פלטפורמת עכבה חשמלית מבוססת תאים להערכת מעכבי נגיף זיקה בזמן אמת

זיהומים ויראליים הם דינמיים מאוד, ולמבחני נקודות קצה מסורתיים בווירולוגיה יש מגבלה שנקודת קצה נבחרת יכולה להוביל למידע שהוחמץ. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי עם עכבה חשמלית מבוססת תאים, ניתן לעקוב אחר זיהום ויראלי ואת הפעילות של תרכובות אנטי ויראליות בזמן אמת. מי שידגים הליך זה יהיה איף מיין, טכנאי מעבדה מהמעבדה שלנו.

כדי להתחיל, להכין את צלחת CEI על ידי לקיחת אלקטרודה interdigitated מבוסס צלחת 96 באר. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום גידול לכל באר ומלא את החללים בין הבארות עם DPBS. לאחר מכן, לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע שעות.

כדי לזרוע את תאי A549, נתקו אותם מבקבוק התרבית כמתואר בכתב היד והשעו אותם מחדש במדיום גידול טרי. מעבירים את תרחיף התא לצינור של 50 מיליליטר. ספרו את התאים בני קיימא ודללו אותם במדיום גידול טרי כדי להשיג את צפיפות התאים הרצויה.

לאחר הדגירה, להסיר את מדיום תרבות הצמיחה עם פיפטה רב ערוצית מן צלחת באר 96. יש להוציא 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר. לאחר איזון התאים, מקם את הצלחת במכשיר CEI כדי להגדיר ולבצע את בדיקת CEI.

פתח את תוכנת ההתקן ובחלונית איסוף נתונים, לחץ על הגדרה כדי להגדיר ניסוי חדש. חבר מחשב נישא להתקן ECIS. הגדר את הצלחת על ידי בדיקת עכבות הבארות כפי שמצוין בצבע ירוק.

בחלונית Well Configuration, בחר סוג מערך בהתאם לתוכנת התרבות המשומשת ולחץ על מצב זמן של תדרים מרובים. לאחר מכן, התחל את המדידה על-ידי הקשה על התחל. שמור את המתחם על קרח.

בצע את הדילול המרוכז פי 10 עם מדיום בדיקה מאוזן בצינור פוליפרופילן של חמישה מיליליטר ולאחר מכן הוסף את התרכובת. בחלונית הגדרת איסוף נתונים, לחץ על השהה ולאחר השלמת נקודת הזמן הנוכחית, הוצא את לוח הקידוח 96. התבוננו בדבקות ובהיווצרות מונושכבה של התאים תחת מיקרוסקופ אור.

לאחר מכן, שאפו 20 מיקרוליטר מדיום מכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית, והוסיפו 20 מיקרוליטר של תמיסת תרכובת או רכב בבארות הרצויות. דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% למשך 15 דקות. כדי להכין את פתרון הנגיף, הפשיר בקבוקון של מלאי וירוסים.

לאחר ביצוע דילולים ב MOI הרצוי עם מדיום הבדיקה בצינור פוליפרופילן 15 מיליליטר, להוסיף מלאי וירוסים. לאחר דילול וירוס מתווסף בארות שהוקצו, להוסיף 100 מיקרוליטר של מדיום הבדיקה לבארות בקרת התא. לאחר מכן, לטהר את מיכלי הנגיף המועסקים.

החזירו את הלוחית למכשיר CEI ולחצו על 'המשך' כדי להמשיך את המדידות במשך שישה ימים רצופים. לניתוח הנתונים, לחץ על סיום כדי לסיים את הניסוי ולהוסיף הזן סיכום ניסוי. לאחר השלמת איסוף הנתונים, בחר אישור. בחרו בתדר הרצוי בחלונית 'תרשים'.

ודא שכל הבארות נבחרו בחלונית תצורת באר ולחץ על קובץ, לאחר מכן ייצא נתונים, ואחריו נתוני גרף כדי לייצא את הנתונים בפורמט גיליון אלקטרוני. בדיקת CEI הראתה כי קינטיקה של זיהום הייתה תלויה מאוד בסוג התא, ותאי U87 היו רגישים רק לזיהום בנגיף זיקה ב- MOI גבוה. מבחני CEI הדגימו גם חד-שכבה של תאים בגודל מלא בזריעה גבוהה של תאים ואינם יכולים להמשיך להתפשט על פני אלקטרודות CEI, מה שמוביל להבדל קל בין בקרת התאים לבין בקרת וירוסים.

עבור U87, סוג תא גדול יותר, זריעה צפופה מדי של תאים עשויה הייתה להוביל לניתוק מוחלט של חד-שכבתי התא. זן נגיף זיקה מייצג של MR766 האפריקאי בשושלת האסיאתית PRVABC59 הציג דפוסי CEI דומים. עם זאת, PRVABC59 יש מעט איטי יותר cytopathic-effect-inducing תכונות, גם משתקף על ידי ערכי CIT50.

פרופילי העכבה של שלושה MOI שונים של שני זני נגיף הזיקה הראו כי ריכוז התרכובת המסוים עיכב את ירידת העכבה שנגרמה על ידי זיהום בנגיף הזיקה. בדיקת CEI גילתה כי הפעילות האנטי-ויראלית הייתה תלויה בחישובי MOI ו-AUCN קבעו ערכי IC50. ערכי CIT50 המוערכים הדגימו עוצמות מורכבות בקינטיקה של גדילת תאים וזיהום.

CEI היא טכנולוגיה רבת עוצמה להערכה ואפיון תרכובות כנגד שכפול נגיף זיקה בזמן אמת, ללא תוויות וללא פולשניות.