Name: קביעת יחסי תאימות עצמית (In) ותאימות בין (In) בהדרים באמצעות האבקה ידנית, מיקרוסקופיה וניתוח גנוטיפ S (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: למד לזהות תאימות אבקה ואי-תאימות עצמית במיני הדרים באמצעות מיקרוסקופיה וניתוח גנוטיפ S. שיטה זו מאפשרת לבוחרים לבחור עצי מאביק מתאימים לשיפור פריון והצלחת הרבייה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32122075, 32072523).

1. הכנה לצביעת כחול אנילין
<ol><li>הכינו את הריאגנטים והכלים הבאים לניסוי: מברשת מאביקים, פינצטה, עיפרון, נייר סולפט, שקית האבקה, שקיות נעילת רוכסן, אטבי נייר, פורמלדהיד, חומצה אצטית קרחונית, אתנול מוחלט, צינורות צנטריפוגה, מלקחיים, טפטפות דבק, שקופיות זכוכית, כיסויים, אזמלים ופוליאתילן גליקול.</li>
	<li>יש להכין אמצעי נביטה במבחנה המכיל 0.02% MgSO4, 0.01% KNO 3, 0.03% Ca(NO 3)2, 0.01% H 3 BO 3, 20% PEG-4000 ו-15% סוכרוז. התאם את ה- pH ל- 6.0-6.2 עם KOH. השתמשו במערבל מגנטי מכיוון שקשה להמיס PEG-4,000.</li>
	<li>הכינו את התמיסה המקבעת של קרנוי, שהיא אתנול מוחלט וחומצה אצטית קרחונית מעורבבים ביחס של 3:1. הכינו תמיסת קיבוע FAA, שהיא 40% פורמלדהיד, 80% אתנול וחומצה אצטית קרחונית (1:8:1). הכינו 4 M נתרן הידרוקסידי (NaOH) ותמיסה כחולה אנילין, שהיא 0.1% כחול אנילין ב 0.1 M K3PO4. השתמש בבקבוק ענבר כדי לאחסן את תמיסת כחול אנילין מכיוון שהיא רגישה לאור.</li>
</ol>2. איסוף אבקה
<ol><li>דע מראש את תקופת הפריחה של עצי הניסוי (Ma jia pummelo במחקר זה). אספו פרחים בוגרים שלא נפתחו מתחילת תקופת הפריחה ועד לשלב שיא הפריחה, והכניסו אותם לשקית עם רוכסן. את הפרחים ניתן לאחסן ב 4 ° C במקרר במשך 24 שעות.</li>
	<li>קחו את הפרחים למעבדה. השתמשו בפינצטה כדי לאסוף את האנתרים, והניחו אותם בכלי פטרי המכיל נייר פילטר. לאסוף anthers מ 20 עד 30 פרחים.</li>
	<li>הכניסו את צלחת הפטרי המכילה את האנתרים לתנור בטמפרטורה של 28 מעלות למשך 24 שעות עד שגרגרי האבקה יתייבשו. על ארגון הפרחים המפורט, ראו Hu et al.9.</li>
	<li>הכניסו את האבקה המיובשת לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. שמור את האבקה בשקית נעילת רוכסן אטומה המכילה ג'ל סיליקה משנה צבע (חומר מייבש). סגרו את השקית ותייגו את השקית בשם זן האבקה ותאריך האחסון. את האבקה המיובשת ניתן לאחסן במקרר בטמפרטורה של 20°C למשך 96 שבועות16.</li>
</ol>3. בדיקת נביטת אבקה חוץ גופית 
<ol><li>יוצקים 300 μL של מדיום נוזלי לתוך צלחת תרבית תאים או מכסה של צינור צנטריפוגה 2 מ"ל, ומפזרים את האבקה באופן שווה בעזרת מברשת האבקה. לדגור את האבקה ב 28 ° C בסביבה חשוכה לח במשך 12 שעות.</li>
	<li>הסר את 1 המ"מ העליונים של קצה פיפטה 1,000 μL. השתמש פיפטה כדי לספוג את האבקה עם כמות קטנה של תמיסת תרבית ולהעביר אותו למרכז שקופית המיקרוסקופ. כסו אותו בכיסוי. התבונן בדגימה במיקרוסקופ הפוך באמצעות מטרה של 10x.</li>
	<li>בצע שלושה שכפולים עצמאיים תוך שימוש בערך באותה צפיפות אבקה עבור כל שכפול17. נהלו ויזואלית את כמות האבקה, וודאו שכל צלחת הפטרי מכוסה באבקה ושבכל צלחת פטרי יש כמות כמעט שווה של אבקה.</li>
	<li>האבקה הנבטה מייצרת צינור אבקה שאורכו ככפול מקוטרו. חשב את קצב הנביטה מ -20 שדות חזותיים, אשר נותן את אחוז האבקה הנבטה בכל שדות האבקה.</li>
</ol>4. האבקה
<ol><li>בחרו יום שמש ללא רוח להאבקה. בחרו 10 ניצנים מפותחים שעומדים להיפתח, קלפו את עלי הכותרת בזהירות והקפידו לא לחבול בהם.</li>
	<li>השתמשו במברשת האבקה כדי לפזר כמות מספקת של אבקה בת קיימא על פני השטח של הצלקת, והיזהרו לא לפגוע בפיסטיל. להאבקה עצמית, השתמשו באבקה מאותו צמח/זן. לצורך האבקה צולבת, השתמשו באבקה מצמח בעל גנוטיפ שונה.</li>
	<li>מכסים את הפרחים המואבקים בשקית נייר סולפט. השתמשו באטב נייר כדי לאטום את השקית ולמנוע האבקה על ידי אבקנים מובחנים מבחינה גנוטיפית.</li>
	<li>כתוב את שם המין ואת מספר וזמן ההאבקה על התווית. תלו את התווית על הענפים ליד הפרחים המואבקים.</li>
</ol>5. דגימה, קיבוע ושימור
<ol><li>מוציאים את שקיות ההאבקה כ-3-4 ימים לאחר ההאבקה, ואוספים את הפרחים המואבקים בשקיות רוכסן.</li>
