מדידות כיווץ בתפוקה גבוהה של סיבי שריר עכבר שלמים המשובצים בהידרוג'ל באמצעות מערכת מבוססת אופטיקה

ניתן להעריך את תפקוד שרירי השלד על ידי כימות ההתכווצות של סיבי שריר מבודדים, באופן מסורתי באמצעות גישות מייגעות בעלות תפוקה נמוכה. במאמר זה אנו מתארים שיטה מבוססת אופטיקה בעלת תפוקה גבוהה לכימות ההתכווצות של סיבי שריר משובצים בהידרוג'ל. לגישה זו יש יישומים לסינון תרופות ופיתוח טיפולי.

פרוטוקול זה יכול לשמש להערכת ההשפעה של מוטציות גנטיות על תפקוד סיבי השריר. בנוסף, ניתן להשתמש בו למחקרי סינון תרופות שמטרתם לשפר את בריאות השרירים. טכניקה זו יכולה לשמש לבידוד ומדידת התכווצות במספר רב של סיבי שריר בפרק זמן קצר יחסית ללא צורך באימון מתקדם.

ניתן לשנות את הרכב ההידרוג'לים על מנת להעיד על השפעת רמזים סביבתיים הן בשריר בריא והן בשריר חולה. החלק המאתגר ביותר בהליך הוא הדיסקציה הראשונית של השריר. אם לא ננקט מספיק זהירות, נזק לשריר יכול להוביל לירידה בכדאיות של סיבי השריר.

מי שידגימו את ההליך יהיו ליאנדר וונק, טכנאי מחקר, ואוסמן אסן, דוקטורנט במעבדה שלי. התחל על ידי חיתוך הרגל האחורית התחתונה של העכבר המתת חסד ממש מעל הקרסול. בצע חתך על העור בצד הגבי של כף הרגל לכיוון אצבעות הרגליים.

מקלפים בזהירות את העור לכיוון אצבעות הרגליים, תוך הקפדה שלא לפגוע בשריר. הניחו את כף הרגל המנותחת בכלי מגן חותם המכיל 10 מיליליטר של תווך דיסקציה שחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. נעצו את כף הרגל דרך העור שעדיין מחובר לאצבעות הרגליים.

נעצו את הרגל התחתונה מעבר לקרסול וכרתו בזהירות את רקמת החיבור על גבי השריר. חותכים את הגיד בעקב ומרימים את השריר. חותכים לצד ומתחת לשריר דרך רקמת החיבור עד לחשיפת גידי הבוהן.

חותכים את הגידים כאשר חצי אורך של שלושה גידים נחשפים. שחררו את השריר מכף הרגל ונעצו את הגידים של שרירי ה-FDB. הסר את כל רקמת החיבור שנותרה מהשריר.

מעבירים את רקמת השריר הנקייה לצינור המכיל אמצעי דיסקציה שחומם מראש. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להעביר את שריר brevis לצינור המכיל את מדיום העיכול שריר. הניחו את הרקמה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו חמצני למשך 80 דקות.

מעבירים את השריר לצינור 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של תווך דיסקציה. בעזרת קצוות טריטורציה מוכנים, פיפטה השריר עובר מהגדול ביותר לקטן ביותר וממשיכים בטריטורציה עד שסיבי השריר יורדים מהגיד. ניתן להסיר את הגידים עם קצה P200.

מעבירים את סיבי השריר המנותקים לצינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מדיום דיסקציה. מניחים לסיבים להתיישב באינקובטור למשך 20 דקות עד להיווצרות כדור. בזהירות פיפטה כל המדיום מהחלק העליון של גלולת הסיב.

על הקרח, להשעות מחדש את התאים ב 875 מיקרוליטר של תערובת תאים לכל שריר. הוסף 125 מיקרוליטר של תערובת תאי מטריצה לתוך צינורות המכילים 125 מיקרוליטר של aliquot תרחיף התא. מערבבים על ידי pipetting עדין, הימנעות היווצרות של בועות.

