Name: בידוד, תרבית ואפיון פיברובלסטים עוריים ראשוניים מרקמת קלואיד אנושית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: למדו פרוטוקול מותאם לבידוד ותרבית פיברובלסטים ראשוניים מרקמת קלואיד אנושית. השיטה מספקת מקור יציב ואמין של תאים חיים לחקר הביולוגיה של קלואידים ופיתוח טיפולים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספרי מענקים 81903189 ו -82073418) וקרן המדע והטכנולוגיה של גואנגזו (מענק מספר 202102020025).

מחקר זה אושר על ידי ועדת הסקירה המוסדית של בית החולים לדרמטולוגיה, האוניברסיטה הרפואית הדרומית (2020081). הסכמה מדעת של המטופל התקבלה לפני איסוף הרקמות.
1. הכנה
הערה: יש לבצע את ההליכים הבאים בסביבה סטרילית תחת ארון בטיחות ביולוגי.
<ol><li>הכינו מדיום תרבית שלם על ידי הוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B תמיסת (PSA) לתמיסת Eagle medium (DMEM) בעלת גלוקוז גבוה של Dulbecco.</li>
	<li>הכינו תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) עם PSA על ידי הוספת 1% PSA ל-1x PBS. הכן PBS עם FBS על ידי הוספת 1% FBS ל- 1x PBS.</li>
	<li>הכינו מספר מספריים, מלקחיים ואזמלים מעוקרים על ידי אוטוקלאבינג.</li>
</ol>2. השגת רקמות שהוסרו
<ol><li>להשיג רקמות מחולי קלואיד באמצעות ניתוח. אספו את רקמות הקלואיד הטריות בשקית אריזה סטרילית או בצינור צנטריפוגה סטרילי, והעבירו אותן לארון בטיחות ביולוגי במעבדה בהקדם האפשרי. הערה: בפרוטוקול זה, גודל הרקמה הקלואידית הנרכשת היה בערך ~ 20 x 20 x 10 מ"מ3, והגודל עשוי להשתנות בהתאם לניתוח.</li>
</ol>3. בידוד
<ol><li>הוציאו את הרקמה הקלואידית באמצעות פינצטה סטרילית, והניחו אותה בצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל המכיל 10-25 מ"ל PBS עם 1% PSA למשך 10 דקות. לאחר מכן, להכין צלחת 6 בארות, ולהוסיף 4 מ"ל של PBS בתוספת 1% PSA לכל באר. הוציאו את הרקמה באמצעות פינצטה מעוקרת, ושטפו אותה פעמיים עם PBS בתוספת 1% PSA. באמצעות מלקחיים סטריליים, להעביר את הרקמה ברצף מבאר אחת לאחרת.</li>
	<li>הסר את שכבות השומן והאפידרמיס באמצעות מספריים כירורגיים או אזמל כירורגי, והשאר את שכבת הדרמיס ללא נגיעה. חותכים ומנתחים את שכבת הדרמיס ל 3-5 מ"מ2 חתיכות עם מספריים, מעבירים חתיכות אלה באמצעות מלקחיים סטריליים לבאר הבאה, ושוטפים אותם ב- PBS עם תמיסת PSA 1% שוב.</li>
</ol>4. תרבות
<ol><li>מניחים את חתיכות רקמת הדרמיס בצלחות פטרי באמצעות מלקחיים מעוקרים; ודא שמספר החתיכות הוא בין 10 ל -30 והמרחק בין כל חתיכה הוא >5 מ"מ. הניחו את צלחות הפטרי הפוכות באינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37°C למשך 30-60 דקות עד שחתיכות הרקמות מתייבשות מעט ונדבקות לצלחת הפטרי. לאחר מכן, להוסיף DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% PSA, בזהירות להניח את צלחות פטרי לתוך אינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C. הערה: פיברובלסטים הם אוכלוסיית תאים הטרוגנית מבחינה מורפולוגית ותפקודית. בהתחשב במורכבות זו, צעדי הבידוד והתרבות צריכים להתבצע בזהירות; בחר את חתיכות רקמת העור קלואיד באופן שווה, וערבב חתיכות אלה היטב לפני הנחתם בצלחת פטרי.</li>
	<li>לאחר 3 ימים, החליפו מחצית מהסופרנאטנט במדיום תרבית שלם. שנה את מדיום התרבות כל 2-3 ימים. צפו בפיברובלסטים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 40 בכל יום. הערה: יש לבצע את כל השלבים בעדינות. אל תזיזו את צלחת הפטרי במשך יומיים לאחר הבידוד, מכיוון שלוקח זמן לחתיכות הרקמה להיצמד לצלחות הפטרי.</li>