	<li>הסירו מיד את עלי הכותרת, כלי הקיבול והשחלות מהפרחים, וטבלו את הצלקות המאוחות לסגנונות בצינור צנטריפוגה המכיל תמיסה מקובעת שזה עתה הוכנה. לדגור את הסטיגמות והסגנונות בתמיסה המקובעת לילה ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>למחרת, השליכו את התמיסה המקבעת, ושטפו את הסטיגמות והסגנונות פעמיים-שלוש באתנול 95%.</li>
	<li>העבירו את הסגנונות לתמיסת אתנול 70%. ודא כי הדגימה שקועה לחלוטין בתמיסה. הסגנונות בשלב זה ניתן לאחסן ב 4 ° C במשך 1-2 חודשים.</li>
</ol>6. כתם כחול אנילין
<ol><li>שטפו את דגימות הסגנון המאוחסנות באתנול 70% במים מזוקקים שלוש עד ארבע פעמים. יש לטבול בתמיסת NaOH באורך 4 מ', לאטום ולדגור באמבט מים בטמפרטורה של 65°C למשך 60 דקות. במהלך שלב זה, צבע הסגנון משתנה מצהוב-לבן לכתום-אדום.</li>
	<li>משרים את הסגנונות במים מזוקקים למשך 30 דקות. השליכו את המים המזוקקים, ושטפו את הסגנונות במים מזוקקים שלוש עד ארבע פעמים או עד שצבע הסגנון הופך לצהוב.</li>
	<li>מניחים את הדגימה בצינור של 10 מ"ל, מוסיפים את כחול האנילין עד לטבילה של הדגימה, וצובעים במשך 12 שעות בחושך.</li>
	<li>התבונן בצמיחת צינור האבקה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
</ol>7. מיקרוסקופ פלואורסצנטי
<ol><li>לפני התבוננות בדגימות, הניחו את השקופית על שולחן שטוח והוסיפו שתיים עד שלוש טיפות פוליאתילן גליקול לפני השטח של השקופית.</li>
	<li>לשטוף את הסגנון כדי להיות נצפה עם מים מזוקקים. השתמש באזמל כדי לחלק אותו לשני חצאים לאורך ציר האורך. הניחו מחצית מהסגנון על מגלשת הזכוכית, וכסו בכיסוי.</li>
	<li>הניחו את השקופית על במת המיקרוסקופ מעל הצמצם, ודמיינו באמצעות מטרה של 10x. השתמש במסנן DAPI (עירור: 325-375 ננומטר; פליטה: 435-485 ננומטר). שימו לב לחמישה סגנונות לכל סוג האבקה. שימו לב לצמיחת צינור האבקה.</li>
</ol>8. זיהוי גנוטיפ S מבוסס PCR
<ol><li>חלצו את הדנ"א הגנומי מדגימת הסטיגמה בשיטת CTAB18.<ol><li>הכניסו את העלים שנאספו לצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל, והקפיאו בחנקן נוזלי. הכינו HCl:EDTA:NaCl:H2O חוצץ ביחס של 1:1:3:5 ותערובת אלכוהול איזואמיל כלורופורם ביחס של 24:1</li>
		<li>הוסף 10 מ"ל של חיץ מוכן, 0.2 גרם של CTAB, ו 200 μL של mercaptoethanol צינור צנטריפוגה 50 מ"ל, ולשים אותם באמבט מים ב 65 ° C במשך 5 דקות עד הפתרון הופך ברור ושקוף.</li>
		<li>מכניסים את הלהבים למכתש, מוסיפים את הדגימות הקפואות, מוסיפים חנקן נוזלי וטוחנים. הכניסו את דגימת הקרקע לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל, הוסיפו 600 מיקרוליטר של תערובת CTAB, הכניסו אותה לאמבט מים בטמפרטורה של 65°C למשך 60 דקות, וערבבו אותה הפוכה כל 30 דקות.</li>
		<li>מוסיפים 700 μL של תערובת אלכוהול איזואמיל כלורופורם (24:1), ומערבבים הפוך במשך 10 דקות. צנטריפוגה ב-24°C ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות, פיפטה הסופר-נטנט והעברה לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.</li>
		<li>מוסיפים 60 μL של תמיסת NaCl 5 M ו-1 מ"ל אתנול מוחלט, ומערבבים הפוך. יש להקפיא בטמפרטורה של -20°C למשך 30 דקות, ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 24°C ו-9,000 x g למשך 5 דקות.</li>
		<li>יש להשליך את הסופרנטנט, להוסיף 1 מ"ל של תמיסת אתנול 70% ולהשאיר בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות. צנטריפוגה בטמפרטורה של 24°C, 9,000 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט, שאפו את תמיסת האתנול העודפת וייבשו באוויר למשך 5 דקות.</li>
		<li>הוסיפו 100 מיקרוליטר מים סטריליים להתמוססות, מדדו את ריכוז הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר והקפיאו במקפיא של -4°C לאחסון לטווח ארוך.</li>
		<li>הגדר את מערכת התגובה RT-PCR. הכינו את תערובת התגובה הבאה עבור 10 μL המכיל 5 μL של 2x PCRMix, 0.25 μL כל אחד של פריימר קדימה ואחורה, 1 μL של DNA (100 ng/ μL), ו 3.5 μL של H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>הגדר את תוכנית ה- PCR לפי טבלה 1. תוכנית ה- PCR עבור כל האיזופורמים הייתה 95 ° C במשך 5 דקות 32x (95 ° C עבור 30 שניות, 55 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 1 דקה) ו 72 ° C במשך 5 דקות. יש להפריד את המוצרים על 1.5% ג'ל TAE-agarose ולצלם9. אמת את גנוטיפ S שצוין באמצעות DNA גנומי.</li>
</ol>

