בידוד, תרבית ואפיון פיברובלסטים עוריים ראשוניים מרקמת קלואיד אנושית
28 ביולי 2023
מחקר זה מתאר פרוטוקול אופטימלי לביסוס פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות שיכולים לספק פיברובלסטים טהורים ויציבים ביעילות ובהתמדה.
הבידוד והתרבית של פיברובלסטים ראשוניים שמקורם ברקמת קלואיד הם הבסיס למחקרים נוספים של קלואידים. פיברובלסטים מרקמה קלואידית ניתן לרכוש בקלות באמצעות פרוטוקול זה, אשר יכול לספק מקור שופע ויציב של תאים במעבדה למחקר קלואיד. התחל על ידי שימוש בפינצטה סטרילית כדי למקם את רקמת הקלואיד בצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר המכיל 10 עד 25 מיליליטר של PBS בתוספת 1% PSA.
בינתיים, הוסף ארבעה מיליליטר של תמיסת PBS PSA לכל באר של צלחת שש בארות. כעת הוציאו את הרקמה מהצינור, ושטפו פעמיים בתמיסת PBS PSA. באמצעות זוג מלקחיים סטריליים, להעביר את הרקמה ברצף מבאר אחת לאחרת.
לאחר מכן להסיר את שכבות השומן ואת האפידרמיס עם מספריים כירורגיים, משאיר את הדרמיס ללא פגע. השתמש בזוג מספריים כדי לנתח את הדרמיס החתוך לשלוש עד חמש חתיכות מילימטר מרובע ולהעביר את החתיכות לבאר הבאה עם זוג מלקחיים סטריליים. שטפו את החתיכות בתמיסת PBS PSA.
בעזרת מלקחיים מעוקרים, הניחו בצלחות פטרי 10 עד 30 חתיכות רקמת דרמיס במרווחים של פחות מחמישה מילימטרים זו מזו. מניחים את הכלים הפוכים באינקובטור עד שהנתחים מתייבשים ונדבקים לצלחת. לאחר מכן, להוסיף שבעה מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% PSA, ולדגור את הכלים כמו קודם.
לאחר שלושה ימים, החליפו חצי מהסופרנאטנט במדיום תרבית שלם. יש להתבונן בפיברובלסטים מדי יום תחת הגדלה מיקרוסקופית פי 40. הסר את חתיכות הרקמה במדיום התרבית כאשר הפיברובלסטים מגיעים למפגש של 90%.
שטפו את הפיברובלסטים ב-PBS והוסיפו שני מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA סטרילית. לאחר הדגירה על התאים באינקובטור לח, טפחו בעדינות על צלחת התרבית והתבוננו בה מתחת למיקרוסקופ. מוסיפים שני מיליליטר של מדיום שלם כדי לסיים את העיכול לאחר שרוב התאים התנתקו.
כעת העבירו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה את הצינור ב-300G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופרנאטנט בזהירות ולהשהות מחדש את כדורית התא בתווך מלא. זרעו את הפיברובלסטים בצלחת תרבית תאים בגודל תשעה סנטימטרים ודגרו באינקובטור לח.
כדי לבצע אנליזה אימונופלואורסצנטית לאחר תרבית הפיברובלסטים על כיסויים עגולים ודגירתם בנוגדנים ראשוניים ומשניים, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת DAPI למגלשת הזכוכית כדי להכתים את גרעיני התא. הניחו את הכיסויים השטופים על מגלשות זכוכית באמצעות מלקחיים. לבסוף, העבירו את הדגימות לקופסה כהה ורטובה למיקרוסקופ פלואורסצנטי.
תולדות פיברובלסטים של הרקמה נצפו חמישה ימים לאחר העיבוד. הפיברובלסטים הפגינו שיעורי התפשטות גבוהים והגיעו למפגש לאחר 10 ימים. לפיברובלסטים היו גופי תאים מוארכים ודמויי ציר, שהיו מיושרים בצרורות במפגש גבוה.
צביעה אימונופלואורסצנטית החזירה אימונופלואורסצנטיות אדומה חיובית של הפיברובלסטים ואימונופלואורסצנטיות כחולה של גרעין התא. בדיקות ציטומטריות של זרימה הראו חיוביות CD90 כמעט בכל הפיברובלסטים. מחקר זה תיאר שיטה אופטימלית וסיפק הוראות ברורות לפתרון אתגרים קיימים ולהגדלת סיכויי ההצלחה לבידוד ולתרבית של פיברובלסטים קלואידים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתאר פרוטוקול מיוטב להקמת תרביות ראשוניות של פיברובלסטים מרקמות קלואיד, המסוגל לספק פיברובלסטים טהורים ובריאים באופן יעיל ויציב. בידודם וגידולם של פיברובלסטים אלו חיוניים לקידום המחקר על קלואיד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- תרבית תאים
- בידוד פיברובלסטים
- מחקר קלואידים
רקע
- קלואידים (Keloids) הם צלקות חריגות שייתכן שיהיה מאתגר לחקור אותן.
