Name: ראיות לכך ש- EpCAM ו- Cytokeratin מבטאים תאי אפיתל בדם אנושי תקין ובמח עצם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: למדו שיטה לבידוד תאים אפיתליים מדם ומח עצם בריאים באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה. השיטה מאפשרת ניתוח מורחב בתחומי הביולוגיה התפתחותית והתאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ג'וש מונטס, טכנאי ציטומטר זרימה במתקן הליבה, מכון הורמל
טוד שוסטר, מנהל מתקני ליבה, מכון הורמל
דרק גורדון, סטטיסטיקאי, אוניברסיטת ראטגרס
ברצוננו להודות לקארן קליין מ-Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM על עזרתה בעריכה.
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R21 AR075281, ומענק סיוע למחקר, אמנות ומלגה, משרד סגן הנשיא למחקר, אוניברסיטת מינסוטה (הצעה #324240). אנו מודים על תמיכת מכון הורמל.

<ol><li>Larsen, S. B., Cowley, C. J., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cells%3A+liaisons+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epithelial cells: liaisons of immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 62, 45-53 (2020).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281(2014).</li>
<li>Coradini, D., Casarsa, C., Oriana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+polarity+and+tumorigenesis%3A+New+perspectives+for+cancer+detection+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell polarity and tumorigenesis: New perspectives for cancer detection and treatment.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 32 (5), 552-564 (2011).</li>
<li>Dmello, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+role+of+keratins+in+epithelial+cell+differentiation+and+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Multifaceted role of keratins in epithelial cell differentiation and transformation.</a> Journal of Biosciences. 44 (2), 33(2019).</li>
<li>Poulet, G., Massias, J., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy%3A+General+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cytologica%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy: General concepts.</a> Acta Cytologica. 63 (6), 449-455 (2019).</li>
<li>Eslami-S, Z., Cortés-Hernández, L. E., Alix-Panabières, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule%3A+an+anchor+to+isolate+clinically+relevant+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule: an anchor to isolate clinically relevant circulating tumor cells.</a> Cells. 9 (8), 1836(2020).</li>
<li>Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+quintessential+precision+oncology+presenting+challenges+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: quintessential precision oncology presenting challenges for biology.</a> NPJ Precision Oncology. 1 (1), 16(2017).</li>
<li>Lin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+biology+and+clinical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: biology and clinical significance.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 404(2021).</li>
<li>Spence, M., Adai, S., Landon, T., Richter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Few+and+far+between%3A+Tools+and+strategies+for+rare-event+detection+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22BioprobesJournal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Few and far between: Tools and strategies for rare-event detection using flow cytometry.</a> BioprobesJournal of Cell Biology. 71, 14-18 (2015).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> Journal of Cell Biology. 192 (3), 373-382 (2011).</li>
<li>Ye, Q., Ling, S., Zheng, S., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy+in+hepatocellular+carcinoma%3A+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy in hepatocellular carcinoma: circulating tumor cells and circulating tumor DNA.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 114(2019).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+epithelial+cells+and+hair+follicle+stem+cells+contribute+to+development+of+chronic+cutaneous+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms.</a> Nature Communications. 9 (1), 5293(2018).</li>
<li>Marsman, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cells+in+bone+marrow%3A+do+they+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Epithelial cells in bone marrow: do they matter.</a> Gut. 54 (12), 1821-1822 (2005).</li>
<li>Borue, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+cells+contribute+to+epithelial+engraftment+during+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">marrow-derived cells contribute to epithelial engraftment during wound healing.</a> The American Journal of Pathology. 165 (5), 1767-1772 (2004).</li>
<li>Chakrabarti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+cells+contribute+to+the+maintenance+of+thymic+stroma+including+TECs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">marrow-derived cells contribute to the maintenance of thymic stroma including TECs.</a> Journal of Immunology Research. 2022, 6061746(2022).</li>
<li>Krause, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-organ%2C+multi-lineage+engraftment+by+a+single+bone+marrow-derived+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell.</a> Cell. 105 (3), 369-377 (2001).</li>
<li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cell+replacement+with+bone+marrow+cells+for+airway+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Targeted cell replacement with bone marrow cells for airway epithelial regeneration.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L740-L752 (2007).</li>
</ol>

לא ידוע על ניגודי עניינים.