<ol><li>Matsumoto, D., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+S-RNases+by+an+S+locus+F-box+like+protein+and+an+S+haplotype-specific+F-box+like+protein+in+the+Prunus-specific+self-incompatibility+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system.</a> Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).</li>
<li>Goldberg, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+selection+maintains+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Species selection maintains self-incompatibility.</a> Science. 330 (6003), 493-495 (2010).</li>
<li>Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+fruit+quality+of+Guangfeng+Ma+jia+pummelo+and+Pinghe+red+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22China+Agricultural+Science+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo.</a> China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).</li>
<li>Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+on+self-incompatibility+mechanism+in+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees.</a> Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).</li>
<li>Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-self-+and+self-recognition+models+in+plant+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility.</a> Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).</li>
<li>Meng, X., Sun, P., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-RNase-based+self-incompatibility+in+Petunia+inflata%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata.</a> Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+self-compatibility+by+a+mutant+Sm-RNase+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus.</a> Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).</li>
<li>Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-incompatibility+triggers+programmed+cell+death+in+Papaver+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen.</a> Nature. 429, 305-309 (2004).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulated+expression+of+S2-RNase+attenuates+self-incompatibility+in+%26%2334%3BGuiyou+No.+1%26%2334%3B+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in &#34;Guiyou No. 1&#34; pummelo.</a> Horticulture Research. 8 (1), 199(2021).</li>
<li>Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+selection+in+self-compatible+wild+tobacco+results+from+coordinated+variation+in+homologous+self-Incompatibility+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes.</a> Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).</li>
<li>Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+S-locus+F-box+proteins+of+petunia+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility+are+themselves+subject+to+ubiquitin-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation.</a> The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).</li>
<li>Hua, Z., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+components+of+a+putative+petunia+S-locus+F-box-containing+E3+ligase+complex+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility.</a> Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).</li>
<li>Entani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-proteasome-mediated+degradation+of+S-RNase+in+a+solanaceous+cross-compatibility+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction.</a> The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).</li>
<li>Abdallah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+self-incompatibility+and+genetic+diversity+in+diploid+and+hexaploid+plum+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 896(2019).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+production+in+the+new+generation+of+apricot+cultivars%3A+self-incompatibility%2C+S-RNase+allele+identification%2C+and+incompatibility+group+assignment.+%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. </a> Frontiers in Plant Science. 9, 527(2018).</li>
<li>Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phalaenopsis+pollinia+storage+at+sub-zero+temperature+and+its+pollen+viability+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Studies%22%5BJournal%5D)">Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment.</a> Botanical Studies. 59 (1), 1(2018).</li>
<li>Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+evolution+of+genes+related+to+self-incompatibility+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus.</a> , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).</li>
<li>Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protocol+for+genomic+DNA+extraction+from+Citrus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+S-genotypes+of+63+pummelo+germplasm+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources.</a> Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).</li>
<li>de Nettancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incompatibility+in+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Incompatibility in angiosperms.</a> Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).</li>
<li>Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+self-incompatibility+and+its+evolutionary+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences.</a> International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).</li>
<li>Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+pollination+requirements+in+Japanese+plum+by+phenological+monitoring%2C+hand+pollinations%2C+fluorescence+microscopy+and+molecular+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61897(2020).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+self-+and+inter-%28in%29compatibility+relationships+in+apricot+combining+hand-pollination%2C+microscopy+and+genetic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60241(2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם מה לחשוף.