	<li>כאשר הפיברובלסטים הגדלים סביב חלקי הרקמה מגיעים לכ-90% התמזגות, הסר את פיסות הרקמה ואת מדיום התרבית. שטפו את הפיברובלסטים עם PBS 1x סטרילי, והוסיפו 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA סטרילית 1x לצלחות. לדגור על התאים במשך כ~ 3-5 דקות ב 37 ° C באינקובטור לח 5% CO2 . טפחו בעדינות על צלחת התרבית, והתבוננו בה תחת מיקרוסקופ. כאשר רוב התאים מתנתקים מהצלחת, מוסיפים 2 מ"ל של מדיום שלם כדי לסיים את תהליך העיכול.</li>
	<li>מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 15 מ"ל, וצנטריפוגות את הצינור בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט בזהירות, והשהו מחדש את כדורית התא בתווך מלא. זרעו את הפיברובלסטים בצלחת תרבית תאים בקוטר 9 ס"מ, ודגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח של 5%CO2 .</li>
</ol>5. תחזוקה ושימור
<ol><li>כעבור 3-4 ימים, כאשר הפיברובלסטים גדלו למפגש של 80%, חזרו על שלבים 4.2-4.4, ועברו את הפיברובלסטים ביחס של 1:3. השתמש בפיברובלסטים העוברים לניסויים נוספים. הערה: יש לעצור את תרבית הפיברובלסטים לאחר 10 מעברים, מכיוון שהתאים עשויים להתחיל להראות מאפיינים משתנים בהשוואה לתאים המקוריים.</li>
	<li>Cryoלשמר את התאים העוברים של P1-P3 בחנקן נוזלי לשימוש נוסף.<ol><li>חזור על שלבים 4.2-4.3. מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 15 מ"ל, וצנטריפוגות את הצינור למשך 3 דקות ב-300 × גרם. השליכו את הסופרנאטנט בזהירות, השהו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיום הקפאת תאים המכיל 90% FBS ו-10% DMSO, והעבירו את התרחיף לצינוריות הקפאה של התא.</li>
		<li>העבירו את התאים לקופסה קפואה, ואז הכניסו את הקופסה הקפואה למקפיא בטמפרטורה של -80°C. לאחר יום אחד, להעביר את התאים לחנקן נוזלי לשימור לטווח ארוך.</li>
	</ol></li>
</ol>6. זיהוי פיברובלסטים על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית
<ol><li>מניחים את הכיסויים העגולים בצלחת של 24 בארות, ומגדלים את הפיברובלסטים העוברים בריכוז של 1 × 104 תאים/באר. כאשר הפיברובלסטים מגיעים למפגש של 60%, הסר את מדיום התרבית. הוסף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde כדי לקבע את הפיברובלסטים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף 3x עם PBS במשך 1 דקות בכל פעם. הערה: ספור את מספר התאים באמצעות שקופית המוציטומטר מתחת למיקרוסקופ או מונה תאים אוטומטי.</li>
	<li>הסר את PBS, לדגור עם 0.5% Triton X-100 במשך 20 דקות עבור חדירה של קרום התא, ולאחר מכן לשטוף 3x עם PBS במשך 1 דקות בכל פעם. הוסיפו PBS עם אלבומין בסרום בקר 0.5% והשרו למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסר אותו, והוסף את נוגדן PDGFR-α/vimentin מדולל בנוגדנים ב 1:1,000. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).</li>
	<li>למחרת, להסיר את הנוגדן הראשוני, לשטוף את התאים 3x עם PBS במשך 3 דקות, ולהוסיף את הנוגדן המשני Alexa Fluor-555 עז נגד ארנב IgG מדולל עם נוגדנים מדלל ב 1:200 כדי להשרות במשך 1 שעה.</li>
	<li>הסר את הנוגדן המשני, ולשטוף את התאים 3x עם PBS. הוציאו את הכיסויים העגולים בעזרת מלקחיים, הניחו אותם על מגלשות זכוכית והוסיפו 50 μL של תמיסת 5 מיקרוגרם/מ"ל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי להכתים את גרעיני התא. שמרו את הדגימות בקופסה רטובה וחשוכה, והתבוננו בהן תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי פלואורסצנטי. הערה: הוסף קבוצת ביקורת שלילית ללא נוגדן ראשוני אך עם נוגדן משני כדי לא לכלול כתמים לא ספציפיים.</li>