ישנן עדויות בספרות לנוכחות תאי אפיתל במוח העצם. בעבר, מאמרים חקרו בדרך כלל את תפקידם של תאי אפיתל בהקשר של מחלות ופציעות, כגון בכבד, ריאות, מערכת העיכול (GI), בלוטת התימוס ועור14,15,16,17. עם זאת, לא הרבה ידוע על נוכחותם של תאי אפיתל אלה במוח העצם של אנשים בריאים. מאמר זה מבקש לבסס שיטה הניתנת לשחזור, במטרה לזהות ולבודד תאי אפיתל מדם וממח עצם תקינים. שיטה זו תניע את התחום קדימה כדי לזהות מדוע תאי אפיתל נמצאים ומה תפקידם בדם ובמח העצם בהיעדר מחלה; אולי תאים אלה הם חלק מתחזוקה נורמלית של רקמות או מופעלים בעתות פציעה. מח העצם הוא מאגר של תאי גזע; עם זאת, לא ברור מה השושלת של תאי אפיתל אלה עשוי להיות. מאמר שפורסם לאחרונה דן בתאי אפיתל שמקורם במח עצם בבלוטת התימוס, המבטא תחילה את EpCAM ואת הסמן ההמטופויטי CD45, ולאחר מכן מאבד את ביטוי CD45 שלו עם הזמן לאחר פציעה15. מחקר מהמעבדה שלנו אישר גם את נוכחותם של תאי CD45+ EpCAM+ בתוך דם בריא ומח עצם בהיעדר פציעה12. עם זאת, תפקידם של תאים אלה טרם נקבע.
היה צורך בשיטה ניתנת לשחזור לבדיקת תאי אפיתל בתוך מח העצם הבריא. השיטה המתוארת תסייע באפיון תאים אלה עוד יותר במצבם הרגיל. ישנם שלבים חשובים בשיטה זו כדי לשמור על יכולת השחזור. אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הוא שמירה על סביבה סטרילית במכסה המנוע בזמן קצירת מח העצם מעכברים. אם קוצרים מעכברים מרובים, נמנע זיהום צולב בין דגימות על ידי שימוש במחטים ומזרקים חדשים לכל עכבר. זה גם מבטיח שהדגימה נקייה וללא מזהמים שעלולים להשפיע על התוצאות. בנוסף, יש להגדיל את מספר המזרקים המוכנים וצינורות חרוטיים מסומנים עבור כל עכבר נוסף. צעד חשוב נוסף כרוך בשטיפת העצמות עד לקבלת צבע לבן נקי כדי להבטיח שרוב תאי מח העצם הוסרו; הסיכוי לגילוי תאים נדירים עולה בדגימה טהורה יותר. בוצע שינוי כדי לייעל את פרוטוקול הליזה של תאי הדם האדומים; מספר חוצצי ליזה נבדקו כדי למצוא את החוצץ הנכון שנתן כדאיות גבוהה באופן עקבי, מכיוון שכמעט מחצית התאים אבדו במהלך שלב זה. ייתכן שיהיה צורך למטב ריאגנטים שונים ותקופות דגירה שונות לקבלת תוצאות משופרות בסביבות אחרות.
המגבלה המשמעותית ביותר של פרוטוקול זה היא שימוש בציטומטריית זרימה למציאת אוכלוסיות תאים נדירות. כפי שנדון קודם לכן, תוספת של פקדים וספירות מצטברות מסייעת להגדיל את הספציפיות והדיוק של הניתוח. מגבלה נוספת היא שיש לזהות מראש סמנים מתאימים לאוכלוסייה המעוניינת בהם. לכן, יש לדעת על סמנים מרכזיים, נוגדנים עבור cytometry זרימה, ונוגדנים תואמים למין היעד.
שיטות אלה מהוות שיפור לעומת השיטות הקיימות מכיוון שהן מאפשרות ניתוח תא בודד בשבריר מהעלות של מבודד CTC אוטומטי קיים וריצוף RNA של תא בודד. בנוסף, ציטומטריית זרימה זמינה יותר. FACS שמר על כדאיות גבוהה יותר עבור התאים בהשוואה לתוצאות שדווחו בעבר באמצעות הפרדת מיקרו-כדוריות מגנטיות. לבסוף, טכניקות אלה מאפשרות הפרדת תאים לצורך ניתוחים במורד הזרם, כגון ריצוף RNA בתפזורת, ריצוף scRNA או תרבית תאים.