בגידולי פירות, הן parthenocarpy ו SI הן תכונות חשובות כי הם סוללים את הדרך פירות ללא זרעים - תכונה כי הוא מוערך מאוד על ידי הצרכנים. חוסר תאימות עצמית מקדם את דחיית האבקה העצמית, ובכך מונע רבייה20. בין הדרים, פומלו הוא זן שאינו תואם את עצמו7. כמעט 40% מכל מיני האנגיוספרם מציגים ת"י21. תכונה זו מונעת קיבוע פירות, מורידה את היבול ומביאה הפסדים כלכליים עצומים למגדלים. כדי לפתור בעיה זו, חקלאים כוללים עצים מאביקים ברחבי המטעים שלהם. עם זאת, בחירת עצים מא...

אי-תאימות עצמית (SI) היא מנגנון מבוקר גנטית הקיים בכ-40% ממיני האנגיוספרם. בתהליך זה, הפיסטיל דוחה אבקה מצמח בעל אותו גנוטיפ SI, ובכך מונע הפריה עצמית 1,2. Ma jia pummelo הוא זן מקומי במחוז ג'ינגסו שבסין, עם איכויות מצוינות של פירות גדולים ורודים, תכולת מיץ עשירה, טעם מתוק וחמוץ, וקליפה עבה3. למרות ש-SI מקדם יציאה החוצה, הוא משפיע לרעה על היבול והאיכות של פירות4 ומחייב עצים מאביקים מתאימים עם גנוטיפים SI מובהקים לשיעורי קיבוע פירות אמינים ותשואות גבוהות. כיום, ישנם שני סוגים עיקריים של SI, אי-תאימות עצמית ספורופיטית (SSI), המיוצגת על-ידי Brassicaceae, ואי-תאימות עצמית גמטופיטית (GSI), המיוצגת על-ידי Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae ו-Solanaceae 5,6,7,8.
פרי הדר הוא אחד מגידולי הפרי החשובים בעולם. מערכת GSI מבוססת S-RNase נמצאת בהדרים רבים ומשפיעה לרעה על קצב קיבוע הפירות9. במערכת זו, SI נשלט על ידי מוקד S, מוקד פולימורפי יחיד עם שני אללים מורכבים הנושאים דטרמיננטים פיסטיל S ודטרמיננטים אבקה S 7. הדטרמיננטה הנקבית היא S ribonuclease (S-RNase), והדטרמיננטה הגברית היא S locus F-box (SLF)7. תאי הפיסטיל מפרישים חלבוני S-RNase. חלבוני ה-S-RNases שאינם עצמיים מוכרים על ידי חלבוני SLF, מה שמוביל ליוביקוויטינציה ולפירוק של ה-S-RNases הלא-עצמיים על ידי מסלול פרוטאזום 26S. לעומת זאת, ה-S-RNases העצמיים מסוגלים לצבור ולעכב את צמיחת צינור האבקה (PT) מכיוון שהם חומקים מחלבוני SLF, ולכן נמנעים מהם יוביקוויטינציה10,11,12,13.
כאן, אנו מדווחים על טכניקת in vivo השימושית לזיהוי גנוטיפים מסוג S ודרגות של תאימות וחוסר תאימות אבקה. הפרוטוקול כולל חילוץ DNA כולל מעלים וחיזוי גנוטיפ S באמצעות פריימרים ספציפיים ל-S. יתר על כן, צביעה כחולה אנילין ומיקרוסקופ פלואורסצנטי ואחריו האבקה ידנית מספקים ראיות למידת התאימות וחוסר ההתאמה. הליך האבקה Semi in vivo, הכולל האבקה ידנית של פרחים במעבדה14,15, הותאם גם הוא להערכת דרגות התאימות העצמית ואי ההתאמה. עם זאת, השתמשנו גם בהאבקה בשדה ואחריה בשקיעת פרחים כדי למנוע זיהום מאבקה לא רצויה כדי לאפשר לצינורות האבקה להתפתח בתנאים טבעיים. פרוטוקול זה פשוט ופשוט ומספק את המידע הדרוש לבחירה מוצלחת של עצי מאביקים מתאימים.