</ol>7. זיהוי פיברובלסטים לפי ציטומטריית זרימה
<ol><li>אספו את גלולת התא לתוך צינור צנטריפוגה סטרילית של 1.5 מ"ל, והשהו מחדש עם 50 מיקרוליטר של PBS המכיל 1% FBS. יש לדגור עם anti-CD90 למשך 30 דקות בחושך, ולהוסיף בקרת איזוטיפ אנטי-IgG לקבוצת הביקורת. לאחר מכן, הוסף 200 μL של PBS המכיל 1% FBS, וצנטריפוגה את הצינור במשך 10 דקות ב 300 × גרם ב 4 ° C.</li>
	<li>הסר את supernatant, ולהוסיף 200 μL של PBS המכיל 1% FBS. השהה מחדש וסנן את המתלה דרך מסננת תאים (70 רשת). הוסף תמיסת מלאי של 5 מיקרוגרם/מ"ל של DAPI בשעה 1:100 לתסנין, ולאחר מכן קבל את התוצאות באמצעות ציטומטריית זרימה. הגדר את הפיזור הקדמי (FSC) כאבסיסה ואת הפיזור הצדדי (SSC) כאורדינטה, והקף את אוכלוסיית התאים הראשית. בחר את אוכלוסיית התא, והגדר את phycoerythrin כמו abscissa ואת הספירה כמו הקואורדינטה לניתוח.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).</li>
<li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212(2022).</li>
<li>Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keloid+disorder%3A+Genetic+basis%2C+gene+expression+profiles%2C+and+immunological+modulation+of+the+fibrotic+processes+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+the+selection+of+adjuvant+radiotherapy+regimens+for+keloid%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid.</a> Frontiers in Medicine. 9, 1043840(2022).</li>
<li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars%3A+A+critically+appraised+topic%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li>
<li>Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+ex+vivo%2C+and+in+vivo+approaches+for+investigation+of+skin+scarring%3A+Human+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models.</a> Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).</li>
<li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li>
<li>Künzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic-augmented+primary+adult+fibroblast+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59858(2019).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+explants+culture+method%3A+Sustainable+isolation+of+keloid+fibroblasts+with+primary+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cosmetic+Dermatology%22%5BJournal%5D)">An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).</li>
<li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733(2022).</li>
<li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li>
<li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+%28ATF3%29+regulates+cell+growth%2C+apoptosis%2C+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+%28TGF-beta%29%2FSMAD+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li>
<li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+explant+culture%3A+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815(2021).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331(2022).</li>
<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+PDGFR%CE%B1+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192(2022).</li>
<li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625(2022).</li>
<li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li>
</ol>