תאי אפיתל נמצאים במחסומים הפיזיים בין גופנו לסביבה ומסוגלים לזהות ולהגיב לשינויים במיקרו-סביבה שלהם1. יש להם נישה מתפשטת של תאי גזע המספקת דרך להפוך רקמות חדשות ולתקן נזק2. המעבדה שלנו חוקרת תאי גזע בזקיקי השיער של העור; העור הוא מודל טוב לחקר רקמת אפיתל והתפשטות תאי גזע מכיוון שהוא נראה בקלות ויש תחלופה מתמדת של תאים. סרטן אפיתל הוא הצורה הנפוצה ביותר של סרטן, אולי בשל רקמות אפיתל, כגון העור, להיות קו ההגנה הראשון מפני מסרטנים סביבתיים, המוביל שיעורי תחלופה גבוהים ואת התפשטות תאי אפיתל3. רוב האפידרמיס של העור, שכבת ההגנה העליונה, מורכב מקרטינוציטים, המבטאים סוגים שונים של קרטינים כדי לספק תמיכה ומבנה4. לחולים עם סרטן אפיתל יש לעתים קרובות תאי אפיתל נוכחים בדם ובמח העצם שלהם המבטאים גם קרטינים. ביופסיות נוזליות הן דרך לא פולשנית לזהות ולנטר תאי אפיתל אלה בנוזלי גוף שונים5. תאי אפיתל במחזור, הנקראים גם תאי גידול במחזור הדם (CTCs), נמצאים בדם היקפי ויכולים להיות סמנים ביולוגיים לפרוגנוזה של סרטן, כמו גם להנחות טיפולים פרטניים. CTCs יכולים גם להצביע על התקדמות המחלה, יעילות הטיפול, ואת הישרדות החולה הכוללת 5,6.
מולקולת היצמדות תאי אפיתל (EpCAM) היא סמן המשמש קלינית עבור CTCs ויכולה לזהות גידולים ממקור אפיתל בחולי סרטן. EpCAM ממלא תפקיד בהידבקות, נדידה, איתות, התרבות והתמיינותשל תאים 6. כדי שתא אפיתל במחזור הדם יסווג כ-CTC, עליו להיות חיובי עבור ציטוקרטינים 8, 18 ו-19, ושלילי עבור CD45, סמן לויקוציטים נפוץ6. CTCs מזוהים בדרך כלל על ידי דלדול CD45 הראשון עם microbeads מגנטיים, ואחריו בדיקות עבור EpCAM ו cytokeratin 19 באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence7. המגבלה העיקרית בזיהוי CTCs היא נדירותם; הם מהווים פחות מ -0.01% מכלל התאים בדם, ומעטים מאוד שורדים במחזור הדם ומגיעים לאיברים מרוחקים 8,9,10. יש לקחת בחשבון בתכנון ניסויים וטכניקות לבידוד וזיהוי תאים אלה בשל אופיים הנדיר. נכון לעכשיו, יש רק ממיין חד-תאי אוטומטי אחד שאושר על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) המשמש לזיהוי CTCs, והוא משתמש ב-EpCAM כסמן הביולוגי שלו. שיטות אחרות כוללות הפרדת חרוזים מגנטית וציטומטריית זרימה, או שילוב של שיטות אלה. יש צורך בטכניקות חדשות בעלות רגישות וספציפיות גבוהות יותר לאיתור CTCs נדירים11.
ציטומטריית זרימה היא שיטה מועדפת לאיתור אוכלוסיות תאים נדירות בדם, מח עצם ודגימות רקמה אחרות. תאים נדירים אלה יכולים לכלול תאי גזע, תאי אנדותל במחזור, CTCs ותאי מחלה שיורית. ציטומטריית זרימה מאפשרת מדידות כמותיות של כל סוג תא וממיינת תאים אלה לבדיקות נוספות 7,9. ספירות מצטברות בוצעו כדי להבטיח הערכה מדויקת של תאים נדירים אלה. היכולת להשתמש gating כדי להוציא תאים מניתוח נוסף היא דרך להגדיל את הספציפיות בעת ניתוח תאים. מגבלות ציטומטריית הזרימה הן הזמן הדרוש לניתוח דגימות גדולות והיעדר אישור חזותי לזהות התא. כדי להתגבר על כך, מיקרוסקופ immunofluorescence בוצע על התאים ממוינים כדי לאשר את זהותם.
בעבר הראתה המעבדה שלנו כי בעכברים תאי מח העצם מגויסים ותורמים לגידולי עור12. תאים אלה שמקורם במח העצם חיוביים עבור pan-cytokeratin ו cytokeratin. כדי להבהיר עוד יותר את תפקידם של תאי גזע אפיתליאליים, תאים שמקורם במח עצם ותאים המבטאים ציטוקרטין בהתקדמות הגידול, חיפשו תאים חיוביים לציטוקרטין מסוג EpCAM+ בדגימות דם ומח עצם רגילות ודם אנושי. כמו ברוב הניסויים, שיטה זו פותחה באמצעות חזרות מרובות. בעבר, עכברים טרנסגניים שימשו יחד עם ספירות מצטברות כדי לחפש תאים המבטאים K14GFP במח העצם12. ככל שנספרו יותר תאים, ניתן היה לזהות אוכלוסייה מייצגת של תאים נדירים, כפי שניתן לראות באיור 1 בסעיף התוצאות המייצגות. הרציונל לחקר תאי אפיתל בדם תקין ובמח עצם התבסס על ספרות מוקדמת על CTCs, שם לתורמים בריאים נורמליים היו רמות רקע של תאי EpCAM+13. כאמור, אפיון EpCAM מתחיל לעתים קרובות עם דלדול CD45. שלב זה הושמט מכיוון שלחלק מהתאים ההמטופויטיים יש ביטוי EpCAM וציטוקרטין מסיבות לא ידועות שיש לחקור עוד. לכן, התאים מוינו על בסיס נוכחות או היעדר EpCAM, ללא קשר לשושלת התא, ולאחר מכן הוכתם חיסון עבור ציטוקרטין. הפרוטוקול שלהלן וזרימת העבודה שמוצגת באיור 2 מתארים שיטה שמשתמשת בציטומטריית זרימה עם פיצוי ובקרות, שיטות סטטיסטיות והדמיית אימונופלואורסצנטיות כדי לבודד ולזהות את האוכלוסיות הנדירות האלה של תאי אפיתל.