<table><tbody><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>אנילין כחול</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית, H3BO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק חום</td><td>Labgic טכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סידן חנקתי tetrahydrate, Ca (NO3) 2</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>80029062</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגלי</td><td>Labgic טכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTAB</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>57-09-0 (CAS)</td><td></td></tr> <tr><td>Dropping</td><td>ג'יאנגסו Songchang ציוד רפואי ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית, EDTA</td><td>סינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>10009617</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>LUXIANZI ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>מטחנה מהירה אוטומטית לחלוטין מדגם מהיר</td><td>שנחאי Jingxin פיתוח תעשייתי ושות', בע"מ</td><td>Tissuelyser-96</td><td></td></tr><tr><td>חומצה</td> <td>אצטית קרחוניתסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10000218</td><td></td></tr><tr><td>צינור טחינה</td><td>שנחאי Jingxin פיתוח תעשייתי ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזואמיל אלכוהול</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10003218</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>80109218</td><td></td></tr><tr><td>תווית</td><td>M& G Chenguang נייר מכתבים ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8</td><td>שנחאי Leica ושות', בע"מ</td><td>21903797</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט heptahydrate, MgSO4</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ כיסוי זכוכית</td><td>Zhejiang Shitai תעשייתי ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>מהדקי נייר</td><td>M&; G Chenguang נייר מכתבים ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עיפרון</td><td>M& G Chenguang נייר מכתבים ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מברשת מאביקים</td><td>שנחאי Yimei פלסטיק ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול, PEG 6000</td><td>בייג'ינג Dingguo Changsheng ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>DH229-1</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול, PEG-4000</td><td>גואנגג'ואו saiguo ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>1521GR500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד, KOH</td><td>סינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ</td><td>10017008</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן חנקתי, KNO3</td><td>Sinopharm מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>ג'יאנגסו Songchang ציוד רפואי ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שקופית</td><td>Zhejiang Shitai תעשייתי ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד, NAOH</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10021418 סולפט נייר</td><td>Taizhou Jinnong רשת מפעל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תרמוסטט אמבט מים</td><td>שנחאי Jinghong ציוד ניסיוני ושות', בע"מ</td><td>L-909193</td><td></td></tr><tr><td>Trichloromethane</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4Shanghai</td> <td>Lingfeng מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>20032318</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>שקיות נעילת רוכסן</td><td>M& G Chenguang נייר מכתבים ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&בטא;-מרקפטואתנול</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>60-24-2(CAS)</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת יחסי תאימות עצמית (in) ותאימות בין (in) בהדרים באמצעות האבקה ידנית, מיקרוסקופיה וניתוח גנוטיפ s

