אפיון ריפוי פצעי אפיתל in vivo באמצעות אורגניזם המודל הקנידרי Clytia hemisphaerica
10 בפברואר 2023
מאמר זה מתאר שיטה ליצירת פצעים באפיתל של מדוזה חיה של Clytia hemisphaerica וריפוי פצעים ברזולוציה גבוהה in vivo. בנוסף, מוצגת טכניקה להחדרת צבעים ותרופות להפרעות לתהליכי איתות בתאי האפיתל ובמטריצה החוץ תאית במהלך ריפוי פצעים.
פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של תאי אפיתל במהלך ריפוי פצעים בבעלי חיים חיים. זה מאפשר לנו לראות איך תאים מתנהגים בסביבה הטבעית המורכבת שלהם. טכניקה זו מציגה ריאגנטים לתוך המטריצה החוץ תאית וציטופלסמה התא כדי לחקור את ההשפעה של ריאגנטים אלה על התפשטות תאים ונדידה במהלך ריפוי פצעים בבעלי חיים חיים.
ריפוי פצעי אפיתל וקליטיה דומה להפליא לריפוי בבעלי חיים מורכבים יותר. לכן, אנו יכולים ללמוד הרבה ממערכת זו על מנגנוני ריפוי הפצעים וכיצד הם נוצרו. מי שידגימו את הנהלים הללו יהיו אליזבת לי, וטכנאית המחקר אמילי וואטו.
כדי להתחיל את תהליך הפציעה, להכין פיפטה העברה שונה על ידי חיתוך קצה פיפטה עם מספריים, יצירת פתח מוגדל בגודל של 0.5 עד 0.7 ס"מ קוטר. באמצעות פיפטת ההעברה המתוקנת, מניחים את המדוזה שנאספה ממושבות הפוליפ המבוססות על מגלשת שקע, כאשר מטריית מדוזה X פונה כלפי מעלה. ודא כי מספיק של מי ים מלאכותיים, או ASW, מכסה את החיה.
כדי ליצור מיקרו פצעים בתוך ובין תאים, הניחו כיסוי מעל החיה. החלקת הכיסוי דוחסת את המזוגליאה, והריבאונד של הרקמה הדחוסה מאלץ את התאים להתרחק מעט. דמיינו את החיה מיד כדי להתבונן בפצעי המיקרו שנוצרו.
כדי ליצור פצעי אפיתל קטנים, הניחו את המדוזה על מגלשת דיכאון כאשר מטריית מדוזה X פונה כלפי מעלה, באמצעות פיפטת העברה שונה, כפי שהודגם קודם לכן. בעזרת קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, מגרדים בעדינות את פני השטח של המדוזה. גירוד עדין עלול ליצור קרעים בקרום המרתף.
כסו את בעל החיים בפתק כיסוי להדמיה. הנחת הכיסוי מספיקה לעיתים כדי ליצור פצעי אפיתל קטנים גם ללא שריטה. הכינו מחט מיקרו-הזרקה, באמצעות עמוד מיקרו פיפטה וצינור נימי זכוכית, בהתאם לשלבים המתוארים בטקסט.
הכניסו את מחט המיקרו-הזרקה הריקה למחזיק מיקרו-הזרקה המודבק למיקרו-מניפולטור וחתכו את קצה המחט, כך שהפתח יהיה בגודל של כ-20 עד 40 מיקרון. הגדר את לחץ האחיזה על המזרק הזעיר לאפס, ואת לחץ הפליטה לכ -20 פאונד לאינץ 'מרובע. הגדר את המיקרו-מזרק כך שיספק פולס אוויר של שתי שניות.
כדי ליצור פצעי אפיתל גדולים, הניחו את המדוזה על מגלשת דיכאון, כפי שהודגם קודם. באמצעות מניפולטור מיקרו, להתאים את קצה מחט מיקרו הזרקה להישאר ממש מעל המים, על ידי טבילה בזהירות את הקצה לתוך המים, ולאחר מכן למשוך אותו כך שהוא קרוב למשטח האפיתל של המדוזה. דופק אוויר על ידי לחיצה על התחל על המזרק.
חזור על הדופק באותה נקודה פעמיים עד ארבע פעמים, בהתאם לרוחב הקצה. טיפים גדולים יותר דורשים פחות פולסים. כסו את בעל החיים הפצוע בתלוש כיסוי להדמיית פצעים גדולים.
כוונן את המוקד למטריית x. תאים משושים צריכים להיות ברורים. זהה פצע באופן ידני כדי לדמות אותו.
הפעל תוכנית שאוספת תמונות כסרט בזמן אמת, או תוכנית שאוספת סידרה של תמונות במרווחי זמן קבועים. עקוב אחר ההתקדמות כדי לוודא שאזור הפצע אינו נסחף אל מחוץ לשדה הראייה, ושהתאים המעניינים נשארים ממוקדים. להזרקת צבעים ותרופות, הכינו מחט מיקרו-הזרקה בהתאם לשלבים המתוארים בטקסט.