<table><tbody><tr><td>40 &mu; m מסננת תאים</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>משמש לסינון כל גושי תאים גדולים ממח העצם</td></tr><tr><td>5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול</td><td>צינורות 352054 פלקון</td><td></td><td>המשמשים לזרימה ציטומטריה</td></tr><tr><td>500 מ"ל צנצנת עם מכסה</td><td>Nalgene</td><td>11-823-32</td><td>משמש לשטיפת העכבר</td></tr><tr><td>190 הוכחה אתנול</td><td>Decon laboratories Inc</td><td>2801</td><td>מדולל ל-70% עם dH2O</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עיזים נגד ארנב IgG (H+L)</td> <td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>דילול: 1:1000</td></tr><tr><td>Brightline Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-10</td><td>משמש לספירת תאים חיים</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td>רכיב של מדלל נוגדנים</td></tr><tr><td>מאפיין סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>רכיב של מאגר צביעה ותמיסת קציר</td></tr><tr><td>ספוגי גזה Curity</td><td>Covidien</td><td>2187</td><td>משמש לשמירה על אזור עבודה נקי בעת קצירת גפיים ומח עצם</td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים</td><td>Miltex</td><td>18-784</td><td>משמש במהלך הקציר</td></tr><tr><td>ציטוקרטין, הקרנה בספקטרום רחב</td><td>Dako</td><td>Z0622</td><td>דילול 1:750 *כעת הופסק</td></tr> מי <tr><td>מלח פוספט חוצץ של Dulbecco (DPBS 1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144 500 מ"ל</td><td>משמש לעצירת תגובת הליזיס של תאי הדם האדומים</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E9884-100G</td><td>בשימוש ב-0.5 M&nbsp;</td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td>רכיב של תמיסת הקציר</td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS 1x)</td> <td>Gibco</td><td>14175-095 500 מ"ל</td><td>רכיב של תמיסת קציר ותמיסת חיץ מכתים</td></tr><tr><td>קצה Luer-Lok מזרק 10 מ"ל</td><td>Becton, Dickinson and Co</td><td>309604</td><td>משמש עם מחט 26G לשטיפת עצמות, משמש עם מחט 20G לפירוק גושים</td></tr><tr><td>מגע קסם 2 דלי</td> <td>קרחBelArt</td><td>M16807-2001</td><td>משמש לאחסון הדגימות על קרח</td></tr><tr><td>חלב יבש ללא שומן</td><td>Apex</td><td>20-241</td><td>רכיב של נוגדנים מדלל</td></tr><tr><td>סרום סוס רגיל</td><td>וקטור</td><td>ZE0122</td><td>רכיב של נוגדנים מדלל</td></tr><tr><td>PE אנטי אנושי CD 326 (EpCAM)</td> <td>Biolegend</td><td>324206</td><td>דילול: 5 ומיקרו; l ב-100 ומיקרו; l לכל 1x106 תאים</td></tr><tr><td>PE נגד עכבר CD 326 (EpCAM)</td> <td>Biolegend</td><td>118205</td><td>דילול: 3 ומיקרו; l ב-100 ומיקרו; l לכל 1x106 תאים</td></tr><tr><td>PE עכבר IgG2b, &kappa; בקרת איזוטיפ</td><td>Biolegend</td><td>400313</td><td>דילול: 1 ומיקרו; l ב-100 ומיקרו; l לכל 1x106 תאים</td></tr><tr><td>PE חולדה אנטי אנושי CD49f</td><td>BD Biosciences</td><td>555763</td><td>דילול: 20 ומיקרו; l ב-100 ומיקרו; l לכל 1x106 תאים</td></tr><tr><td>PE חולדה IgG2am, &kappa; בקרת איזוטיפ</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td>דילול: 1 ומיקרו; l ב-100 ומיקרו; l לכל 1x106 תאים</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילן 50 מ"ל</td><td>Basix</td><td>14-955-240</td><td>בשימוש בצנטריפוגה</td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Scrub</td><td>Aplicare</td><td>82-227</td><td>חומר חיטוי המשמש לעיקור העכברים</td></tr><tr><td>מחט PrecisionGlide 20G x 1 1/2</td><td>מחט Becton, Dickinson and Co</td><td>305176</td><td>20G המשמשת לפירוק גושי מח עצם</td></tr><tr><td>מחט PrecisionGlide 26G x 1/2</td><td>בקטון, דיקינסון ושות</td>' <td>305111</td><td>מחט 26G המשמשת לשטיפת מח עצם מעצמות</td></tr><tr><td>PTFE שקופיות מודפסות</td><td>שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>63422-06</td><td>8 באר שקופיות תאים ממוינים לאימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>RBC מאגר ליזה 10X</td><td>Invitrogen</td><td>00-4300-54</td><td>דילול 1:10 באמצעות מים סטריליים דה-יונים</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>Roboz</td><td>RS-6762</td><td>בשימוש במהלך הקציר</td></tr><tr><td>להב כירורגי מנירוסטה #4</td><td>Bard-Parker</td><td>371222</td><td>בשימוש במהלך הקציר</td></tr><tr><td>מגש סטרילי</td><td>כלי קוטב</td><td>10F</td><td>בשימוש במהלך הקציר</td></tr><tr><td>כפפות בדיקת ניטריל ללא אבקה StretchEase Denville</td><td>Scientific</td><td>G4161</td><td>בשימוש במהלך הקציר</td></tr><tr><td>ידית אזמל כירורגית #4</td><td>פישר</td><td>12-000-164</td><td>בשימוש עם להב כירורגי</td></tr><tr><td>TBS 20x</td>רכיב <td>תרמו</td><td></td><td>של TBST, בשימוש ב-1X</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>משמש לספירת תאים מתים. מסונן עם 0.45 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500mL</td><td>רכיב של פינצטה TBST</td></tr><tr><td></td><td>Miltex</td><td>6-8</td><td>בשימוש במהלך הקציר</td></tr><tr><td>Vectashield Vibrance Antifade מדיום הרכבה עם DAPI</td><td>Vector</td><td>H-1800</td><td>כתם גרעיני לאימונופלואורסצנציה</td></tr></tbody></table>

ראיות לכך ש- epcam ו- cytokeratin מבטאים תאי אפיתל בדם אנושי תקין ובמח עצם

Evidence for EpCAM and Cytokeratin Expressing Epithelial Cells in Normal Human and Murine Blood and Bone Marrow

תאי אפיתל זוהו בדם ובמח העצם של חולי סרטן ומחלות אחרות. עם זאת, נוכחות של תאי אפיתל נורמליים בדם ובמח העצם של אנשים בריאים עדיין לא זוהתה באופן עקבי. מוצגת כאן שיטה הניתנת לשחזור לבידוד תאי אפיתל מדם וממח עצם אנושיים ומורינים בריאים (BM) באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אימונופלואורסנציה (IF). תאי אפיתל אצל אנשים בריאים זוהו ובודדו לראשונה באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות מולקולת היצמדות תאי אפיתל (EpCAM). תאי EpCAM+ אלה אושרו כמבטאים קרטין באמצעות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי בעכברים טרנסגניים Krt1-14;mTmG. בדגימות דם אנושיות היו 0.18% ± 0.0004 תאי EpCAM+ (SEM; n = 7 משכפלים ביולוגיים, 4 שכפולים ניסיוניים). ב-BM אנושי, 3.53% ±-0.006 (SEM; n=3 העתקים ביולוגיים, 4 שכפולים ניסיוניים) של תאים חד-גרעיניים היו EpCAM+. בדם עכברים, תאי EpCAM+ היוו 0.45% ± 0.0006 (SEM; n=2 משכפלים ביולוגיים, 4 משכפלים ניסיוניים), ובעכבר BM, 5.17% ± 0.001 (SEM; n=3 משכפלים ביולוגיים, 4 שכפולים ניסיוניים) היו EpCAM+. בעכברים, כל תאי EpCAM+ היו תגובתיים חיסונית לפאן-ציטוקרטין, כפי שנקבע במיקרוסקופ IF. התוצאות אושרו באמצעות Krt1-14;mTmG עכברים טרנסגניים, עם נמוך (8.6 תאי GFP+ מקוריים לכל 106 תאים מנותחים; 0.085% של תאים קיימא), אבל מספרים משמעותיים (p < 0.0005) של תאי GFP+ נוכחים BM מורין נורמלי, שלא היו תוצאה של אקראיות בהשוואה לבקרות שליליות מרובות. יתר על כן, תאי EpCAM+ בדם עכברים היו הטרוגניים יותר מאשר תאי CD45+ (0.58% ב- BM; 0.13% בדם). תצפיות אלה מסיקות כי תאים המבטאים חלבוני ציטוקרטין ניתנים לזיהוי באופן שניתן לשכפל בקרב תאים חד-גרעיניים מדם אנושי ודם מורין ו-BM. אנו מדגימים שיטה של קצירת רקמות, ציטומטריית זרימה וצביעת מערכת החיסון שניתן להשתמש בה כדי לזהות ולקבוע את תפקודם של תאי אפיתל פאן-ציטוקרטין אלה אצל אנשים בריאים.

