מיפוי אופטי של לבבות בצבע כפול מעכברי RyR2R2474S של טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית

שיטה זו תסייע לנו לחשוף את התכונות והמנגנונים האלקטרופיזיולוגיים של מריחות דום חדרים הקשורות למחלות כגון טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים להשיג את פוטנציאל הממברנה ואת אותות הסידן הבין-תאיים בו זמנית תחת פרוטוקולי קצב חשמליים מתוכנתים שונים, אשר מתאים במיוחד לחקר המנגנונים הבסיסיים והדינמיקה של מחלות הפרעות קצב לב כגון CPVT. כדי לבצע ניסוי זה בהצלחה, ודא שיש לך לב מחורר היטב, העמסת צבע נכונה, עירור-כיווץ צימוד, והגדרות מצלמה זהירות.

כדי להתחיל, הגדר את מערכת המיפוי האופטי והפעל את המצלמה לטמפרטורת דגימה יציבה של מינוס 50 מעלות צלזיוס. הכניסו את לב העכבר שנקצר לתמיסת CREB קרה כדי להאט את חילוף החומרים ולהגן על הלב. הסר את הרקמה שמסביב של אבי העורקים.

השתמש במחט קנולציה בהתאמה אישית כדי לקנן אותה, וקבע אותה בתפר משי 4-0. עכשיו לחורר את הלב עם מערכת Langendorff במהירות קבועה של 3.5 עד 4.0 מיליליטר לדקה. הכנס צינור פלסטיק קטן לחדר השמאלי כדי לשחרר את גודש התמיסה בתא כדי למנוע עומס יתר מראש ולתקן את צינור הפלסטיק במחט הקנולציה.

לאחר מכן הניחו שני מוליכים לתוך הפרבוסט באמבטיה והפעילו את הכוחות עבור תיבת מגבר האלקטרוקרדיוגרמה ובקר הגירוי החשמלי. לאחר מכן, הפעל את תוכנת האק"ג או האק"ג המוזכרת ועקוב ברציפות אחר האק"ג. בצע את השלבים הבאים בחושך כאשר הלב מגיע למצב יציב.

יש לערבב את תערובת תמיסת ה-CREBs של בלביסטטין כל הזמן לתוך הלב למשך 10 דקות כדי לשחרר את ההתכווצות מהעירור ולהימנע מתוצרי התכווצות במהלך הצילומים. לאחר מכן באמצעות פנס אדום, לבחון את הלב כדי לאשר את הפסקה מוחלטת של הצירים. יש לערבב את הלב עם תמיסת עבודה Rhod-2 AM למשך 15 דקות במערכת הזילוח Langendorff לאחר התכווצות עירור ללא צימוד.

שמרו על אספקת חמצן במהלך העמסת צבע סידן תוך תאי. כדי למנוע היווצרות בועות מ-F-127 פלורוני, הכניסו מלכודת בועות למערכת הזילוח. לדלל 10 מיקרוליטר של תמיסת מלאי RH 237 לתוך 50 מיליליטר של perfusate ולטעון במשך 10 דקות.

עם השלמת טעינת הצבע הכפול, צלם רצף של תמונות. אשר כי אותות מתח וסידן מספיקים לניתוח. הפעל את שתי נורות ה- LED עבור אורות עירור והתאם את עוצמתן לטווח הנכון.

מקם את הלב מתחת למכשיר האיתור, וודא שהוא מואר היטב על ידי שתי נורות LED המתאימות את קוטר נקודת האור לשני סנטימטרים. הגדר את מרחק העבודה בין העדשה ללב על 10 ס"מ כדי להשיג את קצב הדגימה הרצוי ואת הרזולוציה המרחבית. פתח את תוכנת דגימת האותות כדי לשלוט בו-זמנית במצלמה וללכוד אותות מתח וסידן.

הפעל את מגרה השדה MyoPacer והגדר את תבנית הקצב ללוגיקת טרנזיסטור טרנזיסטור עם שתי אלפיות שנייה של משך קצב לכל פעימה. הגדר את העוצמה הראשונית ל- 0.3 וולט. מקם זוג אלקטרודות פלטינה המחוברות לאפיקרדיאל של קודקוד החדר השמאלי.

יש להפעיל 30 גירויים רצופים של 10 הרץ S1 כדי לבדוק את סף המתח הדיאסטולי של הלב באמצעות תוכנת ההקלטה של האק"ג. הגדל בהדרגה את משרעת המתח עד להשגת לכידה אחד על אחד. יישם את פרוטוקול S1-S1 כדי למדוד חלופות סידן או פוטנציאל פעולה ותכונות השבה.

