Name: הדמיה חיה של קליטת צינור אבקה Arabidopsis והפריה כפולה בשיטת Semi-in vitro cum septum (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: למדו שיטת SIV cum septum משופרת לניטור קליטת צינור אבקה ואינטראקציות גמטופיט ב-Arabidopsis thaliana. השיטה מגבירה את קליטת הביציות ומאפשרת תצפית יעילה של הפריה בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לשרה סימוניני וסטפנו בנסיוונגה על תרומת מבנה pFG:roGFP2-ORP1-NLS ולכריסטוף אייכנברגר, יוהאן אלמנדינגר, וינסנט סאטר וסיליה בארו על עצתם בנושא מיקרוסקופיה. אנו מודים בחביבות לעצות של ראווי פלניבלו, פיליפ דנינגר, שרון קסלר, מארק ג'ונסון, טומוקזו קוואשימה וכל שאר המשתתפים בכנס הבינלאומי לרבייה מינית של צמחים 2022 שהביעו עניין בפרוטוקול על SIV cum septum. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת ציריך ומענקים מהקרן הלאומית למדע של שווייץ ל- U.G.

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.
1. שיקולים לתכנון ניסוי ההדמיה
<ol><li>לקבוע מראש את משך ההדמיה ואת תדירות הדגימה הדרושים כדי ללכוד את התופעה הרצויה לצפייה. לדוגמה, בעקבות משפט הדגימה של ניקוויסט, תדירות הדגימה חייבת להיות גדולה מפי שניים מהתדירות הגבוהה ביותר של דגימת הקלט. לכן, כדי ללכוד במדויק תנודות ציט סינרגידיות [Ca2+], בצע הדמיה בערך כל 10 שניות, אך כדי למדוד את מהירות תאי הזרע בעת פריקת צינור האבקה, ודא רזולוציה זמנית של פחות מ 1 s10.</li>
	<li>בחר סמנים פלואורסצנטיים עבור התאים המעניינים שהם בהירים מספיק מעבר לאוטופלואורסצנטיות של הרקע. לשימוש בחיישנים ביולוגיים, בחר את הקווים הבהירים ביותר שאינם מפריעים לתפקוד התא, מכיוון שהם בדרך כלל רגישים יותר ודורשים פחות זמן חשיפה.</li>
	<li>שקול איזה סוג של מיקרוסקופ פלואורסצנטי והגדלה הם המתאימים ביותר ללכידת התופעה הרצויה. השתמש במיקרוסקופ שדה רחב ובמטרות הגדלה נמוכה כדי ללכוד אור מעומק שדה גדול יותר, ולשמור על המיקוד לאורך זמן, לצלם עצמים גדולים יותר כגון ביציות שלמות, או להשתמש בחיישנים יחסיים הרגישים לממצאים של הזזה כרומטית. השתמשו ב-CLSM או 2PEM עם מטרות הגדלה גבוהה לרזולוציה טובה יותר של עצמים תאיים ותת-תאיים, אך שימו לב לקושי לשמור על מיקוד לאורך זמן.</li>
	<li>הערך את מספר הדגימות שיש לצלם בכל ניסוי. לדוגמה, השתמש במטרה של 10x עם זמן דגימה מינימלי של ~30 שניות עבור הדמיה של שלוש ספטות והדמיה של עד 40 אירועי הפריה לכל ניסוי בגלל הזמן הדרוש לפונקציות המיקוד האוטומטי והרכישה הרב-שלבית.</li>
</ol>2. הכנת אבקה בינונית נביטה
<ol><li>הכן מדיום נביטת אבקה נוזלית (5mM CaCl2, 1mM MgSO4, 5mM KCl, 0.01% [w/v] H 3 BO3ו- 10% [w/v] סוכרוז) באמצעות מלאי Aliquot של 1 M מכל מיקרונוטריאנטים, המאוחסנים ב -20 ° C. התאם את ה- pH ל- 7.5 עם 0.1 M KOH. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים. הערה: רמת החומציות עשויה לרדת עם הזמן.</li>
	<li>הוסף 2.5 מ"ל של מדיום נוזלי לכוס של 10 מ"ל, והוסף באיטיות 32 מ"ג של אגרוז נקודת התכה נמוכה במיוחד (~ 1.3%) עם מוט ערבוב מסתובב במהירות כדי למנוע גושים.</li>