אין ניגודי עניינים להצהיר.

השגת פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות היא בסיס קריטי למחקר נוסף. עד כה, היו שתי שיטות לרכישת פיברובלסטים ראשוניים: עיכול אנזימים ותרבית צמחים11,12,13,14. עם זאת, לשתי השיטות המסורתיות יש מגבלות, כגון רגישות לזיהום, ערבוב עם סוגים אחרים של תאים, תקופת תרבית ארוכה, ושיעור הצלחה נמוך15,16. מחקר זה תיאר שיטה אופטימלית וסיפק הוראות ברור...

קלואיד, מחלה פיברופרוליפרטיבית, מתבטאת בצמיחה מתמשכת של פלאקים שלעתים קרובות פולשים לעור הרגיל שמסביב ללא הגבלה עצמית וגורמים לדרגות שונות של גירוד, כאב ונטל קוסמטי ופסיכולוגי לחולים1. פיברובלסטים, התאים העיקריים המעורבים בקלואידים, ממלאים תפקיד חיוני בהיווצרות ובהתפתחות של מחלה זו באמצעות התרבות יתר, ייצור מטריצות חוץ-תאיות מיותרות וקולגןלא מאורגן 2,3. עם זאת, הפתוגנזה הבסיסית נותרה לא ברורה, ושיטה טיפולית יעילה לקלואיד עדיין חסרה; לכן, יש צורך דחוף במחקר נוסף 4,5.
מכיוון שאין מודל אידיאלי בבעלי חיים למחקר קלואיד in vivo 6,7, בניית מודל במבחנה על ידי רכישת פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות יכולה להציע היתכנות ואמינות למחקר קלואיד 2,6. תאים ראשוניים הם אלה שמקורם ישירות ברקמה חיה, וידוע בדרך כלל כי תאים אלה יכולים להידמות יותר למצב הפיזיולוגי ולרקע הגנטי של אנשים רבים בהשוואה לשורות תאים 8,9. טיפוח תאים ראשוניים מספק אמצעי רב עוצמה לחקר הצמיחה והמטבוליזם של תאים, כמו גם פנוטיפים אחרים של תאים.
כיום, ישנן שתי שיטות לרכישת פיברובלסטים ראשוניים: עיכול אנזימים ותרבית צמחים. עם זאת, זוהו מספר מכשולים להשגת פיברובלסטים ראשוניים, כגון הסיכון לזיהום על ידי חיידקים או פטריות שונים, ערבוב עם סוגים אחרים של תאים שאינם מוסרים בקלות, התקופה הארוכה של מחזור התרבית, השינויים הבאים במאפייני התא בהשוואה לתאים המקוריים, וכן הלאה9. לכן, פיתוח תהליך אפשרי ויעיל להשגת פיברובלסטים ראשוניים הוא הבסיס למחקרים ויישומים נוספים. מחקר זה מתאר פרוטוקול אופטימלי לחילוץ פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות שיכולים לספק פיברובלסטים טהורים ויציבים ביעילות ובהתמדה.