מלאו את מחט המיקרו-הזרקה בעזרת קצה פיפטה ארוך עם נפח עודף של צבע או תרופה להזרקה למדוזה. בעזרת פיפטת העברה שעברה שינוי, הניחו מדוזה עם תת-מטריה הפונה כלפי מעלה לתוך פולידימתילסילוקסן, או צלחת הזרקת PDMS, עם מספיק ASW כדי לכסות את החיה. מניחים את המנה על במה של מיקרוסקופ מנתח.
התמקדו בקצה מחט המיקרו-הזרקה, וקדמו אותה למים ליד המדוזה. עם מניפולטור מיקרו, לחץ על המחט לתוך הצלחת עד שהיא מתכופפת ונשברת. יצירת פתח חוד של כ-10 עד 20 מיקרון.
באמצעות מניפולטור מיקרו, להחדיר את קצה המחט דרך מטריית המשנה לתוך mesoglea מבלי לנקב את מטריית X. במיקרו-מזרק, הגדר את לחץ האחיזה לאפס, ולחץ ההזרקה מתחת או שווה ל -20 פאונד לאינץ 'מרובע. יש להזריק לרביע אחד או שניים, ולמלא כל אחד מהם בכתם צבע או סם בערך רבע משטחו של אותו רביע.
תלוי איזה צבע או סם מוזרקים, בעלי חיים מוכנסים לתוך של ASW טרי כדי לאפשר צבע או פיזור סמים ודגירה. להדמיה, הרכיבו את המדוזה על מגלשת שקע באמצעות פיפטת העברה שונה, והציבו את החיה עם מטריית X הפונה כלפי מעלה. בעלי חיים יכולים להיפצע בשלב זה כדי לבחון את ההשפעה של מגיב מוזרק.
פצעי המיקרו בתוך ובין התאים יצרו למליפודיה קטנה במהלך סגירת הפצע. לאחר מכן הגיע התכווצות, והפצעים החלימו תוך פחות מדקה. פצעי האפיתל הקטנים נרפאו גם באמצעות היווצרות למליפודיה והרחבה של מגעי למליפודיה.
סגירת פצע מהירה ומתקדמת קדמה להתכווצות הרקמה לאורך תפר הפצע שזה עתה נוצר. שיעור הריפוי המנורמל של שני פצעים קטנים המתבטא כאחוז משטח הפצע הכולל לאורך זמן הצביע על שונות מסוימת בדינמיקה של סגירת הפצע. נתונים מ-14 פצעים שונים שימשו לקביעת עקומת ריפוי פצעים ממוצעת בבעלי חיים שלא טופלו.
בפצע קטן עם נזק לקרום המרתף, תאי השוליים התפזרו סביב האזור הפגוע, והפער נסגר בהתכווצות חוט ארנק. כאשר הרקמה הייתה מיובשת או פגומה מכדי לתקן, תנועות התאים יכלו להיפסק, או שכל יריעת התאים יכלה להתפוצץ. פצעים גדולים נרפאו בכמה שלבים.
החלקת הקצה בעקבות התכווצויות בשוליים, היווצרות למליפודיה והארכת הלמליפודיה מגעים עם נדידת תאים קולקטיבית בשוליים ובמרחק של מספר שכבות תאים מהם, סגרו פערים גדולים. צביעת הגרעין והממברנה הושגו על ידי הזרקה זעירה של הריאגנטים לתוך ECM. מיקרו-הזרקה של ציטוכלסין B עיכבה היווצרות למליפודיה לאחר הפציעה.
טפלו בבעלי החיים בעדינות. בעת הזרקת ריאגנטים, ודא שקצה מחט המיקרו-הזרקה נמצא במזוגליאה, ולא עבר את כל הדרך דרך החיה. כיום, בעלי חיים טרנסגניים מיוצרים עם חלבוני תג פלואורסצנטי, בשילוב פלואורסצנטיות ומיקרוסקופ ניגודיות מפריע דיפרנציאלי ייתן תמונה ברורה עוד יותר של האירועים התאיים בריפוי פצעי אפיתל.
סקירה כללית
מחקר זה שופך אור על שיטה ליצירה ולהדמיה של פצעים אפיתליאליים במדוזה חיה מסוג Clytia hemisphaerica, ובכך מספק תובנות לגבי התנהגות תאים במהלך ריפוי פצעים בסביבה טבעית. המחברים מציגים טכניקה להזרקת צבעים ותרופות על מנת לחקור תהליכי איתות המעורבים בריפוי פצעים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- ריפוי פצעים
- התנהגות תאי אפיתל
- דימיון של בעלי חיים חיים
רקע
- תהליך הריפוי ב-Clytia דומה לזה המתרחש בבעלי חיים מורכבים יותר.
- הבנת מנגנוני ריפוי פצעים יכולה לספק תובנות לגבי ביולוגיה אבולוציונית.