- פיברובלסטים ראשוניים הם חיוניים להבנת הביולוגיה של קלואיד.
- ייתכן שפרוטוקולים קיימים אינם מספקים חיוניות תאים מספקת.
- מחקר זה נועד לשפר את תהליך הבידוד.
מטרת המחקר
- ביסוס שיטה מהימנה לבידוד פיברובלסטים מרקמות קלואיד.
- אספקת מקור יציב של פיברובלסטים למחקר מעבדתי.
- שיפור ההבנה של תהליך היווצרות הקלואיד והטיפול בו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בפינצטה סטרילית ובמבחנות צנטריפוגה לטיפול ברקמה.
- שטיפת רקמת קלואיד ב-PBS בתוספת 1% PSA.
- העברה רצפית של הרקמה בין בארות בלוח שש בארות.
- הקמת תנאי תרבית לצמיחת פיברובלסטים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של פיברובלסטים חיוניים מרקמות קלואיד.
- הפרוטוקול מספק מקור שופע של תאים למחקר.
- הפיברובלסטים שמרו על יציבות וחיוניות לאורך זמן.
- סייע לביצוע מחקרים נוספים על הביולוגיה של הקלואיד.
מסקנות
- הפרוטוקול המיועל יעיל לבידוד פיברובלסטים.
- מספק בסיס למחקרי קלואיד עתידיים.
- משפר את הפוטנציאל להתקדמויות טיפוליות בטיפול בקלואיד.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד ותרבית מהימנים של פיברובלסטים דרמליים ראשוניים מרקמת קלואיד נותנים מענה לצורך קריטי במודלים תאיים רלוונטיים למחלה בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות. פרוטוקול זה מאפשר גישה עקבית לאוכלוסיות פיברובלסטים טהורות ומאומתות, התומכות במחקרים מכניסטיים ובתיקוף מטרות למחלות עור פיברוטיות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי ואת הרצף התרגומי עבור בדיקת היפותזות טיפוליות בפורטפוליו מחקרי של קלואיד.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מסלולים מונעי פיברובלסטים המעורבים בפתוגנזה של קלואיד.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות אספקת תאים ראשוניים שעברו תיקוף פונקציונלי.
- מקל על מחקרים מכניסטיים להבהרת הרלוונטיות של המטרה במחלה פיברוטית.
- משפר את הביטחון החזוי לצורך קבלת החלטות ראשוניות במיון הפורטפוליו.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק מקור הניתן לשחזור של פיברובלסטים ראשוניים לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות.
- מאפשר פיתוח של בדיקות כמותיות מבוססות-תאים להערכת תרכובות.
- תומך בשחזור ובמדרגיות (scalability) בתהליכי סינון (screening workflows).
- מפחית שונות על ידי מזעור זיהומים וערבוב של תאים שאינם פיברובלסטים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים in vitro לסוגי תאים אנושיים הרלוונטיים למחלה לצורך מחקרים תרגומיים.
- מאפשרת המשכיות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני במחקר של קלואידים.
- תומכת בקידום מותאם-סיכון של מועמדים לאנטי-פיברוזיס.
- מספקת פלטפורמה לגילוי ותיקוף של ביומרקרים כאשר היא נתמכת על ידי מחקרים המשכיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
פרוטוקול זה מציב את בידוד פיברובלאסטים ראשוניים מקלואיד בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני, ובכך מאפשר תיקוף יעיל של מטרות ופיתוח בדיקות עבור תהליכי פיתוח תרופות למחלות עור פיברוטיות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים פתוגניים של קלואיד.
- סריקה: מספקת מערכות תאים מתוקפות וניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות כמותיות.
- אנליזה: מאפשרת אפיון מבוסס אימונופלואורסצנציה וציטומטריית זרימה לאישור זהות התאים.
- מחקר תרגומי: מספקת מודלים תאיים רלוונטיים למחלה לצורך הערכה פרה-קלינית של תרופות מועמדות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פרוטוקול סטנדרטי הניתן להתאמה בין צוותי מחקר ופרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר קלואידים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של זרימות עבודה עם תאי מקור.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון בתוכניות בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מקוים לסיכון וקידום של נכסים אנטי-פיברוטיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול סטרילי ברקמות ובטכניקות של תרביות תאים ראשוניות.
- נדרשת גישה למתקני תרבית תאים, לציוד אימונופלואורסצנציה ולמכשירים של ציטומטריה זרימה.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח בידוד ואפיון תאים הניתנים לשחזור.
- עשוי להידרש התאמה למקורות אחרים של רקמות עור או רקמות פיברוטיות.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות שונות בין תורמים וזמינות של רקמות.