<table><tbody><tr><td>צינור צנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל</td><td>JETBIOFIL</td><td>CFT002015</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל</td><td>JETBIOFIL</td><td>8076</td><td></td></tr><tr><td>4% פוליפורמלדהיד</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0099</td><td>קיבוע תאים</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה סטרילי</td><td>JETBIOFIL</td><td>8081</td><td>שים רקמת קלואיד</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-555 עז נגד ארנב IgG&nbsp;</td><td>אבקם</td><td>אלכסה&nbsp; פלואור&nbsp; 555&nbsp;</td><td>נוגדן שני לבדיקת צביעה אימונופלואורסצנטית</td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD90</td><td>BioLegend</td><td>B301002</td><td>לזהות את טוהר הפיברובלסטים</td></tr><tr><td>מדלל נוגדנים</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0262</td><td></td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 series A2</td><td>תאי בידוד ותרבית</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>אלאדין</td><td>B265993</td><td>חסימה לבדיקת צביעה אימונופלואורסצנטית</td></tr><tr><td>חממת פחמן דו חמצני</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td>שימוש לתרבית תאים</td></tr><tr><td>קריו-צינורות תאים</td><td>קורנינג</td><td>43513</td><td>אחסן את התאים במכונה</td></tr><tr><td>צנטריפוגלית</td> בטמפרטורה נמוכה <td>תרמו פישר</td><td>ST 16R</td><td>להשליך סופרנטנט&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C1006</td><td>מכתים את גרעין התא</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MP Biomedicals</td><td>196055</td><td>שימוש לשימור תאים</td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Culture תמיסה בינונית</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>BI</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>BD</td><td>BD FACSתצפית על סלסטה</td><td> זהות התאים</td></tr><tr><td>הקפואה קופסה</td><td>Thermo Scientific</td><td>&nbsp; 5100-0050</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>לייזר Nikon</td><td>AIR-HD25</td><td>התבוננות בבדיקת הצביעה האימונופלואורסצנטית</td></tr><tr><td>PDGFR-& נוגדן</td><td>CST</td><td>3174T</td><td>נוגדן ראשון לבדיקת צביעת אימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-Am</td><td>Solarbio</td><td>P1410</td><td>הוסף בתרבית תמיסה בינונית כדי למנוע זיהום</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>JETBIOFIL</td><td>7556</td><td>תרבית פיברובלסטים</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט תמיסת מלח</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Culture תמיסה בינונית</td></tr><tr><td>ארנב (DAIE) mAB IgG XR (R) בקרת איזוטוג' (PE)</td> <td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>5742S</td><td>כבקרה לזרימה ציטומטריית כיסוי</td></tr><tr><td>עגול</td><td>Biosharp</td><td>801007</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td>ניקוב חורים בקרום התא</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>משמש לתאי מעבר</td></tr><tr><td>נוגדן וימנטין</td><td>Abcam</td><td>ab8978</td><td>נוגדן ראשון לבדיקת צביעה אימונופלואורסצנטית</td></tr></tbody></table>

בידוד, תרבית ואפיון פיברובלסטים עוריים ראשוניים מרקמת קלואיד אנושית

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

פיברובלסטים, סוג התא העיקרי ברקמת קלואיד, ממלאים תפקיד חיוני בהיווצרות והתפתחות קלואידים. הבידוד והתרבית של פיברובלסטים ראשוניים שמקורם ברקמה קלואידית הם הבסיס למחקרים נוספים על הפונקציה הביולוגית והמנגנונים המולקולריים של קלואידים, כמו גם אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול בהם. לשיטה המסורתית להשגת פיברובלסטים ראשוניים יש מגבלות, כגון מצב תאי ירוד, ערבוב עם סוגים אחרים של תאים ורגישות לזיהום. מאמר זה מתאר פרוטוקול ממוטב וקל לשחזור שיכול להפחית את התרחשותן של בעיות אפשריות בעת השגת פיברובלסטים. בפרוטוקול זה, ניתן לצפות בפיברובלסטים 5 ימים לאחר הבידוד ולהגיע לכמעט 80% מפגש לאחר 10 ימי תרבית. לאחר מכן, הפיברובלסטים עוברים ומאומתים באמצעות נוגדני PDGFRα ווימנטין לבדיקות אימונופלואורסנציה ונוגדני CD90 לציטומטריית זרימה. לסיכום, פיברובלסטים מרקמה קלואידית ניתן לרכוש בקלות באמצעות פרוטוקול זה, אשר יכול לספק מקור שופע ויציב של תאים במעבדה למחקר קלואיד.