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

הדר משתמש באי-תאימות עצמית מבוססת S-RNase כדי לדחות אבקה עצמית, ולכן זקוק לעצי האבקה סמוכים לצורך האבקה ודישון מוצלחים. עם זאת, איתור זנים מתאימים שישמשו כמאביקים הוא תהליך שלוקח זמן. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו שיטה מהירה לזיהוי זני הדרים תואמי האבקה המשתמשת באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ובכתמים כחולים אנילין. תאימות האבקה נקבעת על סמך זיהוי גנוטיפים מסוג S על ידי חילוץ DNA כולל וביצוע בדיקות גנוטיפ מבוססות PCR עם פריימרים ספציפיים. בנוסף, סגנונות נאספים 3-4 ימים לאחר האבקה ידנית, וצביעת כחול אנילין מבוצעת. לבסוף, מצב הצמיחה של צינורות האבקה נצפה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאימות אבקה וחוסר תאימות ניתן לקבוע על ידי התבוננות אם צמיחת צינור אבקה הוא נורמלי או מדוכא, בהתאמה. בשל פשטותה ועלות-תועלתה, שיטה זו היא כלי יעיל לקביעת תאימות האבקה ואי התאימות של זני הדרים שונים כדי ליצור קבוצות אי-התאמה ויחסי אי-התאמה בין זנים שונים. שיטה זו מספקת מידע חיוני לבחירה מוצלחת של עצים מאביקים מתאימים, ובכך מאפשרת הקמת בוסתנים חדשים ובחירת הורים מתאימים לתוכניות רבייה.

לניסויים שנעשו כאן נבחרו פרחים בוגרים, האנתרים נאספו, יובשו בתנור והאבקה נבטה ב-28 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. כדאיות האבקה ושיעורי הנביטה כומתו כפי שניתן לראות באיור 1.
ההדרים עברו האבקה ידנית, והתאימות וחוסר התאימות של האבקה הוערכו באמצעות צביעה כחולה אנילין ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. האבקה התואמת יכולה לנבוט על פני הצלקת ולייצר צינור אבקה רגיל שיכול לגדול ובסופו של דבר להוביל להפריה בשחלה. לעומת זאת, צינורות אבקה לא תואמים גדלו דרך כשני שלישים מהסגנון ואז הפסיקו לג...

פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה לקביעת תאימות אבקה ואי התאמה בזני הדרים.

קביעת יחסי תאימות עצמית (In) ותאימות בין (In) בהדרים באמצעות האבקה ידנית, מיקרוסקופיה וניתוח גנוטיפ S