באמצעות שיטות אלה הודגמו אוכלוסיות נדירות של תאי אפיתל בדם ובמח העצם של בני אדם ועכברים רגילים. עם הפיצויים והבקרות המתאימים כפי שתואר, התוצאות באופן עקבי שהראו 4%-5% מהתאים במח העצם של מורין היו EpCAM+, ללא קשר למספר התאים שנספרו, כפי שמוצג באיור 4 ובאיור 5. בדגימות דם מורין, פחות מ-0.5% מהתאים היו מסוג EpCAM+, כפי שמוצג באיור 6. בדגימות מח עצם אנושיות, 2%-5% מהתאים היו EpCAM+, כפי שמוצג באיור 7 ובאיור 8. בעוד 2%-5% הוא טווח גדול, האחוזים בתוך כל תורם בודד היו עקביים ככל שיותר תאים נספרו. בדגימות דם אנושיות, כ-0.3% מהתאים היו EpCAM+, כפי שמוצג באיור 9. דגימות הבקרה שלנו (ללא כתמים, בקרת איזוטיפ ו-FMOs) הניבו מעט מאוד תוצאות חיוביות כוזבות של EpCAM+, כפי שניתן לראות באיור 4 ובאיור 7. תאים מקבוצות EpCAM+ ו-EpCAM שמוינו לשקופיות הראו צביעה חיובית עבור pan-cytokeratin בדגימות EpCAM+, והיו שליליים עבור pan-cytokeratin בדגימות EpCAM, כפי שמוצג באיור 10. תוצאות אלה מצביעות על כך שהניסויים תוכננו כראוי וניתנים לשחזור.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig01.jpg"> איור 1: Krt14Cre;mTmG עכברים טרנסגניים עם ספירה מצטברת של מח עצם. מח העצם של עכברי Krt1-14;mTmG נספרו בהדרגה. תאים חיוביים ל-GFP מצביעים על ביטוי קרטין 14 וזוהו באמצעות ציטומטריית זרימה. ככל שנספרו יותר תאי מח עצם, אוכלוסיית תאי קרטין 14 חיובית זו הייתה קלה יותר לזיהוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig02.jpg"> איור 2: זרימת עבודה עבור תאי EpCAM+ וציטוקרטין+. מח העצם ותאי הדם מוינו תחילה באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) כדי להפריד בין תאי EpCAM+ ו- EpCAM. תאים אלה מוינו לשתי מבחנות שונות, וכן לשתי שקופיות שונות. התאים שמוינו למבחנות סובבו על שקופיות באמצעות ציטוצנטריפוגה. לאחר מכן הוכתמו השקופיות באמצעות נוגדן ראשוני מסוג pan-cytokeratin, ולאחר מכן הוכתמו בנוגדן משני. השקופיות נותחו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצפות בביטוי פאן-ציטוקרטין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig03.jpg"> איור 3: תוכנה לניתוח ציטומטריה של זרימה. בעת ניתוח נתוני ציטומטריית זרימה באמצעות תוכנת ניתוח, בקרת ללא כתמים משמשת לבחירת התאים המעניינים. תאים נבחרים תחילה באמצעות SSC-A ו- FSC-A, המציגים את המורכבות הפנימית והגודל של התאים. (A) שער מצולע משורטט סביב התאים. (B) תאים בודדים נרכשים על ידי gating SSC-A על ידי SSC-W. (C) תאים חיים נרכשים על-ידי gating FSC-A לעומת DAPI. (D) תאים שליליים של EpCAM אינם נכללים על-ידי מעבר מימין לתאים השליליים של EpCAM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig04.jpg"> איור 4: ניתוח ציטומטרי של זרימה של תאי EpCAM+ במוח עצם של עכבר. בקרות ללא כתם, איזוטיפ ו-FMOs מוצגות בחלונית העליונה, כאשר הספירות המצטברות של 50,000, 100,000 ו-500,000 תאים מוצגות בחלונית התחתונה. תרשימים אלה ממחישים את העקביות באחוזים בין ספירות, למרות הגידול הכולל בסך התאים שנספרו. הלוחות מימין מציינים את אסטרטגיית ה-gating, כפי שנידונה קודם לכן בסעיף ניתוח ציטומטריית זרימה וכפי שמוצג באיור 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig05.jpg"> איור 5: תאי EpCAM+ במח עצם של עכבר מהווים 5.17% ±-0.001% מהאוכלוסייה. תאי מח העצם של שלושה עכברים בודדים נותחו. הבקרות המתאימות נכללו לצורך קפדנות מדעית נאותה. אחוז התאים החיוביים נשאר עקבי בין הדגימות, בשל היותם של העכברים זהים גנטית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig06.jpg"> איור 