ציר הזמן של הפרוטוקול מסוכם באיור 1A. כמה תמונות מייצגות של תהליך הבידוד מוצגות באיור 2; שכבות האפידרמיס והשומן הוסרו בקפידה, ושכבת הדרמיס הופרדו לשברים קטנים של 3-4 מ"מ2, שחוסנו לצלחות הפטרי.
כפי שניתן לראות באיור 3A, כמה גידולים פיברובלסטים של חלקי הרקמה נצפו תחת המיקרוסקופ 5 ימים לאחר העיבוד. כפי שניתן לראות באיור 3B, הפיברובלסטים הציגו שיעורי התרבות גבוהים ...

מחקר זה מתאר פרוטוקול אופטימלי לביסוס פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות שיכולים לספק פיברובלסטים טהורים ויציבים ביעילות ובהתמדה.

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

הבידוד והתרבית של פיברובלסטים ראשוניים שמקורם ברקמת קלואיד הם הבסיס למחקרים נוספים של קלואידים. פיברובלסטים מרקמה קלואידית ניתן לרכוש בקלות באמצעות פרוטוקול זה, אשר יכול לספק מקור שופע ויציב של תאים במעבדה למחקר קלואיד. התחל על ידי שימוש בפינצטה סטרילית כדי למקם את רקמת הקלואיד בצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר המכיל 10 עד 25 מיליליטר של PBS בתוספת 1% PSA.בינתיים, הוסף ארבעה מיליליטר של תמיסת PBS PSA לכל באר של צלחת שש בארות. כעת הוציאו את הרקמה מהצינור, ושטפו פעמיים בתמיסת PBS PSA. באמצעות זוג מלקחיים סטריליים, להעביר את הרקמה ברצף מבאר אחת לאחרת.לאחר מכן להסיר את שכבות השומן ואת האפידרמיס עם מספריים כירורגיים, משאיר את הדרמיס ללא פגע. השתמש בזוג מספריים כדי לנתח את הדרמיס החתוך לשלוש עד חמש חתיכות מילימטר מרובע ולהעביר את החתיכות לבאר הבאה עם זוג מלקחיים סטריליים. שטפו את החתיכות בתמיסת PBS PSA.בעזרת מלקחיים מעוקרים, הניחו בצלחות פטרי 10 עד 30 חתיכות רקמת דרמיס במרווחים של פחות מחמישה מילימטרים זו מזו. מניחים את הכלים הפוכים באינקובטור עד שהנתחים מתייבשים ונדבקים לצלחת. לאחר מכן, להוסיף שבעה מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% PSA, ולדגור את הכלים כמו קודם.לאחר שלושה ימים, החליפו חצי מהסופרנאטנט במדיום תרבית שלם. יש להתבונן בפיברובלסטים מדי יום תחת הגדלה מיקרוסקופית פי 40.

isolation-culture-characterization-primary-dermal-fibroblasts-from

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הדרך המהירה, החזקה של בידוד קיימא גזע בוגרים לתאי האפיתל של העור האנושי הוא תיאר. השיטה משתמשת עיכול אנזימטי של מטריקס הקולגן בעור, ואחריו מריטת זקיקי השיער ובידוד של המתלים תא בודד או שברי רקמה תרבית תאים.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

פרוטוקול תרבות explant פיברובלסטים מביופסיות אגרוף עור אנושי הוא דרך פשוטה וחזקה מבחינה טכנית להפיק תאי עור בתוך 4-8 שבועות לבנקאות של כ 15-20 מיליון תאים במספר מעבר נמוך.

תרבות explant עור אגרוף ביופסיה לגזירה של fibroblasts אדם היסודי

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד וטיפוח תאי Schwann מרקמות דרמיס אנושיות. הדרמיס האנושי מכיל סוגי תאים שונים, כולל פיברובלסטים ותאי שוואן. לאחר הבידוד, התאים מטופלים עם סוכן antimitotic כדי לחסל פיברובלסטים מתרבים, וכתוצאה מכך תרבית טהורה של תאי Schwann.

