החדרת ליפופוליסכריד תוך טרכאלי לא פולשני בעכברים
31 במרץ 2023
כאן, אנו מציעים פרוטוקול להעברת ליפופוליסכריד תוך טרכאלי (LPS) באמצעות אינטובציה אנדוטרכאלית אורופרכאלית לא פולשנית. שיטה זו ממזערת את הטראומה של ההליך הכירורגי עבור החיה ומעבירה LPS מדויק לקנה הנשימה ולאחר מכן לריאות.
הפרוטוקול שלנו מציע שיטת העברה לא פולשנית חדשה של LPS מקנה הנשימה לריאה, בצורה מדויקת יותר. אנשים שמנסים שיטה זו בפעם הראשונה צריכים להשקיע מאמץ רב במציאת המיקום של קנה הנשימה. כדי להכין את משטח האינטובציה, מעבירים את החוט דרך שני החורים וקושרים את קצותיו לבליטות הקטנות בחלק העליון של ההגבהה.
לאחר מכן, חברו שתי גומיות לכל קצה של האטב והדביקו אותן לגבו של ההגבהה. לבסוף, מקבעים את ההגבהה לבסיס בזווית של 90 מעלות. הרכיבו את הצינורית על עט צינורית, והדליקו את אור העט.
לאחר מכן, יש לחטא מלקחיים כירורגיים קטנים ופיפטה של פסטר באמצעות 70% אלכוהול. כדי להכין את תמיסת תרכובת הבדיקה, הוסף שלושה מיליגרם של lipopolysaccharide, או LPS, במיליליטר אחד של pH 7.2 PBS. לאחר מכן, להמיס 10 מיליגרם של נתרן pentobarbital במיליליטר אחד של מלוחים רגילים, ולסנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר.
הניחו את העכבר המורדם על משטח האינטובציה. לאחר מכן תקן את השיניים הקדמיות העליונות עם החוט, ואת שתי הרגליים הקדמיות עם הגומיות. בעזרת פינצטה, משוך את הלשון החוצה ומחזיק אותה.
דוחפים את הצינורית באיטיות לאורך הפה אל האפיגלוטיס המנדיבולרי. אתרו את קנה הנשימה בעזרת האור של עט הצינורית והכניסו לאט לאט את הצינורית לתוכו. לאחר מכן למשוך את עט אינטובציה, משאיר את הצינורית בפנים.
הכנס את פיפטת פסטר למפרק הצינורית ולחץ על הראש. לאחר אינטובציה אנדוטרכאלית מוצלחת, באמצעות מיקרומזרק בעל ראש שטוח, להחדיר את תמיסת LPS מוכן במינון של שלושה מיליגרם לקילוגרם דרך הצינורית. לאחר שסיימתם, הוציאו את המזרק והצינורית.
הסר את העכבר מפלטפורמת האינטובציה והנח אותו בכלוב נפרד כדי להתאושש. שימו לב למצב הנשימה של העכבר עד שהוא מתאושש וחוזר להכרה. לאחר 12 שעות לאחר החדרת קנה הנשימה LPS, הוערך הביטוי של ציטוקין דלקתי, TNF-אלפא, ויחס משקל יבש-רטוב בריאה והושוו לשיטות החדרה אחרות.
רמות TNF-אלפא בסרום בקבוצת האינטובציה הלא פולשנית של הלוע היו גבוהות משמעותית בהשוואה לקבוצת הביקורת הריקה. יחס המשקל היבש-רטוב של הריאה עלה גם הוא, והגיע לרמה זהה לזו שבקבוצת אינטובציית קנה הנשימה הניתוחית. חשוב לא לגרד את קנה הנשימה בתהליך של מציאת המיקום של קנה הנשימה.
הטכניקה יכולה לשמש גם כדי לספק תרופות אחרות שצריכות להגיע לריאה בצורה לא פולשנית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לא פולשני להחדרה תוך-קשייתית של ליפופוליסכריד (LPS) באמצעות אינטובציה אנדוטראכאלית אורופרינגיאלית במודל של עכבר. הטכניקה מצמצמת טראומה כירורגית תוך כדי הובלה מדויקת של LPS לקשקשת ולריאות, ובכך מאפשרת הערכה יעילה של תגובות דלקתיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- ביולוגיה של מערכת הנשימה
- דלקת
- שיטות להולכת תרופות
רקע
- חשיבות חקר הדלקת ריאותית
- אתגרים בשיטות אינטובציה פולשניות
- הצורך בשיפור שיטות הולכת תרופות
שיטות שנעשה בהן שימוש
- אינטובציה אנדוטרכאלית באמצעות שיטות לא פולשניות
- עכברים כמערכת מודל ביולוגית
- הכנת LPS ושימוש בחומרי הרדמה
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול אפשר הולכה מדויקת של LPS לריאות.
