Name: פריטינופגיה: הערכת פירוק סלקטיבי של ברזל על ידי אוטופגיה בפיברובלסטים אנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: למדו הערכת פיריטינופגיה בפיברובלסטים אנושיים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של פירוק ברזל ליזוזומלי ומבדילה בין מסלולי אוטופגיה תלויים ובלתי תלויים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI+proteins%3A+Essential+PtdIns3P+effectors+at+the+nascent+autophagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome.</a> Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).</li>
<li>Proikas-Cezanne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI-1%CE%B1+%28WIPI49%29%2C+a+member+of+the+novel+7-bladed+WIPI+protein+family%2C+is+aberrantly+expressed+in+human+cancer+and+is+linked+to+starvation-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy.</a> Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).</li>
<li>Bakula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI3+and+WIPI4+%CE%B2-propellers+are+scaffolds+for+LKB1-AMPK-TSC+signalling+circuits+in+the+control+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy.</a> Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).</li>
<li>Hayflick, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Propeller+protein-associated+neurodegeneration%3A+A+new+X-linked+dominant+disorder+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation.</a> Brain. 36, 1708-1717 (2013).</li>
<li>Wilson, J. A. -O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+clinical+management+guideline+for+beta-propeller+protein-associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Medicine+and+Child+Neurology%22%5BJournal%5D)">Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration.</a> Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).</li>
<li>Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+iron+metabolism+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular iron metabolism and regulation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).</li>
<li>Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+NCOA4+as+the+cargo+receptor+mediating+ferritinophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy.</a> Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).</li>
<li>Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+oxidation+and+proteasomal+degradation%3A+Protection+by+antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants.</a> Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).</li>
<li>Schüssele, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+profiling+in+single+cells+with+open+source+CellProfiler-based+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis.</a> Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).</li>
<li>Goodwin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-independent+lysosomal+targeting+regulated+by+ULK1%2F2-FIP200+and+ATG9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9.</a> Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).</li>
<li>Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCOA4-mediated+ferritinophagy%3A+A+potential+link+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).</li>
<li>Zachari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+of+mitochondria+on+a+ubiquitin-endoplasmic-reticulum+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform.</a> Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><קווי תאים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיברובלסטים אנושיים ראשוניים שמקורם בעור&nbsp;</td><td>ביופסיית עור, תורם אנושי בריא, מרפאת אוניברסיטת ביובנק T&uuml; בינגן, אישור אתי 389/2019BO2</td><td>F-CO-60, מעבר 9</td><td></td></tr><tr><td><חזק>טיפולי תרבית תאים</חזק></td><td></td><td></td><td><חזק>ריכוז סופי (תרכובת)</חזק></td></tr><tr><td>מדיום בקרה</td><td>DMEM 10% FCS</td><td></td> <td>(DMSO בלבד)</td></tr> <tr><td>מדיום בקרה + בפילומיצין A1</td><td>DMEM 10% FCS</td><td></td><td>100 ננומטר בפילומיצין A1</td></tr><tr><td>מדיום בקרה + דפרסיוקס (DFX)</td><td>DMEM 10% FCS</td><td></td><td>30 ומיקרו; מדיום שליטה M DFX</td></tr><tr><td>+ DFX + bafilomycinA1</td><td>DMEM 10% FCS</td><td></td><td>30 ומיקרו; M DFX, 100 ננומטר בפילומיצין A1</td></tr><tr><td>מדיום בקרה + ברזל אמוניום ציטראט (FAC)</td> <td>DMEM 10% FCS</td><td></td><td>0.05 מ"ג/מ"ל FAC</td></tr><tr><td>מדיום בקרה + FAC + בפילומיצין A1</td><td>DMEM 10% FCS</td><td></td><td>0.05 מ"ג/מ"ל FAC, 100 ננומטר בפילומיצין A1</td></tr><tr><td><חזק>חומר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלבומין [BSA] Fraction V</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 עז ארנב</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 עכבר עז</td><td>Life Technologies</td><td>A-11003</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>196000</td><td></td></tr><tr><td>BioLite Cell Culture מטופל בכלים בגודל 10 ס"מ</td><td>Thermo Scientific</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td>A4099</td><td></td></tr><tr><td>Deferasiox (ICL-670)</td><td>Selleckchem</td><td>S1712</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS ללא סידן או מגנזיום</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>ברזל אמוניום ציטראט (FAC)</td><td>Merck</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-פריטין (טחול אנושי)</td><td>רוקלנד</td><td>200-401-090-0100</td><td></td></tr><tr><td>LAMP2 (H4B4)</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-18822</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x Dulbecco' s</td><td>AppliChem</td><td>A0965</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (1,00U/mL פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין)</td> <td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.05%) עם פנול</td><td>אדום Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>96 באר זכוכית-תחתית #0 צלחות</td><td>Cellvis</td><td>P96-0-N</td><td></td></tr><tr><td><חזק>תמיסה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.7% פרפורמלדהיד (PFA)</td><td></td><td></td><td>PFA מומס ב-PBS, pH 7.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Bafilomycin A1 100 מ"מ מלאי</td><td></td><td></td><td>Bafilomycin A1 מדולל ב-DMSO</td></tr><tr><td>Ferric אמוניום ציטראט (FAC) 100 מ"ג/מ"ל מלאי</td><td></td><td></td><td>FAC מדולל במים מזוקקים כפולים אוטוקלאב</td></tr><tr><td>PBS/T</td><td></td><td></td><td>PBS, בתוספת 10% Tween20&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS/T + BSA</td><td></td><td></td><td>PBS, בתוספת 10% Tween20, 1% BSA&nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler 4.2.4</td><td>https://cellprofiler.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel גירסה 16.50</td><td>Microsoft Office Plus 365</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