בידוד ותרבית של תאי שוואן ראשוניים מדרמיס אנושי

אנו מדווחים על שיטה לבודד מבשר עור נגזרות נאיביים multipotent (SKP) תאים פיברובלסטים מתרבויות האנושיות העיקריות. אנו מראים כי SKPs אלה נגזרים מתרבויות פיברובלסטים חולקים מאפיינים של תאי גזע דומים לאלה שנגזרים ישירות מביופסיות עור אדם. תאים אלה מבטאים את סמן הרכס העצבי, nestin, בנוסף לסמני multipotent כגון Oct4 וNanog.

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

התנהגות פיברובלסטים עומדת בבסיס ספקטרום של ישויות קליניות, אך הן נשארות מאופיינות בצורה גרועה, בעיקר בשל ההטרוגניות הטבועה בהן. מחקר פיברובלסטים מסורתי מסתמך על מניפולציה במבחנה, המסווה התנהגות פיברובלסטים in vivo. אנו מתארים פרוטוקול מבוסס FACS לבידוד פיברובלסטים של עור עכבר שאינו דורש תרבית תאים.

עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבודד ביעילות keratinocytes האדם העיקרי של רקמות העור למבוגרים. שיטה זו מפשטת את הפרוצדורה המקובלת על-ידי שימוש Y-27632 מעכב את רוק המדיום חיסון להפריד באופן ספונטני תאים אפידרמיס מתאי עורי.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מבוסס-FACS לבידוד של העור האנושי ושרירי הלסת. זה חוסם בתרבות מבחנה אשר היה בלתי נמנע עם פרוטוקול הבידוד הנפוץ ביותר דרך תרבויות ההסבר. ערכות המשנה שמקורם הפיצוץ הם ברורים מבחינה פונקציונלית ולהציג ביטוי גנים דיפרנציאלי ולוקליזציה בתוך dermis.

הבידוד של העור האנושי על ידי מיון תאים שהופעלו על ידי קרינה פלואורסצנטית ורשתית

מתכנות התא מחייב הקדמה של גנים מרכזיים, אשר לווסת ולתחזק את מצב התאים pluriפוטנטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר היווצרות של תאי גזע מושרה pluripotent iPSCs) מושבות של האדם המעטפת הגוף ללא ויראלי/שילוב שיטות אך באמצעות RNAs שאינו משתנה (ננומטר-RNAs) בשילוב עם גורמי התחמקות החיסון הפחתת מנגנוני ההגנה הסלולריים.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

מאמר זה מתאר שיטה מבוססת תרבית אקספלנט לבידוד וגידול של תאי שריר חלקים ראשוניים של אבי העורקים האנושיים הספציפיים לחולה ופיברובלסטים עוריים. יתר על כן, מוצגת שיטה חדשנית למדידת התכווצות תאים וניתוח לאחר מכן, אשר ניתן להשתמש בה כדי לחקור הבדלים ספציפיים לחולה בתאים אלה.

בידוד של תאי שריר חלק אבי העורקים העיקריים הספציפיים למטופל ומדידות כיווץ חצי-קוונטיטיביות בזמן אמת במבחנה

המחקר של ריפוי פצעים הקשורים לפגיעה בשרירים-שלד דורש לעתים קרובות הערכה של אינטראקציות במבחנה בין תאי שוואן (SCs), קרטינוציטים ופיברובלסטים. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, התרבות והאפיון של תאים ראשוניים אלה מהעורלה האנושית.

בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית

למדו פרוטוקול מותאם לבידוד ותרבית פיברובלסטים ראשוניים מרקמת קלואיד אנושית. השיטה מספקת מקור יציב ואמין של תאים חיים לחקר הביולוגיה של קלואידים ופיתוח טיפולים.

בידוד, תרבית ואפיון פיברובלסטים עוריים ראשוניים מרקמת קלואיד אנושית

גלה סרטונים נוספים