פינצטה מגנטית במהירות גבוהה למדידות ננומכניות על אלמנטים רגישים לכוח

ביומולקולות עוברות שינויים מבניים קטנים ומהירים, לעתים קרובות בתגובה לכוח. פינצטה מגנטית ברזולוציה גבוהה יכולה לחקור את הדינמיקות הללו תחת כוחות רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. מכיוון שהשיטה מבצעת מדידות ננומטריות בדיוק של אלפיות השנייה, ניתן לעקוב אחר שינויים עדינים בחומצות גרעין ובחלבונים בזמן אמת.

תקלות במיסב הראשון ובחלבונים הרגישים למכנו עלולות להוביל להפרעות לב וכלי דם ושרירים ושלד. פינצטה מגנטית יכולה לספק תובנה על מנגנוני העבודה של חלבונים אלה. הקבוצה חייבת להיות מיושרת ומכויילת כראוי כדי לקבל רזולוציות טובות.

כמו כן, יש להקפיד במהלך הכנה וזיהוי של מבנים מולקולריים למדידות. התחל על ידי הגדרת מיקרוסקופ הפוך על שולחן אופטי נגד רטט. לאחר מכן, התקן מצלמת CMOS במהירות גבוהה ותופס מסגרת.

הרכבה אנכית של שלב ליניארי ממונע עם אורך נסיעה של יותר מ -20 מילימטר על שלב XY ידני כדי לבנות שלב תרגום למניפולציה מגנטית בתלת-ממד. לאחר מכן, התקן מנוע צעד סיבובי ומערכת חגורה וגלגלת לסיבוב מגנט. הרכיבו את המגנטים על מחזיק אקרילי שבו המגנטים המקבילים הזהים נמצאים במרווחים של מילימטר אחד זה מזה.

התאימו את המיקום האנכי של שלב התרגום כך שהמשטח התחתון של המגנט יתיישר עם מישור הדגימה במיקום השלב הנמוך ביותר. באמצעות עדשה אובייקטיבית בהגדלה נמוכה, יישרו את המגנטים למרכז שדה הראייה. בדוק את סיבוב המגנט כדי לוודא שהתזוזה של מרכז זוג המגנטים מוגבלת.

התקן דיודה זוהרת במיוחד לתאורת חרוזים. העבירו את הקרן דרך מרווח המגנטים וודאו שהקרן מתנגשת כראוי כדי להתאים לרווח והתאורה אינה מוצללת על ידי המגנטים. כעת התקינו סורק עדשות Piezo על פיסת האף והרכיבו עדשת מטרה טבילת שמן 100X עם מפתח צמצם מספרי של 1.5 למעקב אחר חרוזים.

ודא שהתאורה אחידה עם תנועת מגנט כדי למנוע ממצאים פוטנציאליים במעקב אחר חרוזים. לבסוף, כוונן את האור לבהירות מרבית ללא רוויית פיקסלים. התחל על ידי לקיחת שני כיסויי זכוכית עבור החלק העליון והתחתון של התא.

נקו את הכיסויים על ידי סוניקציה שלהם באשלגן הידרוקסידי טוחנת אחת למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את הכיסויים במים מזוקקים והשאירו אותם שקועים במים. יש לעטוף את הכיסוי התחתון ולאחסן אותו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

ביום הניסוי, ייבשו את הכיסויים עם אקדח חנקן. כדי ליצור את התעלות הפשוטות, הכינו רצועות ברוחב של כשני מילימטרים של סרט דו-צדדי והניחו ארבע רצועות מקבילות זו לזו במרחק של חמישה מילימטרים זו מזו על הכיסוי התחתון. כעת הניחו את החלקת הכיסוי העליונה במרכז המכסה התחתון והשאירו מקום של כחמישה מילימטרים בקצוות הקצרים לכניסות ושקעי תעלות.

בעזרת פינצטה, לחץ בעדינות על החלק האחורי של החלק האחורי של הכיסוי העליון כדי לאטום היטב את התעלות. חתכו את הקצה של קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר וחתכו כ-10 מילימטרים מהפתח הרחב יותר כדי לאפשר לו להכיל יותר מ-200 מיקרוליטר של תמיסה. הכינו שלוש מחטי מזרק שמתאימות לצינור למשאבת המזרק.

חבר את המחט ביציאת תעלת תא הזרימה למשאבת המזרק באמצעות צינור פוליאתילן. אזנו את הערוצים עם PBS. השהה מחדש אגרגטים של חרוזים על ידי ערבול פתרונות החרוזים.