פריטינופגיה: הערכת פירוק סלקטיבי של ברזל על ידי אוטופגיה בפיברובלסטים אנושיים

Ferritinophagy: Assessing the Selective Degradation of Iron by Autophagy in Human Fibroblasts

פיברובלסטים ראשוניים שמקורם בעור אנושי (F-CO-60) מתורמים בריאים (איור 1A) הוכנו להערכות פריטינופגיה באמצעות טיפול בפלומיצין A1 ואחריו צביעה חיסונית של פריטין אנדוגני ו-LAMP2, ניתוח תמונה אוטומטי וניתוח מבוסס CellProfiler (איור 1B).
הקולוקליזציה של פריטין אנדוגני ו-LAMP2 גדלה לאחר שהפירוק הליזוזומלי של פריטין נחסם על-ידי תוספת של בפילומיצין A1, בהתאם ליכולתו לעכב אנזימי V-ATPase ליזוזומליים, ובכך לחסום פריטינופגיה7 (איור 2). נוסף על כך, זיהוי תאים מבוסס תוכנה, כמו גם זיהוי פריטין ו-LAMP2, מוצגים כדוגמה (איור 2).
בהקשר זה, יש לציין כי צנרת CellProfiler המתוארת כאן היא רב-תכליתית ביותר וניתן להתאים אותה לקריאות נוספות ו/או חלופיות, כגון הערכת ההשפעות של מוטציות BPAN מסוימות על גדילת תאים, מיטוכונדריה או אברונים אחרים בהקשר של מערכות סמנים חד-תאיות פונקציונליות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig01.jpg"> איור 1: סקירה ניסויית. ייצוג גרפי של (A) התהליך של פריטינופגיה ו-(B) תהליך העבודה הניסיוני להערכת פריטינופגיה בפיברובלסטים אנושיים ראשוניים שמקורם בעור, כמתואר בפרוטוקול זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig02.jpg"> איור 2: תמונות מייצגות. פיברובלסטים אנושיים ראשוניים שמקורם בעור באמצעי בקרה (בתנאי אכילה) בנוכחות (A) או (B) נוכחות של bafilomycin A1 עברו ניתוח אימונופלואורסצנטי עקיף באמצעות נוגדנים אנטי-פריטין ואנטי-LAMP2, בעוד שגרעיני התא הוכתמו ב-DAPI. מוצגות תמונות פלואורסצנטיות לדוגמה שנרכשו באמצעות אוטומציה של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלית (פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר). ניתן היה להבחין בשינויים בשפע פריטין ו-LAMP2 ובקולוקליזציה עם עיכוב ליזוזומלי בעת מתן Bafilomycin A1. הניתוח מבוסס CellProfiler מוצג גם כן, ומציג את שכבות-העל של תמונה הנגזרת מתוכנה של זיהוי תאים (סגול), גרעינים (כחול), פריטין (ירוק), LAMP2 (אדום) ו-puncta של פריטין / LAMP2 (צהוב). (C) מקטעי תמונה מוגדלים (סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: הגדרות המיקרוסקופ הקונפוקלי לסריקת לייזר ששימשו במחקר זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 2: ההגדרות המספריות של CellProfiler ששימשו במחקר זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%202.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
קובץ משלים 1: צינור CellProfiler ששימש במחקר זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: הצגת צינור CellProfiler (ראה קובץ משלים 1) עם צילומי מסך שצולמו בסדר עוקב (ראה טבלה 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_.Supplemental%20FIle%202.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Mutations in the autophagy gene WDR45/WIPI4 are the cause of beta-propeller-associated neurodegeneration (BPAN), a subtype of human diseases known as ...