	<li>ממיסים אגרוז על פלטה חמה ב 65 מעלות צלזיוס, ואגוז את הכד כדי לאסוף כל עיבוי מהצדדים.</li>
	<li>פיפטה 130 μL של בינוני לתוך באר 14 מ"מ של צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ, ומסובבים את המנה עד המדיום מכסה את הבאר.</li>
	<li>שואפים סך של 40 μL עם פיפטה ממרכז המנה, משאיר מאחור נפח כולל של 90 μL. הערה: ניתן לשאוב יותר מדיום מהבאר כדי להשיג נפח כולל נמוך יותר; זה עשוי להיות נחוץ למטרות הגדלה גבוהה עם מרחקי עבודה נמוכים. עם זאת, ככל שכרית האגר דקה יותר, כך היא תתייבש מהר יותר.</li>
	<li>קררו את הכלי על בלוק אלומיניום בתא לחות כדי להבטיח קירור אחיד. אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה לשימוש למחרת בבוקר.</li>
</ol>3. בימוי פרחוני של תורמי מחיצה, תורמי סטיגמה ותורמי אבקה
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig01.jpg"> איור 1: היערכות פרחונית של תורמי מחיצות, תורמי סטיגמה ותורמי אבקה. (A) שלבים של פרחי ארבידופסיס (Ler-0) בתוך תפרחת. ניצנים בשלב 12B, שיש להם עלי כותרת שעומדים להיפתח ואנתרים צהובים, צריכים להיות מסולקים על ידי הסרת כל עלי הגביע, עלי הכותרת והאבקנים. פיסטולים (המכילים את נקבת יצרנית הגמטופיטים) ניתנים לשימוש כתורמי מחיצה 24 שעות מאוחר יותר. (B) שלבים של פרחי Arabidopsis (Col-0) בתוך תפרחת. ניצנים בשלב 12B, שיש להם אנטרים צהובים וסטיגמות שבקושי יוצאות מעלי הכותרת, צריכים להיות מסולקים על ידי הסרת כל עלי הגביע, עלי הכותרת והאבקנים. לאחר מכן ניתן להשתמש בפיסטולות כתורמי סטיגמה 24 שעות מאוחר יותר, כאשר הן אמורות להיות מואבקות על ידי פרחים (המכילים את סמן הגמטופיט הזכרי) שהם פתוחים ומשירים אבקה. סטיגמות מואבקות יש לנתח בתוך 1 שעה של האבקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol><li>בבוקר שלפני ההדמיה, בחרו צמחי ארבידופסיס שישמשו כתורמי מחיצה ותורמי סטיגמה; לוודא שהם בריאים ולאחרונה החלו לייצר סיליקים. הערה: Landsberg erecta (Ler-0) הוא חיבור טוב לשימוש כתורם מחיצה, שכן הספטה שלו חסונה, ויש צמתים קטנים בין הביציות. קולומביה (Col-0) היא תוספת טובה לשימוש כתורם סטיגמה מכיוון שנראה שהם תורמים לצמיחת צינור אבקה.</li>
	<li>אמסקול לפחות שלושה פרחים מתורם מחיצה שלב 12B ו-12 פרחים מתורם סטיגמה שלב 12B על-ידי הסרת האבקנים, עלי הגביע ועלי הכותרת שלהם (איור 1A, B). הסר גם פרחים ישנים יותר על אותה תפרחת, אשר עלולה להאביק את הפרח המסולק.</li>
	<li>בבוקר, 24 שעות מאוחר יותר, להאביק את תורמי הסטיגמה עם פרחים תורם אבקה (למשל, מכילים צינור אבקה או סמנים תאי זרע) כי הם משירים אבקה בקלות. ההאבקה מושלמת כאשר הצלקות מכוסות כמעט לחלוטין באבקה (איור 1B).</li>
</ol>4. דיסקציה של מחיצה
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig02.jpg"> איור 2: מדריך מהיר לדיסקציה של מחיצה וסטיגמה . (A) שלבים של דיסקציה של מחיצה. נעצו את הפיסטיל על סרט דו-צדדי עם מחט מזרק אינסולין, ובצעו חתכים בצומת השחלה הסגנונית ובצומת השחלה-פדיקול, ולאחר מכן חתך רדוד לאורך המחיצה של כל קרפל (שלב 1). קלפו את דפנות הקרפל בחזרה אל סרט הדבק (שלב 2). חותכים את replum מתחת למחיצה העליונה (שלב 3). חותכים את המחיצה