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65056.jpg

טכניקה זו יכולה לזהות ביעילות את גנוטיפ S ולזהות במדויק אי התאמה עצמית של הדרים, תוך מתן מידע הכרחי לבחירת עצי האבקה מתאימים. זוהי טכניקה חסכונית בזמן, פשוטה ואמינה לבחירת עצי ההורים המתאימים בתוכניות הרבייה. טכניקה זו היא פשוטה וקלה לביצוע וביצוע ניסויים בפעם הראשונה דורש סבלנות וטיפול.זיהוי גנוטיפ S ועיצוב פריימר ספציפי ל-S דורשים יותר תשומת לב וטיפול. מי שידגים את ההליך יהיה יו הו, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. התחילו את איסוף האבקה על ידי לקיחת פרחי הפומלה Majia, Citrus maxima, למעבדה.אספו את האנתרים באמצעות פינצטה והניחו אותם בכלי פטרי המכיל נייר פילטר. יבשו את גרגרי האבקה על ידי הנחת צלחת הפטרי המכילה את האנתרים בתנור של 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הייבוש, יש לשמור את האבקה בשקית נעילת רוכסן אטומה של Micro Centron המכילה ג'ל סיליקה משנה צבע.סגרו את השקית ותייגו את השקית עם שם זן האבקה ותאריך האחסון. יוצקים 300 מיקרוליטר של המדיום הנוזלי לתוך המכסה של צינור צנטריפוגה של שני מיליליטר ומפזרים את האבקה באופן שווה בעזרת מברשת האבקה. מניחים את האבקה בקופסה שחורה לחה ודגרים על 28 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.לאחר הדגירה, חותכים את קצה המילימטר העליון מקצה פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר ושאפו את האבקה עם כמות קטנה של תמיסת תרבית. הניחו את האבקה במרכז שקופית המיקרוסקופ וכסו אותה בחלקת כיסוי. לאחר שתסיים, התבונן בדגימה במיקרוסקופ הפוך באמצעות מטרה פי 10.בצע שלושה שכפולים עצמאיים תוך שימוש בערך באותה צפיפות אבקה עבור כל שכפול. להאבקה, השתמשו במברשת האבקה כדי לפזר כמות מספקת של אבקה בת קיימא על פני השטח של הצלקת, כדי להבטיח לא לפגוע בפיסטיל. כסו את הפרחים המואבקים בשקית נייר סולפט ומנעו האבקה על ידי אבקנים מובחנים גנוטיפית על ידי אטימת השקית באמצעות אטב נייר.כתוב את שם המין ואת מספר וזמן ההאבקה על התווית. תלו את התווית על הענפים ליד הפרחים המואבקים. מוציאים את שקיות ההאבקה כשלושה עד ארבעה ימים לאחר ההאבקה ואוספים את הפרחים המואבקים בשקיות עם רוכסן.הסירו מיד את עלי הכותרת, כלי הקיבול והשחלות מהפרחים וטבלו את הצלקת המאוחה לעיצוב בצינור צנטריפוגה המכיל תמיסה מקובעת טרייה. לדגור על הסטיגמה והסגנון בתמיסה המקבעת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, השליכו את התמיסה המקבעת לפני שטיפת הסטיגמה וסטייל פעמיים עד שלוש באתנול 95%.לאחר מכן, הוסף תמיסת אתנול 70% לסגנון, וודא שהדגימה שקועה לחלוטין בתמיסה. את הסגנונות בשלב זה ניתן לאחסן בארבע מעלות צלזיוס למשך חודש עד חודשיים. לצביעת כחול אנילין, יש לשטוף את דגימות הסגנון המאוחסנות באתנול 70% במים מזוקקים שלוש עד ארבע פעמים.טבלו אותו בתמיסת נתרן הידרוקסידי ארבע טוחנות ואטמו אותו לפני הדגירה באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. במהלך שלב זה, צבע הסגנון משתנה מצהוב-לבן לכתום-אדום. לאחר מכן, להשרות את הסגנונות במים מזוקקים.לאחר 30 דקות, השליכו את המים המזוקקים ושטפו את הסגנונות במים מזוקקים שלוש עד ארבע פעמים או עד שצבע הסגנון הופך לצהוב. לאחר מכן, מוסיפים את כחול האנילין עד שהדגימה שקועה ודגרים במשך 12 שעות בחושך. שימו לב לצמיחת צינור האבקה תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי.הנח את המגלשה על שולחן שטוח. חלק את הסגנון לשני חצאים לאורך ציר האורך באמצעות אזמל. הניחו מחצית מהסגנון על שקופית זכוכית והוסיפו שתיים עד שלוש טיפות פוליאתילן גליקול לפני השטח של השקופית.לאחר מכן, כסו אותו עם פתק כיסוי. לאחר שתסיים, מקם את השקופית על במת המיקרוסקופ מעל הצמצם ובצע הדמיה באמצעות מטרה של 10X. השתמש במסנן DAPI והתבונן בצמיחת צינור האבקה.שימו לב לחמישה סגנונות לכל סוג האבקה. כדאיות האבקה של Citrus maxima ושיעורי הנביטה כומתו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. האבקה התואמת נבטה בהצלחה על פני הצלקת ויצרה צינור אבקה תקין, שגדל ובסופו של דבר הוביל להפריה בשחלה.לעומת זאת, צינורות אבקה לא תואמים גדלו דרך כ-2/3 מהסגנון ואז הפסיקו לגדול. אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז זיהתה את מוצר הדנ"א מוגבר באמצעות פריימרים ספציפיים למוקד S. הוא הראה את ההגברה של מוצר ה- DNA בין 500 ל -1, 000 זוגות בסיסים.זוהה גנוטיפ S המתאים. 21 הפלוטיפים של S בזני הדרים שונים זוהו בשיטה זו. שלב ההאבקה הוא קריטי.רק האבקה מוצלחת יכולה להבטיח את התצפית הבאה של צינורות אבקה. הטכניקה שימשה לניתוח תכונות אי-ההתאמה העצמית ולחקור ולזהות את הגורמים הנשיים הקובעים את אי-ההתאמה העצמית. שיטה זו חשובה למחקר אי-התאמה עצמית ולתוכניות רבייה.זה יכול גם להקל על הקהילה החקלאית בבחירת עצים מאביקים למטעים שלהם.

determination-self-compatibility-inter-compatibility-relationships

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פיתחנו מתודולוגיה לביצוע צלבים בviridis Setaria (ס 'viridis). השיטה כוללת גיזום המכבד לפני טיפול במים חמים כדי להרוג את האבקה ובת קיימא. צלבים מבוצעים הבא משטר צמיחה מבוקרת היטב ובדרך כלל לגרום להתאוששות של 1 עד 7 האבקה צולבת זרע / s לכל מכבד.

