקופ להגדלה נמוכה יחסית באוגר ההגדלה הגבוהה, מבלי להיכנס למצב הגדלה נמוכה. הכנס את המסך הפלואורסצנטי ורשום את המסך הנוכחי לעיון.

כמו ב- TEM, ניתן לשנות את הזרם באמצעות עדשת האקדח והגדרות גודל הספוט עם מספרים הולכים וגדלים המתאימים לזרם מופחת. בשלב זה, שמור אוגר FEG כדי להקל על החזרה לערכים סטנדרטיים. עבור למצב LMTEM כדי לראות את הדגימה.

הכנס את הדגימה. הביאו את הדגימה לגובה אאוצנטרי. ישנן מספר שיטות לעשות זאת.

לדוגמה, השתמשו בנדנוד הבמה להטיית הרשת תוך הזזת גובה הדגימה לאורך ציר Z עד שהתמונה תפסיק לזוז לרוחב. לחלופין, סמן תכונות מסוימות במסך הצפייה והטה את הבמה ל -10 עד 30 מעלות. התכונה תנוע לרוחב.

התאימו את גובה הדגימה כדי להחזיר אותה למיקומה המקורי. הגדל את ההגדלה או את הטיית הבמה כדי לעדן ולהחזיר את ההטיה לאפס מעלות. כעת חזור למצב STEM והכנס את גלאי STEM.

ודא שהאפשרות הפעל סריקת LM אינה מסומנת. עבור למצב ההגדלה הגבוהה הנמוכה ביותר. כוונן את אסטיגמציה מעובה על ידי השיטה.

כאשר הקרן נמצאת מעל אזור דגימה דק, התמקדו בנקודה שבה הקרן המשודרת מתפוצצת בין תמונות הצל של הדגימה משני הצדדים. לאחר מכן כוונן את כוונון המעבה כדי להפוך את הדיסק המרכזי לעגול. זה דורש קצת תרגול, במיוחד עבור דגימות קריוגניות.

חזור לצמצם של 50 מיקרומטר ועדכן את אוגר FEG. עבור למצב LMSTEM והמשך לסרוק כדי למצוא אזור מעניין. במידת הצורך, התאימו מחדש את בהירות הגלאי ואת הגדרות הניגודיות בערך בשלב זה.

לחץ על מיקוד אאוצנטרי, הגדל את ההגדלה וחדד את המיקוד תוך כדי סריקה באמצעות לולאת המיקוד המסופקת על ידי המיקרוסקופ ובדוק את האסטיגמציה על חרוזי זהב. עד כה, הכל מבוצע במצב nano probe. שימו לב שהכנסת מפתח צמצם קטן יותר מקטינה את זווית ההתכנסות למחצה, דבר המועיל לדגימות עבות.

גישה חלופית עם מכשירי TFS היא לעבור למצב בדיקה מיקרו, מה שמוביל לזווית התכנסות למחצה מופחתת. לאחר מכן, התאם את אורך המצלמה כדי שזווית האיסוף תהיה גדולה פי שלושה מזווית ההתכנסות; כלומר, סימוני השטח של גלאי BF על המסך גדולים בערך פי שלושה מהקרן.

הערך את המינון להקלטה באמצעות משוואה. ככלל אצבע, יש לכוון בין 100 ל-150 אלקטרונים לכל דיוקסטרום ריבועי עבור כל הטומוגרף. החזירו את הבמה לשלמה וכווננו את זרם הקרן באמצעות גודל ספוט או הגדרות עדשת אקדח כדי להגיע לזרם המסך הרצוי.

מפת רשת מלאה בהגדלה נמוכה שהוקלטה במצב STEM מציגה את האזורים עם התאים המעניינים. התאים נראים בהירים חלקית עם אלקטרונים המפוזרים לכיוון גלאי HAADF. מפה ברזולוציה בינונית שהוקלטה במצב STEM הציגה שתי מפות עוגן ברזולוציה בינונית.

הטיה של אפס מעלות של סדרת הטיית גזע אפשרה הדמיה של מרבצי סידן פוספט, קריסטה וסמני זהב של מיטוכונדריה. מוצג עיבוד נפח של 60 ננומטר וקטעים בעובי 40 ננומטר. טומוגרפיית גזע Cryo, או CSTET, מספקת גשר בין ביולוגיה מבנית וביולוגיה של התא, כמו גם הקשר לפלואורסצנטיות ברזולוציית על.

ללא צורך בחתך או הכנת למלה, אנו יכולים לראות את כל הזירה הסלולרית במצב כמעט ילידי.