בסגנון, ומסירים באמצעות מלקחיים בפדיקל (שלב 4). מניחים את המחיצה על מצע אגר, ומטמיעים בעדינות במלקחיים. (B) שלבים של ניתוח סטיגמה. נעצו את הפיסטיל (שהואבק &lt;1 שעה לפני) על סרט דו-צדדי, וחתכו בצומת השחלה הסגנונית בעזרת סכין גילוח (שלב 6). מניחים את הצלקת על מדיום אגר עם מחט אינסולין ליד המחיצה, ומתאימים את המרחק לכ-250 מיקרומטר (שלבים 7-8). ודא כי בריכה נוזלית למחצה נוצרת סביב micropyles ובסיס של סגנונות (שלב 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol><li>שלושים דקות לאחר ההאבקה, אספו פיסטולים בריאים ובוגרים מתורם המחיצה בפדיקור, והניחו אותם על סרט דביק דו-צדדי טרי המורכב על מגלשת זכוכית, כשהסטיגמה מבצבצת ממש מקצה הטייפ. הערה: הגבל את זמן הדיסקציה שבו הפיסטלים נמצאים על סרט הדבק כדי להבטיח שהוא קצר ככל האפשר. הדיסקציה צריכה להתבצע בלחות גבוהה, אשר ניתן להשיג על ידי הצבת מכשיר אדים ליד המגלשה.</li>
	<li>הצמידו את הפיסטיל היטב לסרט על ידי לחיצה עדינה על הפדיקל ולאורך השחלה באמצעות הצד האחורי של מחט מזרק אינסולין חדשה לפני הסרת שאריות עלי הגביע, עלי הכותרת והאבקנים שנותרו מהכריתה.</li>
	<li>תחת סטריאוסקופ, השתמשו במחט מזרק אינסולין כדי לבצע שני חתכים לכל קרפל בצומת השחלה הסגנונית ובצומת השחלה-פדיקול, ולאחר מכן חתכים רדודים לאורך המחיצה של כל קרפל (איור 2, שלב 1). הערה: חיתוך עמוק מדי לאורך המחיצה ינתק ביציות בפוניקולוס.</li>
	<li>קלפו את דפנות השחלה בזהירות על סרט הדבק (איור 2, שלב 2), והחליקו את המחט בעדינות בין שתי הספטות כדי לחתוך את המחט לכל אורך הפיסטיל מבלי להפריע לביציות (איור 2, שלב 3). הערה: חתכו את הרפלום בכיוון שבין הסגנון לפדיקל כדי להבטיח שהביציות במחיצה העליונה יופרעו כמה שפחות.</li>
	<li>חתכו את המחיצה העליונה בעדינות גם בצומת עם הסגנון וגם עם הפדיקול, והסירו את המחיצה עם מלקחיים מצד הפדיקל (איור 2, שלב 4). הערה: שמור על חתך זה ישר ועדין כך שהמחיצה תישאר שטוחה ולא תתעקם.</li>
	<li>מניחים את המחיצה שטוחה ככל האפשר על המדיום כך שהמיקרופיילים של הביציות פונים כלפי מעלה ובאותו מישור מוקד. לחצו בעדינות על המחיצה לתוך המדיום עד שהביציות נטמעו רק מעט בתווך (איור 2, שלב 5). הערה: קריטי שהמחיצה תמוקם כך שהמיקרופיילים של הביציות יהיו נגישים לצינורות האבקה (ניתן לסדר מחדש בעדינות כל ביציות שאינן נגישות באמצעות מחט). בריכה קטנה של נוזל צריכה להיווצר סביב המחיצה לאחר הטבעה.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.1-4.6 עבור עד שני פיסטולים נוספים, והצבת הספטה מקצה לקצה.</li>
</ol>5. דיסקציה של סטיגמה
<ol><li>הניחו את הפיסטלים של תורם הצלקת המואבק על סרט דביק דו-צדדי טרי המורכב על מגלשת זכוכית, כך שהצומת בסגנון השחלה נמצא מחוץ לקצה הסרט (איור 2, שלב 6).</li>
	<li>השתמשו בסכין גילוח רענן כדי לחתוך את הסגנון ישר כלפי מטה ולהתרומם כדי לשמור על הצלקת מחוברת ללהב (איור 2, שלב 6). הערה: גזור בקצה הסרט לקבלת החיתוך הנקי ביותר.</li>