מעבירים מיד את התערובת הסופית לבאר. בדוק את הכדאיות של סיבי השריר תחת המיקרוסקופ. מניחים את הג'לים באינקובטור למשך 30 עד 45 דקות כדי לקדם התמצקות.

לאחר שתסיים, הוסף בזהירות 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל באר. הפעל את מערכת מדידת ההתכווצות מבוססת האופטיקה, את מנורת הפלואורסצנט, את קוצב התא החשמלי ואת המחשב. הגדר את הממריץ החשמלי ל -1.0 הרץ ב -10 וולט עם משך פולס של חמש אלפיות השנייה כדי לעורר את סיבי השריר המבודדים.

הכניסו את הלוח למערכת המדידה. חברו את הקוצב לאינסרט והכניסו אותו לצלחת התרבית. פתח את התוכנית IonWizard.

לחץ על אישור. פתח קובץ חדש על-ידי לחיצה על סמל הקובץ ולאחר מכן לחץ על חדש. בחר Collect Experiment כדי לבדוק אם התוכנית נמצאת בסרקומרת השלד הניסויית הנכונה. כדי לשנות את הניסוי, לחץ על הניסוי הרצוי ולאחר מכן לחץ על הוסף.

החל את ההגדרות SARC 20X, קווים ממוצעים, FFT יחיד, קצב דגימה של 250 הרץ וזמן רכישה של 10 שניות. שנו את טמפרטורת מערכת המדידה ל-25 מעלות צלזיוס. לחץ על מאתר התאים הפתוח כדי ליצור חלון קופץ חדש.

בחר סוג צלחת ובארות פעילות. מקדו את הסיבים באמצעות התאמת פס מחוון המיקוד. אפשר לקצב לגרום לגירוי חשמלי ולהתבונן בעוויתות סיבים.

שמירה על הסרקומרים בפוקוס, ודא שאזור המדידה מקובע בקצה הסיב כך שהסרקומרים יפעלו אנכית. כאשר הסרקומרים ממוקדים, ניתן לראות שיא יחיד בסרגל הכלים אשר ינוע ימינה עם ההתכווצות. מדדו את הסיבים במערכת המדידה.

לחץ על התחל כדי להתחיל את הניסוי. לחץ על מקש Q כדי להתחיל למדוד 10 מעברי כיווץ. אם יותר מארבעה ארעיים נראים נטולי רעשים, קבלו את המדידה בהקשה על מקש Z.

אם הארעיים מכילים יותר מדי רעש, דחו את המדידות. לחץ על עצור כדי לסגור את חלון מאתר התאים לאחר סיום הניסוי. שמור את הקובץ וצור קובץ חדש.

פתח את שולחן העבודה CytoSolver של התוכנית, ולאחר מכן לחץ על ייבוא ובחר את הקבצים לניתוח. לאחר השלמת הניתוח, זהה את הפסגות הכחולות, האדומות והאפורות. לחץ על ייצוא.

בחר את התיבות שכותרתן ממוצע לנתונים ארעיים ויצא ל- Excel. אחוז גבוה יותר של מדידות שריר כיווץ שמישות התקבל בהידרוג'ל פיברין תלת ממדי מכיוון שהוא מנע תנועות לרוחב וגורמים משפיעים אחרים. להטמעת סיבים לא הייתה השפעה משמעותית על מהירות ההתכווצות המרבית או על קיצור הסרקומר.

התכווצות מופחתת במטריצת המרתף הטהורה נצפתה ככל הנראה עקב קשיחות ג'ל או אינטראקציה מוגברת של מטריצת תאים. באופן דומה, הטבעה של מטריצת מרתף הפחיתה גם את קיצור הסרקומר בהשוואה להידרוג'ל הפיברין. חשוב לזכור כי סיבי השריר המבודדים הם שבירים למדי ויש לנקוט משנה זהירות כדי לא לפגוע בהם במהלך פיפטינג.

לאחר הליך הבידוד, ניתן לבצע גם שיטות כגון בידוד חיסוני, חלבון ו- RNA. פיתוח טכניקה זו פתח אפשרויות חדשות לחקר תפקוד סיבי שריר בוגרים באופן תפוקה גבוהה.