6: תאי EpCAM+ בדם עכברים מהווים 0.45% ±-0.0006% מהאוכלוסייה. תאי הדם של שני עכברים בודדים נותחו. הבקרות נכללו כדי להראות שההליך הנכון בוצע כדי להפיק תוצאות חד משמעיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig07.jpg"> איור 7: ניתוח ציטומטרי של זרימה על מח עצם אנושי EpCAM+. פקדים ללא כתם, איזוטיפ ו- FMOs מוצגים בלוח העליון, והספירות המצטברות של 50,000, 100,000 ו- 500,000 תאים מוצגות בחלונית התחתונה. תרשימים אלה ממחישים את העקביות באחוזים בין ספירות, למרות הגידול הכולל של סך התאים שנספרו. הלוחות מימין מציינים את אסטרטגיית ה-gating, כפי שנידונה קודם לכן בסעיף ניתוח ציטומטריית זרימה וכפי שמוצג באיור 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig08.jpg"> איור 8: תאי EpCAM+ במח עצם אנושי מהווים 3.53% ±-0.006% מהאוכלוסייה. שלוש דגימות שונות של מח עצם אנושי נותחו. נכללו בקרות מתאימות לקפדנות מדעית. אחוז התאים החיוביים משתנה עקב הטרוגניות גנטית בקרב בני אדם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig09.jpg"> איור 9: תאי EpCAM+ של דם אנושי מהווים 0.18% ±-0.0004% מהאוכלוסייה. שלוש דגימות דם אנושיות שונות נותחו. נכללו בקרות מתאימות לקפדנות מדעית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig09large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig10.jpg"> איור 10: אימונופלואורסנציה של שקופיות EpCAM+ ו-EpCAM. FACS שימש להפרדת תאי EpCAM+ ו- EpCAM. Pan-cytokeratin הוכתם על שימוש בנוגדן DAKO pan-cytokeratin. לא נעשה שימוש בבקרת נוגדנים ראשונית בסרום רגיל, שכן הפאן-ציטוקרטין הוא נוגדן רב-שבטי. תוצאות אלה מאשרות את הדיוק של FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="3">מח עצם אנושי או דם</td>
		</tr><tr><td>נוגדן</td>
			<td>צינור #</td>
			<td># של תאים</td>
			<td>א.ב. קונק</td>
		</tr><tr><td>לא מוכתם</td>
			<td>1</td>
			<td>1x106</td>
			<td>X</td>
		</tr><tr><td>DAPI בלבד</td>
			<td>2</td>
			<td>1x106</td>
			<td>1uL/מ"ל</td>
		</tr><tr><td>בקרת איזוטיפ PE</td>
			<td>3</td>
			<td>1x106</td>
			<td>1 uL</td>
		</tr><tr><td>בקרת כתמים יחידה CD49f-PE</td>
			<td>4</td>
			<td>1x106</td>
			<td>20 uL ב-100uL לכל 1x106</td>
		</tr><tr><td>EpCAM-PE טיטרציה נמוכה</td>
			<td>5</td>
			<td>1x106</td>
			<td>3 uL ב-100uL לכל 1x106</td>
		</tr><tr><td>EpCAM-PE טיטרציה בינונית</td>
			<td>6</td>
			<td>1x106</td>
			<td>4 uL ב-100uL לכל 1x106</td>
		</tr><tr><td>EpCAM-PE טיטרציה גבוהה</td>
			<td>7</td>
			<td>1x106</td>
			<td>5 uL ב-100uL לכל 1x106</td>
		</tr><tr><td>מיון גבוה של EpCAM-PE בשקופיות</td>
			<td>8</td>
			<td>10x106</td>
			<td>50 uL ב 1 מ"ל</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: לוח צביעת ציטומטריה זרימה. דוגמה ללוח צביעת ציטומטריה של זרימה עבור תאים חד-גרעיניים של דם או מח עצם. הבקרות הכלולות הן DAPI בלבד, בקרה לא מוכתמת ובקרת כתמים יחידה PE (PE-CD49f שימש כבקרה חיובית טובה יותר). פלואורסצנטיות פחות אחת אינה כלולה בלוח זה מכיוון שהיא רק צבע יחיד (PE). בעת הוספת צבעים פלואורופוריים נוספים, כגון פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) או אלופיקוציאנין (APC), יש לכלול FMOs על ידי אי הכללת פלואורופור אחד עבור כל בקרת FMO.
קובץ משלים 1: ספירת תאים חיים באמצעות המטוציטומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/Suppli-1_65118.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

