הארכת תוחלת החיים של נויטרופילים עם CLON-G ובדיקת מוות ספונטני במבחנה

הפרוטוקול שלנו מספק תווך קוקטייל להארכת תוחלת החיים של נויטרופילים ליותר מחמישה ימים מבלי לפגוע בתפקודי הנויטרופילים. הוא מציע גם דיאליזה חוץ גופית אמינה עבור נויטרופילים. טיפול CLON-G מרחיב את האפשרויות של שימור נויטרופילים, שינוע ומניפולציה גנטית, אשר יכולים להאיץ את המחקר בקהילת הנויטרופילים.

כדי להתחיל, להכין את המדיום הבסיסי על ידי הוספת RPMI 1640 FBS ו pen-strep לצינור 50 מיליליטר. במקביל, הפשירו את כל פתרונות המלאי של רכיבי CLON-G על קרח. לאחר מכן לדלל HSP 70 ו 200 מיקרוגרם למיליליטר של G-CSF במדיום הבסיסי.

מעבירים 976 מיקרוליטר של מדיום בסיסי לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לשם כך, הוסף את רכיבי CLON-G להכנת מיליליטר אחד של 2x מדיום CLON-G כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, הכינו את תרבית הנויטרופילים על ידי השעיית הנויטרופילים של העכבר המבודד בתווך הבסיסי.

מוסיפים את מדיום CLON-G, ואחריו את המדיום הבסיסי ל-24 צלחות תרבית שאינן רקמות. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטר של השעיית התא מוכן בעדינות צינור שלוש עד ארבע פעמים. לדגור על צלחת התרבית ב 37 מעלות צלזיוס עם אספקת 5% פחמן דו חמצני.

לצבוע את נויטרופילים בתרבית עם cytospin ולנתח אותם באמצעות מיקרוסקופ אור. לניתוח ציטומטריית זרימה, הוסיפו מיליליטר אחד של תווך התא לתרבית תאי נויטרופיל שגדלה בן לילה. מערבבים את מדיום תרבית התאים על ידי פיפטציה עדינה חמש עד שבע פעמים ומעבירים 100 מיקרוליטר של תערובת זו לצינור ציטומטריית זרימה בנקודות הזמן הרצויות.

במקביל, מערבלים את חרוזי הספירה ואת הפיפט 10 מיקרוליטר של תמיסת חרוזים לאותו ציטומטריית זרימה ציטומטריה המכילה תווך תא. הוסיפו 10 מיקרוליטר של תערובת צביעה מוכנה מראש לצינור ציטומטריית זרימה זה ודגרו במשך חמש דקות במקרר תחת רדת החשיכה. לאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטר של מלוחים לצינור ולערבב היטב עבור הפצה שווה של ספירת חרוזים ותאים.

לבסוף, בצע את ניתוח ציטומטריית הזרימה של תרחיף התא כמתואר בכתב היד של הטקסט. לבדיקת תמונות פלואורסצנטיות, יש להוסיף שני מיליליטר של תרחיף תאים לכל לוחית קונפוקלית ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. בינתיים, להמיס גרם אחד של סידן כלורי ב 45 מיליליטר של מלוחים ולסנן אותו עם יחידת סינון 0.2 מיקרומטר.

הסר בעדינות את הצלחת הקונפוקלית בנקודת הזמן הנדרשת. לצבוע את התאים עם 10 מיקרוליטר של FITC-Annexin-V, PI וסידן כלורי במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי, ללכוד את התמונות באמצעות הערוצים הרצויים.

במחקר הנוכחי, המורפולוגיה של נויטרופילים לא הושפעה בתווך CLON-G גם לאחר חמישה ימים. יתר על כן, פנוטיפים פקס הדגימו תאים שלמים לאחר הטיפול. ניתוח ציטומטריית הזרימה הראה אוכלוסייה חיובית של נויטרופילים לא מטופלים בנספח-V ואובדן האוכלוסייה יכול להיות בגלל אתילן דיאמין חומצה טטראצטית בתווך התא.

עם זאת, הכדאיות של נויטרופילים שטופלו ב-CLON-G לאחר 24 שעות הייתה בערך יותר מ-90%מבחני התמונה הפלואורסצנטית אישרו גם את הכדאיות התאית של נויטרופילים שטופלו ב-CLON-G. הנויטרופילים שגודלו בתווך הבסיסי במשך 24 שעות הראו תאים נפוחים וייתכן שאובדן התאים האלה נבע מטלטול או פיפטינג של הלוח הקונפוקלי. ריכוזים והשפעות של תרכובת CLON-G יכולים להשפיע באופן משמעותי על בדיקות נויטרופילים.

אם הדבר אפשרי, הימנעו מאפנון שלהם. חקירות נויטרופילים הן מייגעות, יקרות ומוגבלות מאוד ביישום קליני בשל תוחלת החיים הקצרה שלהן. שיטה זו מתגברת חלקית על מכשולים אלה.