	<li>הסירו את הצלקת מהלהב בעזרת מחט מזרק אינסולין, והניחו אותה שטוחה במרחק של כ-250-300 מיקרומטר מהביציות (איור 2, שלבים 7-8). הערה: הסגנון צריך להיות בכיוון אופקי על צידו; אחרת, רוב צינורות האבקה יגדלו למטה מתחת למחיצה. בריכה קטנה של נוזל בכניסה של הסגנון צריך להופיע לאחר שהוא כבר שוכב על המדיום במשך 1 דקה; זהו סימן טוב, מכיוון שלצינורות האבקה תהיה יציאה חלקה מהסגנון.</li>
	<li>חזור על שלבים 5.1-5.3 עבור עד 12 סטיגמות, והצב שתיים מכל צד של כל מחיצה. חפש בריכה קטנה של נוזל שנוצר סביב micropyle של הביציות; זה מסייע לנגישות ולמיקוד של צינורות האבקה לשקי העוברים (איור 2, שלב 9). הערה: יש להגביל את משך הזמן שבו התבשיל פתוח כדי למנוע התייבשות של המדיום והביציות.</li>
</ol>6. הדמיה
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig04.jpg"> איור 3: SIV cum septum imaging scheme. (A) מערך מלא של SIV cum septum עם 12 סטיגמות מואבקות ו-3 ספטה, כפי שניתן לראות דרך סטריאוסקופ. (B) תמונות ממוזגות של מערך מחיצת SIV cum המלא שנראה ב- A 5 שעות לאחר הדגירה באמצעות מטרה של 10x, כאשר חמשת אזורי הסקירה (~ 1 מ"מ כל אחד) מסומנים לרכישה רב-שלבית. הקופסאות הירוקות מראות את הביציות שקיבלו צינורות אבקה שעברו פיצוץ נפיץ בסינרגידים. (C) מבט מקרוב על אזור סקירה 2 בנקודות זמן שונות. כ -3 שעות לאחר הדגירה בתא הלחות במיקרוסקופ, צינורות האבקה צריכים להגיע ליד המיקרופיילים, ועל ידי 6 שעות של הדמיה, רוב הביציות היו צריכות לקבל כראוי צינורות אבקה (ריבועים ירוקים); ביציות אלה עוברות פיצוץ של צינור אבקה (כוכבית). פסי קנה מידה = (A) 5 מ"מ, (B,C) 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol><li>לאחר שהדיסקציה הסתיימה והצליחה מוכנה לצילום, תנו לה לדגור בתא לחות במיקרוסקופ שנשמר בלחות יחסית של 92% ו-21 מעלות צלזיוס. הערה: אם אין תא לחות זמין עבור המיקרוסקופ, ריפוד הקצוות החיצוניים של המכסה והצלחת בנפח קטן של מים יעזור לשמור על רמה גבוהה של לחות בצלחת.</li>
	<li>הבא את הדגימות למיקוד תחת שדה בהיר בעוצמת אור חלשה, ולאחר מכן עבור לאור פלואורסצנטי, תוך סימון אזורי הדגימה בסקירת הבמה שיש לצלם. הערה: בהגדלה של פי 10 ניתן לסמן כחמישה אזורים בסך הכל שלוש ספטות (איור 3). הגבל את משך הזמן המשמש לסימון אזורי הסקירה כדי למזער את רעילות האור או את התחממות הדגימה על ידי האור הפלואורסצנטי.</li>
	<li>התחל הדמיה באמצעות סכימת רכישה רב-שלבית עם פונקציית מיקוד אוטומטי בתחילת כל אזור סקירה. מכיוון שצינורות אבקה ייצאו מהסגנון ~ 1 שעות לאחר הדגירה על הדגימה, לעכב את הרכישה ב -2 שעות או עד שצינורות האבקה יגיעו למיקרופייל. ודא שהמיקוד האוטומטי מוגדר עם טווח של 100 מיקרומטר (צעדים גדולים של 7 מיקרומטר וצעדים עדינים של 1 מיקרומטר) כדי לשמור על הביציות בפוקוס כאשר המחיצה זזה מעט ושוקעת עם הזמן.</li>
	<li>עצור את רכישת התמונה ~ 9 שעות לאחר תחילת הדגירה של הדגימה, שכן בשלב זה, רוב הביציות היו צריכות להימשך ולקבל צינור אבקה. הערה: אם מספר נמוך של ביציות מושכות צינורות אבקה, תצפית זהירה על המנה תחת סטריאוסקופ שימושית כדי לקבוע כיצד ניתן לשפר את כיוון הביצית או הסגנון בפעם הבאה.</li>
</ol>