מאמר זה מציג שיטה הניתנת לשחזור עם ממצאים חדשים על נוכחות תאי אפיתל בדם ובמח עצם תקינים של בני אדם ועכברים באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי. Krt1-14;mTmG עכברים טרנסגניים שימשו כשיטת in vivo כדי לאשר ממצאים אלה.

ראיות לכך ש- EpCAM ו- Cytokeratin מבטאים תאי אפיתל בדם אנושי תקין ובמח עצם

Epithelial cells have been identified in the blood and bone marrow of patients with cancer and other diseases. However, the presence of normal epithelial ...

טכניקה זו מדגימה שיטה הניתנת לשחזור לבידוד תאי אפיתל הנמצאים בדם ובמח העצם של אנשים בריאים לשימוש לניתוח נוסף במורד הזרם. טכניקה זו מאפשרת בידוד של תאי אפיתל בשבריר מהעלות של בידוד אוטומטי של תאי גידול במחזור בגלל הנגישות של ציטומטריית זרימה. לשיטה זו יכולות להיות השלכות בביולוגיה התפתחותית ובביולוגיה של תאי גזע ובטיפולים רגנרטיביים.זה יכול לשמש גם כדי ללמוד ריפוי פצעים ותחזוקת רקמות ברקמות אפיתל. העצמות קטנות מאוד ושבריריות ולכן יש לטפל בזהירות כדי למנוע הצמדה או איבוד של העצמות. מח העצם יציב יחסית, כך שניתן לעבוד לאט ובזהירות כדי להבטיח קציר תקין.כדי להתחיל, מניחים את העכבר במיכל של 500 מיליליטר ומוסיפים מספיק יוד כדי לכסות מחצית מהעכבר. נערו וערבלו בעדינות את המיכל כדי להבטיח כיסוי יסודי. לאחר מכן יש לשטוף במים נטולי יונים.בצע שטיפת יוד אחת נוספת ולאחר מכן שתי שטיפות עם 70% אתנול. הכנס את העכבר למכסה מנוע והנח אותו על גבו על המגש. תפוס את הרגליים האחוריות ומשוך אותן זו מזו עד שמורגש פיצוץ.בצע חתך של סנטימטר אחד על העור של העכבר ליד אזור המפשעה. הכנס זוג מספריים סגור לתוך החתך ופתח את המספריים מתחת לעור כדי להפריד אותו מהצפק. חותכים את העור ברגל סביב הירך, ואז חותכים את העור במורד הרגל כדי לחשוף את השרירים והעצמות.לפני חיתוך הרגל האחורית, יש למשש את עצם הירך כדי לכוון במדויק את המספריים ולמנוע חתכים בעצם הירך שבה נמצא רוב מח העצם. לאחר מכן הסר את הרגליים האחוריות על ידי חיתוך סביב מפרק הירך מבלי לחתוך דרך עצם הירך. הניחו את הגפיים בצינור המסומן בגפיים.לאחר מכן, הסר את השרירים, הרקמה והשומן לאורך אחת הגפיים על ידי חיתוך במקביל לעצם באמצעות מספריים. לאחר מכן השתמש באזמל כדי להסיר בזהירות את כל השומן או השריר שנותרו על ידי ביצוע תנועת גירוד בניצב לעצם. לאחר ניקוי נכון של העצם, יש להפריד בין עצם הירך לעצם השוקה בברך.לאחר מכן השתמש באזמל כדי לבצע חתכים בשני הקצוות של עצם הירך והשוקה, היכן שאין מח עצם גלוי. הכנס את המזרק והמחט שהוכנו מראש לתוך העצם. אם יש התנגדות, חותכים את קצה העצם עד שלא תיתקלו בהתנגדות נוספת.החזיקו את העצם בחוזקה מעל הצינור המסומן כמח עצם והזריקו את תמיסת קצירת מח העצם לתוך העצם. לאחר מכן לשטוף את מח העצם לתוך הצינור. חזור על הפעולה עבור הקצה השני של העצם כדי לאסוף את שאר מח העצם עד שהעצם נראית לבנה לחלוטין או ריקה.באמצעות מזרק ריק של 10 מיליליטר ומחט 20G, שוברים את גושי מח העצם בצינור על ידי משיכת מח העצם למעלה ולמטה במזרק חמש עד 10 פעמים. הוסף מסנן 40 מיקרון לצינור צנטריפוגה נקי של 50 מיליליטר ושטוף אותו במיליליטר אחד של תמיסת קציר מח עצם. סנן את מח העצם דרך המסנן כדי להסיר את הגושים שנותרו.לאחר מכן תייגו את מח העצם המסונן בצינור. אחסנו את מח העצם המסונן במקרר או על קרח עד לשימוש באותו היום. צנטריפוגה את תאי מח העצם ב 170G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לשאוב ולהשליך את הסופר-נטנט. להשעות מחדש את התאים ב 10 מיליליטר של אחד x חיץ דם אדום ליזה לדגור במשך ארבע דקות. לאחר מכן הוסיפו 30 מיליליטר של מלח חוצץ פוספט של דולבקו כדי לעצור את התגובה של חיץ הליזיס.צנטריפוגו את התאים למשך שמונה דקות בטמפרטורה של 170 גרם בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש ב-10 עד 20 מיליליטר של חיץ מכתים. ראשית, חלקו את התאים לצינורות המסומנים בנפרד בהתבסס על לוח הצביעה בו נעשה שימוש, כולל בקרות פיצוי.הכינו בקרות לא מוכתמות ובקרי איזוטופים כדי לחסום כתמים לא ספציפיים. עבור כל פלואורה ארבע, הוסף בקרת כתמים אחת וגם הוסף פלואורסצנטיות פחות פקד אחד בשילוב עם ארבע פלואורה הנותרות. לאחר מכן, מוסיפים נוגדנים בהתאם לדילול המומלץ ומערבבים היטב על ידי הבהוב בתחתית הצינורות.עדיף להשתמש ב-EpCAM מצומד לפיקוריתרין כדי לדמיין אוכלוסיות נמוכות של תאים. דוגרים במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר הדגירה, הביאו את הצינורות למכסה המנוע של BSL והוסיפו מיליליטר אחד של חיץ מכתים לכל צינור.לאחר מכן צנטריפוגו את הצינורות ב-170G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, הביאו את הצינורות המכוסים למכסה המנוע השני של BSL ושאפו את הסופרנטנט. השהה מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של חיץ מכתים והחלק את תחתית הצינורות כדי לערבב.יש לחזור על השטיפה והצנטריפוגה פעמיים נוספות. לבסוף, להשהות מחדש את החיך ב 500 מיקרוליטר של חיץ מכתים לפני ציטומטריית זרימה. הוסף DAPI או מפלה תאים מתים בהתאם להמלצות היצרן.באמצעות פרוטוקול זה הודגמו אוכלוסיות נדירות של תאי אפיתל במח העצם של עכברים. ארבעה עד 5% מהתאים במח העצם היו חיוביים ל-EpCAM, ללא קשר למספר התאים שנספרו. בדגימות מח עצם אנושיות שניים עד 5% מהתאים היו חיוביים ל-EpCAM.כמו כן, אחוז התאים בתוך כל תורם בודד היה עקבי ככל שנספרו בהדרגה יותר תאים. בדגימות דם מורין, פחות מ-0.5% מהתאים היו חיוביים ל-EpCAM. בעוד שבדגימות דם אנושיות מספר זה היה סביב 0.3% מהתאים.דגימות הביקורת הראו מעט מאוד תאים חיוביים כוזבים של EpCAM. יתר על כן, התאים שמוינו בקבוצה החיובית EpCAM הראו צביעה עבור פאן ציטוקרטין. בעוד שאלו מהקבוצה השלילית EpCAM לא הדגימו את אות הציטוקרטין.חשוב ביותר לשמור על סביבה נקייה וסטרילית. זה ימנע כל זיהום לדגימה. ישנם מספר יישומים במורד הזרם שניתן להשתמש בהם על תאי אפיתל מבודדים כדי לקבוע את תפקודם.אלה כוללים ריצוף RNA, ניסויים בתרבית תאים in vivo ומיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי.