שיטות לביצוע צלבים ב<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, מערכת דגם חדש לעשבים

כדי לחשוף את האפקטיביות המאביק של מיני צמחים נתונים, מספר שיטות של ניסויי שדה פותחו. מחקר זה מדגים את השיטות הבסיסיות של ניסויי שדה לאקולוגית אבקה באמצעות מקרה המבחן של Lycoris sanguinea var. Sanguinea ומנגנון אבקת הרומן, אבקה שוברת ניצן.

ניסויי שדה לאקולוגית אבקה: המקרה של<em&gt; Lycoris sanguinea</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

ב פרוטוקול זה, שיטות לעריכת נישואין בתוך המשפחה צלבים, להערכת ההצלחה של אלה צלבים, מתוארים על הנמלה Vollenhovia emeryi. פרוטוקולים אלה חשובים עבור ניסויים להבנת בסיס גנטי של סקס נחישות מערכות דבוראים.

אינדוקציה והערכה של נישואי קרובים צלבים באמצעות הנמלים, Vollenhovia Emeryi

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכפות פורחים עצי מנדרינה בתנאים phytotron. מים הלחץ, עוצמת הארה גבוהה ו- photoperiod האביב מדומה מותר פרחים קיימא כדי להשיגן תוך תקופה קצרה של זמן. מתודולוגיה זו מאפשרת לחוקרים יש מספר תקופות פריחה ב 1 שנה.

פריחה בכפייה בעצים מנדרין בתנאים Phytotron

אנו מדגימים שיטה לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה על בסיס מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידרופזיס הפריה כפולה באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי.

הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

אנו מציגים מתודולוגיה להקמת הצרכים של האבקה של משמש (שזיף armeniaca L.) המשלבים את התאימות העצמית (in) של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית עם זיהוי של ה-S-גנוטיפ על ידי ניתוח PCR.

קביעת יחסי התאימות של העצמי והאינטר-(ב) משמש שילוב יד-האבקה, מיקרוסקופיה וניתוחים גנטיים

מתודולוגיה לקביעת דרישות האבקה בהיברידיות מסוג שזיף יפני מתוארת, המשלבת האבקות שדה ומעבדות ותצפיות של צינורות אבקה תחת מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות עם זיהוי של S-genotypes על ידי PCR וניטור הפריחה לבחירת מאביקים.

קביעת דרישות האבקה בשזיף היפני על ידי ניטור פנולוגי, האבקות ביד, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וגנוטיפינג מולקולרי

בעבודה זו מתוארת שיטה חזקה לכימות יעילות ההזדווגות בשמרים Saccharomyces cerevisiae . שיטה זו שימושית במיוחד לכימות מחסומים קדם-זיגוטיים במחקרי התמיינות.

קביעת יעילות ההזדווגות של הפלואידים ב-Saccharomyces cerevisiae

שיטה משופרת למדידת פרופילי הידרציה של אבקה ב- Arabidopsis thaliana מתוארת כאן. השיטה החדשה מציעה רזולוציה גבוהה יותר, אינה פולשנית וניתנת לשחזור רב. הפרוטוקול מהווה כלי חדש לניתוח עדין יותר של התהליכים המווסתים את השלבים המוקדמים של ההאבקה.

בדיקה ביולוגית ברזולוציה גבוהה, מדגן יחיד, In Vivo אבקת הידרציה עבור Arabidopsis thaliana

בזאת הוא תיאר את ההליך מיושם קבוצת מבניים ותפקודיים ביולוגיה קאפרי ממברנה להגדיר באופן ידני ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה ב mesophases lipidic.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

למד לזהות תאימות אבקה ואי-תאימות עצמית במיני הדרים באמצעות מיקרוסקופיה וניתוח גנוטיפ S. שיטה זו מאפשרת לבוחרים לבחור עצי מאביק מתאימים לשיפור פריון והצלחת הרבייה.

קביעת יחסי תאימות עצמית (In) ותאימות בין (In) בהדרים באמצעות האבקה ידנית, מיקרוסקופיה וניתוח גנוטיפ S

גלה סרטונים נוספים