- נצפתה עלייה משמעותית ברמות של ציטוקין הדלקת TNF-alpha לאחר ההולכה.
- יחס המשקל היבש-רטוב של גושי הריאה היה תואם לזה של טכניקות אינטובציה פולשניות.
מסקנות
- המחקר מדגים שיטה לא פולשנית ויעילה למתן LPS.
- טכניקה זו רלוונטית למחקר פרה-קליני הכולל הולכת תרופות לריאות ודלקת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
החדרה לא פולשנית של LPS למסילת הנשימה דרך הפה והלוע בעכברים מאפשרת מיקוד מדויק לריאות לצורך מידול של פגיעה ריאתית חריפה, תוך מזעור הטראומה הפרוצדורלית והשפעות שאינן ממוקדות. גישה זו תומכת בהערכה חסונה של דלקת ריאתית ואספקת תרופות, ובכך מגבירה את הביטחון החזוי במחקרים מוקדמים של מחלות נשימה. אימוץ שיטה זו מייעל את זרימות העבודה הפרה-קליניות ומפחית את השונות הביולוגית, דבר המשפיע ישירות על סדר העדיפויות של תיק הפיתוח וההלימה התרגומנית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולים דלקתיים בהקשר מבוקר וספציפי לריאות.
- מפחית השפעות סיסטמיות מבלבלות, ובכך תומך בתיקוף פונקציונלי של המטרה.
- משפר את הביטחון החזוי לגבי מנגנונים של מחלות נשימה ובחירת מועמדים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מסייע בהכנה של מודלים מאושרים של פגיעה ריאתית חריפה לצורך סריקת תרכובות.
- תומך בהשראה הניתנת לשחזור של נקודות קצה דלקתיות, כגון ביטוי TNF-alpha.
- מאפשר הערכה כמותית של פגיעה ריאתית באמצעות יחסי משקל יבש-רטוב.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם למודלים של פגיעה ריאתית הרלוונטיים למחלה עבור מחקרי ביומרקרים תרגומיים.
- מספק רצף מגילוי מנגנוני ועד לתיקוף פרה-קליני של חומרים אנטי-דלקתיים.
- תומך בקידום מותאם סיכונים של טיפולים נשימתיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת הזרקת ה-LPS הבלתי פולשנית זו משתלבת ברצף שבין השלבים המוקדמים של הגילוי לשלבים הפרה-קליניים במחקר של מחלות דרכי הנשימה ובפיתוח תרופות.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת היפותזות של תגובות דלקתיות ספציפיות לריאה ובבירור נתיבים ביולוגיים.
- סריקה: מספק מודלים סטנדרטיים וניתנים לשחזור להערכת תרכובות אנטי-דלקתיות.
- אנליטיקה: מספק פלטים כמותיים, כגון רמות ציטוקינים ויחסי משקל ריאה, לצורך השוואת מצבים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאי תגליות לתיקוף של סמנים ביולוגיים (biomarkers) בשלב הפרה-קליני במערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה לא פולשנית וניתנת לשימוש חוזר למחקרי הולכת תרופות ריאתיות בתוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במודלים של פגיעה בריאות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, את השחזוריות ואת שיעורי ההישרדות של בעלי החיים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות יעילה יותר לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון בתיקי פיתוח למחלות נשימה.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתיעודו של סדר עדיפויות מותאם סיכונים ובקידומם של מועמדים לטיפולים במערכת הנשימה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות טכנית באינטובציה לא פולשנית ובטיפול בבעלי חיים.
- נדרש מכשור אינטובציה ייעודי וכלים אנליטיים למדידת ציטוקינים ומשקל הריאה.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך הדירות (reproducibility) ויכולת השוואה של הנתונים.
- ניתן להתאמה למחקרי הולכה של תרופות לריאות אחרים, בכפוף לוולידציה מתאימה.
- טכניקה מדויקת חיונית למניעת פגיעה בקנה הנשימה ולהבטחת מינון מדויק.