- המחקר מדגיש את הרלוונטיות של אורגניזמים פשוטים למחקר ביולוגי מורכב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יצירת פצעים אפיתליאליים במדוזה חיה מסוג Clytia hemisphaerica.
- טכניקות דימיון in vivo להצגת דינמיקה של תאים.
- מיקרו-הזרקה של תרופות וצבעים אל תוך המטריצה extracelluar למחקרים של הפרעה (perturbation).
תוצאות עיקריות
- הדגמה של טכניקות ליצירה ולניטור של פצעים אפיתליאליים מיקרוסקופיים וקטנים.
- אפיון התנהגויות תאיות, כולל היווצרות למליפודיה (lamellipodia) וכיווץ רקמה במהלך הריפוי.
- קביעת השונות בדינמיקה של סגירת פצעים באמצעות עקומות ריפוי ממוצעות.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה מהימנה לחקר דינמיקת ריפוי פצעים בזמן אמת.
- הוא מדגיש את הפוטנציאל של אורגניזמי מודל פשוטים בקידום הבנתנו לגבי תהליכים ביולוגיים מורכבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
דימות in vivo ברזולוציה גבוהה של ריפוי פצעים אפיתליאליים ב-Clytia hemisphaerica מאפשר תצפית ישירה על מנגנוני תיקון תאיים בסביבה אותנטית של מטריקס חוץ-תאית. מערכת זו מאפשרת לצוותי מו"פ בביו-פארמה לנתח תהליכים יסודיים כגון היווצרות lamellipodia, התכווצות purse string ונדידה תאית קולקטיבית, ללא גורמים מבלבלים כגון כלי דם או דלקת. גישה זו תומכת בביטחון ניבוי בשלבים מוקדמים של תיקוף מטרות והפחתת סיכונים מכניסטיים עבור פורטפוליו של ריפוי פצעים ותיקון רקמות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של מנגנוני תיקון אפיתליאליים בהקשר של בעל חיים חי.
- מסייע בהסרת סיכונים מנגנוניים על ידי בידוד תהליכי ריפוי עצמאיים של התא.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי מתן אפשרות לשיבוש פרמקולוגי של אינטראקציות בין התא ל-ECM.
- מספק פלטפורמה למחקרים מונחי-השערה על דינמיקת סגירת פצעים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מבסס בדיקת in vivo הניתנת לשחזור לצורך כימות קצבי סגירת פצעים והתנהגויות תאיות.
- מאפשר דימוי ומדידה סטנדרטיים של היווצרות למליפודיה (lamellipodia) וכיווץ רקמות.
- מאפשר סריקה של תרכובות המווסתות תיקון אפיתליאלי באמצעות מיקרו-הזרקה לתוך ה-ECM.
- תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה להערכת תרכובות במחקרי ריפוי פצעים.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך חקר מסלולי תיקון אפיתליאליים שמורים.
- מתכתב עם גילוי ביומרקרים תרגומיים על ידי מתן אפשרות למדידה כמותית של קינטיקת הריפוי.
- מאפשר רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מידול מנגנוני תיקון מרכזיים in vivo.
- מפחית סיכונים בקבלת החלטות לגבי קידום התהליך על ידי הבהרת ההשפעה של התערבויות מועמדות על דינמיקת סגירת הפצע.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קלני על ידי מתן אפשרות לביצוע מחקרים מכניסטיים, פיתוח בדיקות כמותיות ובדיקות פסיכולוגיות במודל של בעל חיים חי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים עבור יעדים לתיקון אפיתליאלי.
- סריקה: מספקת מדדים כמותיים וניתנים לשחזור של סגירת פצעים לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות של שטח הפצע וקצבי הסגירה כפונקציה של הזמן לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים לוולידציה פרה-קלינית באמצעות מנגנוני תיקון שמורים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר in vivo לבדיקה איטרטיבית של התערבויות לריפוי פצעים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תיקון אפיתל.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות ריפוי פצעים in vivo לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות go/no-go ומשפר את יעילות ההון על ידי הבהרת הסיכון הביולוגי בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מועמדים לריפוי פצעים ותיקון רקמות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בבעלי חיים חיים ובטכניקות של מיקרו-הזרקה.
- דורש גישה לתשתית מיקרוסקופיה ברוזולוציה גבוהה בשיטת DIC או פלואורסצנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הדמיה ויצירת פצעים.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול לצורך נגישות לרקמה.
- טיפול זהיר הוא חיוני כדי למנוע נזק רקמתי מופרז או אובדן של דיוק ההדמיה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:53
Procedure for Wounding: Microwounds and Small Wounds
2:13
Procedure for Wounding: Large Wounds
3:24
Imaging Epithelial Wound Healing
3:52
Procedure for Mesogleal Injections
5:32
Results: The Epithelial Wound Healing Process
7:08
Conclusion
