קביעת יחסי תאימות עצמית (In) ותאימות בין (In) בהדרים באמצעות האבקה ידנית, מיקרוסקופיה וניתוח גנוטיפ S

טכניקה זו יכולה לזהות ביעילות את גנוטיפ S ולזהות במדויק אי התאמה עצמית של הדרים, תוך מתן מידע הכרחי לבחירת עצי האבקה מתאימים. זוהי טכניקה חסכונית בזמן, פשוטה ואמינה לבחירת עצי ההורים המתאימים בתוכניות הרבייה. טכניקה זו היא פשוטה וקלה לביצוע וביצוע ניסויים בפעם הראשונה דורש סבלנות וטיפול.

זיהוי גנוטיפ S ועיצוב פריימר ספציפי ל-S דורשים יותר תשומת לב וטיפול. מי שידגים את ההליך יהיה יו הו, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. התחילו את איסוף האבקה על ידי לקיחת פרחי הפומלה Majia, Citrus maxima, למעבדה.

אספו את האנתרים באמצעות פינצטה והניחו אותם בכלי פטרי המכיל נייר פילטר. יבשו את גרגרי האבקה על ידי הנחת צלחת הפטרי המכילה את האנתרים בתנור של 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הייבוש, יש לשמור את האבקה בשקית נעילת רוכסן אטומה של Micro Centron המכילה ג'ל סיליקה משנה צבע.

סגרו את השקית ותייגו את השקית עם שם זן האבקה ותאריך האחסון. יוצקים 300 מיקרוליטר של המדיום הנוזלי לתוך המכסה של צינור צנטריפוגה של שני מיליליטר ומפזרים את האבקה באופן שווה בעזרת מברשת האבקה. מניחים את האבקה בקופסה שחורה לחה ודגרים על 28 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.

לאחר הדגירה, חותכים את קצה המילימטר העליון מקצה פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר ושאפו את האבקה עם כמות קטנה של תמיסת תרבית. הניחו את האבקה במרכז שקופית המיקרוסקופ וכסו אותה בחלקת כיסוי. לאחר שתסיים, התבונן בדגימה במיקרוסקופ הפוך באמצעות מטרה פי 10.

בצע שלושה שכפולים עצמאיים תוך שימוש בערך באותה צפיפות אבקה עבור כל שכפול. להאבקה, השתמשו במברשת האבקה כדי לפזר כמות מספקת של אבקה בת קיימא על פני השטח של הצלקת, כדי להבטיח לא לפגוע בפיסטיל. כסו את הפרחים המואבקים בשקית נייר סולפט ומנעו האבקה על ידי אבקנים מובחנים גנוטיפית על ידי אטימת השקית באמצעות אטב נייר.

כתוב את שם המין ואת מספר וזמן ההאבקה על התווית. תלו את התווית על הענפים ליד הפרחים המואבקים. מוציאים את שקיות ההאבקה כשלושה עד ארבעה ימים לאחר ההאבקה ואוספים את הפרחים המואבקים בשקיות עם רוכסן.

הסירו מיד את עלי הכותרת, כלי הקיבול והשחלות מהפרחים וטבלו את הצלקת המאוחה לעיצוב בצינור צנטריפוגה המכיל תמיסה מקובעת טרייה. לדגור על הסטיגמה והסגנון בתמיסה המקבעת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, השליכו את התמיסה המקבעת לפני שטיפת הסטיגמה וסטייל פעמיים עד שלוש באתנול 95%.

לאחר מכן, הוסף תמיסת אתנול 70% לסגנון, וודא שהדגימה שקועה לחלוטין בתמיסה. את הסגנונות בשלב זה ניתן לאחסן בארבע מעלות צלזיוס למשך חודש עד חודשיים. לצביעת כחול אנילין, יש לשטוף את דגימות הסגנון המאוחסנות באתנול 70% במים מזוקקים שלוש עד ארבע פעמים.

טבלו אותו בתמיסת נתרן הידרוקסידי ארבע טוחנות ואטמו אותו לפני הדגירה באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. במהלך שלב זה, צבע הסגנון משתנה מצהוב-לבן לכתום-אדום. לאחר מכן, להשרות את הסגנונות במים מזוקקים.

לאחר 30 דקות, השליכו את המים המזוקקים ושטפו את הסגנונות במים מזוקקים שלוש עד ארבע פעמים או עד שצבע הסגנון הופך לצהוב. לאחר מכן, מוסיפים את כחול האנילין עד שהדגימה שקועה ודגרים במשך 12 שעות בחושך. שימו לב לצמיחת צינור האבקה תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי.

הנח את המגלשה על שולחן שטוח. חלק את הסגנון לשני חצאים לאורך ציר האורך באמצעות אזמל. הניחו מחצית מהסגנון על שקופית זכוכית והוסיפו שתיים עד שלוש טיפות פוליאתילן גליקול לפני השטח של השקופית.

לאחר מכן, כסו אותו עם פתק כיסוי. לאחר שתסיים, מקם את השקופית על במת המיקרוסקופ מעל הצמצם ובצע הדמיה באמצעות מטרה של 10X. השתמש במסנן DAPI והתבונן בצמיחת צינור האבקה.

שימו לב לחמישה סגנונות לכל סוג האבקה. כדאיות האבקה של Citrus maxima ושיעורי הנביטה כומתו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. האבקה התואמת נבטה בהצלחה על פני הצלקת ויצרה צינור אבקה תקין, שגדל ובסופו של דבר הוביל להפריה בשחלה.

לעומת זאת, צינורות אבקה לא תואמים גדלו דרך כ-2/3 מהסגנון ואז הפסיקו לגדול. אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז זיהתה את מוצר הדנ"א מוגבר באמצעות פריימרים ספציפיים למוקד S. הוא הראה את ההגברה של מוצר ה- DNA בין 500 ל -1, 000 זוגות בסיסים.

זוהה גנוטיפ S המתאים. 21 הפלוטיפים של S בזני הדרים שונים זוהו בשיטה זו. שלב ההאבקה הוא קריטי.

רק האבקה מוצלחת יכולה להבטיח את התצפית הבאה של צינורות אבקה. הטכניקה שימשה לניתוח תכונות אי-ההתאמה העצמית ולחקור ולזהות את הגורמים הנשיים הקובעים את אי-ההתאמה העצמית. שיטה זו חשובה למחקר אי-התאמה עצמית ולתוכניות רבייה.

זה יכול גם להקל על הקהילה החקלאית בבחירת עצים מאביקים למטעים שלהם.