evidence-for-epcam-cytokeratin-expressing-epithelial-cells-normal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה זרימה cytometric לזיהוי וניתוח מולקולרית של התמיינות בשלב ספציפי אבות Murine erythroid ומבשרי, ישירות במח שאך שנקטפו עכבר העצם, בטחול או בכבד העובר. Assay מסתמך על פני קרום התא הסמנים CD71, Ter119, וגודל התא.

זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

מערכת התרבות 3D עבור hematopoiesis מתואר באמצעות דם טבורי האדם הנגועים מוח העצם. השיטה מבוססת על שימוש פוליאוריטן נקבובי הפיגום הסינתטי מצופה חלבונים תאי מטריקס. פיגום זה ניתנת להתאמה להכיל מגוון רחב של תאים.

Ex vivo החקיינות של hematopoiesis אנושיים בריאים חריגה

תאי גידול במחזור (CTCs) הם פרוגנוסטיים במספר סוגי הסרטן גרורתי. כתב יד זה מתאר את מערכת הזהב סטנדרטית CellSearch (CSS) פלטפורמת ספירת CTC ומדגיש שגיאות סיווג מוטעות נפוצות. בנוסף, שני פרוטוקולים מותאמים מתוארים לאפיון סמן מוגדר על ידי משתמש של ספירת CTCs וCTC בעכברי מודל פרה של גרורות שימוש בטכנולוגיה זו.

עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (CTC) ליישומים קליניים ומחקר הקליני

מוצגת אסטרטגיה לניתוח כמותי של נתונים היסטולוגיים במח העצם. מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי בקטעי רקמה מביאה לתמונות דו-ממדיות, המנותחות אוטומטית. ניתוחי לוקליזציה משותפת של סוגי תאים שונים מושווים לנתונים מתמונות מדומות, ונותנים מידע כמותי על אינטראקציות תאיות.

אוטומטי כימות של תא המטופואטיות - אינטראקציות תא סטרומה בתמונות היסטולוגית של עצם Undecalcified

שיטה ליצור ולחיות תמונות שונים מוח העצמות נישות בעכברים מוצג. בהתבסס על נישה תומכת שנוצרו על ידי תאים mesenchymal האדם, תוספת של תאים אנדותל האדם גורם להיווצרות של כלי אדם, ואילו תוספת של rhBMP-2 גורם להיווצרות של רקמת העצם של המוח האנושי.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד ובתאים אנדותל של דם טבורי. חלק מהיישומים כוללות שימוש תאים אלה כמו סמן לזיהוי חולים עם הסיכון למחלות לב, במחלות איסכמי, ובונה יצירת שסתום כלי הדם והלב רקמות מהונדסים.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

Microvascular תאי אנדותל של שרירי השלד (MMEC) לעצב את הדופן הפנימית של שריר נימים ולווסת את שניהם, חילופי נוזלים/מולקולות והעברה של תאים (חיסוניים) בין רקמת שריר, דם. בידוד של MMEC מאתר ראשי, כפי שמתואר כאן, מאפשר מקיף חקירות במבחנה של יחידת"myovascular".

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

Culturing CTCs מאפשר אפיון תפקודי עמוק יותר של סרטן, באמצעות הבעת ביטוי סמן ספציפי, והערכת עמידות לתרופות ואת היכולת ליישב את הכבד בין אפשרויות אחרות. בסך הכל, תרבות CTC יכולה להיות כלי קליני מבטיח לרפואה מותאמת אישית כדי לשפר את תוצאות המטופל.

קווי תאים סרטניים במחזור: כלי חדשני למחקר יסודי ותרגום

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד והכתמה של תאי מח עצם מורין לפנוטיפ תאי גזע המופויטיים ותאי אב יחד עם תאי גזע אנדותל ומזנכימליים תומכים. כמו כן נכללת שיטה להעשרת תאים הממוקמים באזורי אנדוסטל ומח עצם מרכזי.

ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים

כאן מוצג פרוטוקול מפורט לבידוד ואפיון אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם ממודלים של תסמונות מיאלודיספלסטיות ולוקמיה מיאלואידית חריפה. טכניקה זו מזהה שינויים בנישת מח העצם הלא המטופויטית, כולל תאי האנדותל והסטרומה המזנכימליים, עם התקדמות המחלה.

זיהוי אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם בתסמונת מיאלודיספלסטית ובלוקמיה מיאלואידית חריפה

אנו מתארים פרוטוקולים להכנת תרחיף חד-תאי של תאי אפיתל תימיים של עכבר וצביעה של מולקולות תוך-תאיות לניתוח זרימה ציטומטרי.

הכנת תרחיף חד-תאי של תאי אפיתל תימיים של עכבר וצביעה של מולקולות תוך-תאיות לניתוח ציטומטרי זרימה

למדו שיטה לבידוד תאים אפיתליים מדם ומח עצם בריאים באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה. השיטה מאפשרת ניתוח מורחב בתחומי הביולוגיה התפתחותית והתאית.

ראיות לכך ש- EpCAM ו- Cytokeratin מבטאים תאי אפיתל בדם אנושי תקין ובמח עצם

גלה סרטונים נוספים