ferritinophagy-assessing-selective-degradation-iron-autophagy-human

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מוצג פרוטוקול לסינתזה וקטיונים של מגנטופריטין מסומם בקובלט, כמו גם שיטה למגנט במהירות תאי גזע עם מגנטופריטין קטיוני.

סינתזה של Cationized Magnetoferritin עבור המגנטיזציה אולטרה-מהירה של תאים

הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

Mitophagy, התהליך של פינוי נפגע המיטוכונדריה, הוא הכרחי עבור תחזוקה מיטוכונדריאלי הומאוסטזיס ובריאות. מאמר זה מציג חלק mitophagy האחרונה שיטות זיהוי תאים אנושיים, Caenorhabditis elegansועכברים.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

כאן מתואר פרוטוקול המאומת היטב ופשוט למדידת נפח פעילות פחמיות autophagic בתרבית של תאים. השיטה מבוססת על לכימות שחלקן של לקטט דהידרוגנאז (LDH) בחלקים תא sedimentable, לעומת סה כ רמות LDH הסלולר.

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

תכולת הידרופרוקסיד שומנים מייצגת את האינדיקטור הנפוץ ביותר למוות של תאים פרופטוטיים. מאמר זה מדגים את ניתוח ציטומטריית הזרימה שלב אחר שלב של תכולת הידרופראוקסיד שומנים בתאים עם השראת פרופטוזיס.

חשיפת הפנוטיפ הפרופטוטי של מדולובלסטומה

פרוטוקול זה מציג שיטות להערכת התפלגות וכמות שקיעת הברזל ברקמות, במיוחד במוח. הפרוטוקול מפרט את הנהלים להכנת דגימה, צביעת Perls/DAB, לכידת תמונה וניתוח נתונים.

הערכת שקיעת ברזל במוחם של עכברי 5xFAD על ידי צביעת Perls/DAB

מאמר זה מציג פרוטוקול LysoTracker של תאים חיים למדידת שיקום ליזוזומי במהלך הזדקנות בפיברובלסטים אנושיים מסוג IMR-90.

פרופילינג ליזוזומי באמצעות LysoTracker להערכה כמותית של הזדקנות תאית בפיברובלסטים אנושיים

אנו מדגימים את פרוטוקול עבור הדור של המושרה בתאי גזע pluripotent מן האדם תאים סומטיים באמצעות lentivirus בתיווך המסירה של גורמים אנושיים Oct4, Sox2, Nanog, ו Lin28. Pluripotency אושרה על ידי המורפולוגיה ואת הנוכחות של גזע עובריים (ES) סמנים ספציפיים התא.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

הטכניקה לבידוד fibroblasts פורטל מהכבד עכברוש מתואר. הם כבדי perfused ו...

הבידוד של Fibroblasts פורטל עכברוש ידי<em&gt; באתרו</em&gt; כבד זלוף

למדו הערכת פיריטינופגיה בפיברובלסטים אנושיים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של פירוק ברזל ליזוזומלי ומבדילה בין מסלולי אוטופגיה תלויים ובלתי תלויים.

פריטינופגיה: הערכת פירוק סלקטיבי של ברזל על ידי אוטופגיה בפיברובלסטים אנושיים

גלה סרטונים נוספים