לאחר מכן הכניסו ברצף את הפתרונות הנדרשים לתעלה על ידי יניקה עם המשאבה. שטפו את כל החרוזים הלא קשורים תוך הפעלת 0.1 פיקוניוטון של כוח. על פני תעלת תא הזרימה, זהו את החרוזים המגנטיים הקשורים למולקולות בודדות של מבנה הדנ"א.

אתר חרוז הפניה בקרבת מקום. סובב את חרוז המועמד כדי לבדוק אם הוא מסתובב בחופשיות. סובבו את החרוזים עוד כמה סיבובים והעריכו את רדיוס הסיבוב, ובחרו חרוז עם רדיוס סיבוב קטן יותר.

הגדל את הכוח מאפס לחמישה פיקוניוטון כדי לזהות חרוזים קשורים בודדים טובים על ידי חיפוש שינוי גדול בתבנית עקיפת החרוזים כתוצאה ממתיחה של זוג חמישה קילו. באמצעות ה-PCR, הכינו זוג של חמישה קילו-בסיסים של מקטעי DNA דו-גדיליים המסומנים בביוטין בקצה אחד ובאזיד בקצה השני. לאחר הכנת תא זרימה עם מוצר PCR, רשום את קואורדינטות X ו- Y של החרוז הקשור ב -1.2 קילוהרץ ואת המגנטים במצב מנוחה.

קרבו את המגנטים לתא הזרימה וחזרו על מדידות מיקום החרוזים עד שהמגנטים בקושי נוגעים בחלק העליון של תא הזרימה. חשב את הכוח בכל מיקום מגנט D באמצעות אחת מהשיטות החלופיות. חזרו על מדידות הכוח עבור עוד כמה מבני דנ"א הבוחנים שלושה עד חמישה חרוזים כדי לחשב בממוצע את שונות הכוח בין החרוזים המגנטיים.

לאחר איתור חרוז מגנטי תקין יחד עם חרוז ייחוס, לחצו על כפתור הכיול כדי להתחיל להתכונן למעקב אחר חרוזים. לחץ על החרוזים בתמונה כדי להגדיר את מיקומי החרוזים. למעקב בכיוון Z, התוכנה תשלב את עדשת המטרה עם סורק Piezo בצעדים שווים, ותרשום תנודות בממוצע תמונות חרוזים בכל מיקום כדי ליצור טבלת חיפוש.

אפשר מעקב ומיקוד אוטומטי ולחץ על כפתור הרכישה כדי להקליט את מיקומי החרוזים. הפעלת כוח על מבנה סיכת ראש של DNA הביאה למודל שרשרת דמוי תולעת של הארכה הנגרמת בכוח. בשישה פיקוניוטון, המבנה הציג תנודות בהרחבה הקשורות לפתיחת רוכסן הפיכה, שנעלמה בשמונה פיקוניוטון ונצמדה לעקומת מודל חדשה.

ניסויי מעקב אחר סיכות שיער במהירות של 100 הרץ הראו עלייה בהרחבה, אך ההיסטוגרמות לא פתרו אוכלוסיות שונות. ב-1.2 קילוהרץ, המסלולים המסוננים החציוניים חשפו שתי אוכלוסיות נפרדות. ההפרדה בין שתי האוכלוסיות נותרה בעינה במשטר כוח הרוכסן.

המצב הפתוח העליון הפך בהדרגה לדומיננטי בכוח מוגבר. שיעורי המעבר השתנו באופן אקספוננציאלי עם כוח מופעל לטובת פתיחת רוכסן ועיכוב rezipping. במשטר כוח הביניים התקבלה סטיית אלן של שניים עד שלושה ננומטרים במהירות המרבית.

ידיות הדנ"א של מבנה מורכב SNARE התנהגו כמו פולימרי שרשרת דמויי תולעת. כאשר הכוח נרגע ממשטר גבוה יותר, השלוחה חזרה לעקומה המקורית או פעלה לפי מודל חדש. ב-14 פיקוניוטון, קומפלקס SNARE לא הצליח לעבור למצב ללא רוכסן, בעוד שכוח מוגבר איפשר את המעבר.

ההתפתחות המלאה של המתחם בכוחות גבוהים יותר אושרה על ידי קיפול מחדש שנצפה בשני פיקוניוטון. זיהוי של קשירת חרוזים לדוגמה שנוצרה כראוי הוא הדבר החשוב ביותר שיש לזכור כאשר מנסים את ההליך שלנו. שלב זה מאפשר בחירה מדויקת ובכך ניתוח של מבנה היעד.

פינצטה מגנטית יכולה לשמש גם לחקר סלילי העל של DNA על ידי הפעלת מומנט. כמו כן, זה יכול להיות משולב עם הדמיה פלואורסצנטית כדי לצפות אינטראקציות חלבון מורכבות מאוד או מתפתח.