קצב את הלב ברציפות החל מאורך מחזור בסיסי של 100 אלפיות השנייה. הקטן את אורך המחזור ב- 10 אלפיות שנייה בכל רצף עוקב עד שהוא יגיע ל- 50 אלפיות השנייה. התחל מיפוי אופטי במקביל לפני הגירוי.

כדי למדוד את תקופת העקשנות האפקטיבית של החדר באמצעות פרוטוקול הגירוי S1-S2, התחל עם אורך מחזור קצב S1-S1 של 100 אלפיות השנייה. זוג S2 ב 60 אלפיות השנייה ולהקטין עם צעד של שתי אלפיות השנייה עד S2 נכשל ללכוד קומפלקס QRS חוץ רחמי. להשראת הפרעות קצב, יש לתת קצב פרץ תמידי של 50 הרץ ולבצע את אותו פרק קצב לאחר המתנה למרווח של שתי שניות של מנוחה.

עקוב בקפידה אחר רישומי האלקטרוקרדיוגרמה במהלך תקופת הקצב הרציפה בתדר גבוה כדי להתחיל מיד בהקלטות מיפוי אופטי בו זמנית כאשר נוצר גל הפרעות קצב מעניין. המשך לצלם תמונות באמצעות מצלמת המכשיר המצומדת למטען מכפיל אלקטרונים. בתוכנת רכישת התמונות, לחץ על בחר תיקייה וטען תמונות כדי להתחיל בתהליך ניתוח נתוני הווידאו המסיבי החצי-אוטומטי.

הזן את פרמטרי הדגימה הנכונים לניתוח. הגדר ידנית את סף התמונה ובחר את אזור העניין. החילו מסנן מרחבי גאוסיאני, מסנן סביצקי-גולאי ותיקון קו בסיס של כובע עליון.

לאחר מכן לחץ על Process Images כדי להסיר את קו הבסיס ולחשב פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים כגון APD-80 ו- CATD-50. הגדר את משך הזמן הפוטנציאלי להתחלת הפעולה בשיא ואת נקודת הסיום ברפולריזציה של 80% לצורך חישוב APD-80. באופן דומה, הגדירו את זמן ההתחלה של משך הזמן הארעי של הסידן כשיאו, כאשר נקודת הסיום היא 80% הרפיה.

עקבות אופייניים במפות חום של APD-80 ו- CATD-80 מוצגים. איזופרוטרנול מקצר APD-80 ועכברי טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית או CPVT, אך לא נמצא הבדל לאחר אתגר איזופרוטרנול. עכברי CATD-80 ו-CPVT היו ארוכים יותר מאשר בעכברי בר לאחר אתגר האיזופרוטרנול, בעוד שלא הייתה משמעות לפני הטיפול.

על פי אותות המתח, לבבות מסוג פראי ולבבות CPVT היו בעלי אותה יכולת הולכה על פני האפיקרדיום בתחילת המחקר ולאחר התערבות איזופרוטרנול. מפות חום הראו שלעכברי CPVT יש את אותה יכולת הולכה כמו לעכברי הבר לפני ואחרי אתגר האיזופרוטרנול. ניתוח חלופות של משרעת סידן הראה כי אותות הסידן בלבבות מסוג בר נשארו יציבים בקו הבסיס במהלך קצב S1-S1 רצוף של 14.29 ו-16.67 הרץ, בעוד שלבבות CPVT הראו חלופות תלויות תדר.

לאחר אתגר האיזופרוטרנול, לבבות CPVT הציגו חלופות תלויות תדר ואות סידן במהלך קצב S1-S1, בעוד שלבבות מסוג בר לא הושפעו. ניתוח הפרעות קצב טכיות העלה כי הן לבבות מסוג פרא והן לבבות CPVT מפגינים הולכה תקינה במהלך קצב פרץ של 50 הרץ בנקודת ההתחלה. לאחר שפע עם איזופרוטרנול, לבבות CPVT הראו רוטורים בתדר גבוה לאחר קצב פרץ של 50 הרץ, בעוד שלבבות מסוג פרא שמרו על הולכה רגילה.

בעקבות הליך זה, סוגי אדוגנים ועכברי בר משמשים להמחשת התכונות האלקטרופיזיולוגיות והתפקודיות במודלים אלה או בהמצאת תרופות. מיפוי אופטי הוא כלי רב עוצמה לחקר הפרעות קצב לב, אולם לא ניתן להשתמש בו קלינית בשל הגבלה בצבע פלואורסצנטי תחת צימוד התכווצות העירור. עם פיתוח פלואורסצנטי המתאים למולקולת מטרה שונות תחת פיתוח טכנולוגיית חישוב מהפכה גבוהה, טכניקת מיפוי הלב האופטי חייבת להשיג רק יישומים.