<ol><li>Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+mutant+feronia+disrupts+the+female+gametophytic+control+of+pollen+tube+reception%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception.</a> Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).</li>
<li>Rotman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+control+of+male+gamete+delivery+during+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).</li>
<li>Palanivelu, R., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+short-range+ovule+signals+attract+or+repel+Arabidopsis+thaliana+pollen+tubes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro.</a> BMC Plant Biology. 6, 7(2006).</li>
<li>Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+F-actin+dynamics+during+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).</li>
<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+changes+dynamically+during+the+interaction+of+the+pollen+tube+with+synergid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells.</a> Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).</li>
<li>Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcium+dialog+mediated+by+the+FERONIA+signal+transduction+pathway+controls+plant+sperm+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery.</a> Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).</li>
<li>Denninger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-female+communication+triggers+calcium+signatures+during+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis.</a> Nature Communications. 5, 4645(2014).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+calcium+spikes+during+double+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis.</a> Nature Communications. 5, 4722(2014).</li>
<li>Ponvert, N., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergid+calcium+ion+oscillations+define+a+new+feature+of+pollen+tube+reception+critical+for+blocking+interspecific+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).</li>
</ol>

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.

כתב יד זה מציג פרוטוקול יעיל להדמיית קליטת צינור אבקה והפריה כפולה בארבידופסיס. השיטה המשופרת, SIV cum septum, מגדילה מאוד את האחוז ואת המספר הכולל של אירועי קליטה מוצלחים של צינור אבקה הניתנים לצפייה בכל מפגש הדמיה. התוצאות המייצגות המוצגות כאן מדגימות מפגש הדמיה עם 41 אירועי קליטה מוצלחים של צינור האבקה ו-10 ביציות המראות פגמים בקליטה (~80% יעילות). זה יותר מכפול ממספר אירועי קליטת צינור האבקה המוצלחים שצולמו בסך הכל בשמונה מפגשי הדמיה באמצעות שיטת SIV המקורית של ביציות שנכרתו (וידאו 1</strong...

יצירת צאצאים ייחודיים גנטית באורגניזמים המתרבים מינית תלויה באיחוי מוצלח של גמטות זכריות ונקביות. בצמחים פורחים, האינטראקציה של שתי גמטות זכריות (תאי זרע) עם שתי גמטות נקביות (תא ביצית ותא מרכזי) במהלך הפריה כפולה תלויה בשחרור זרע מצינור האבקה (הגמטופיט הגברי). תהליך זה, הנקרא קליטת צינור אבקה, נשלט במידה רבה על ידי התאים הסינרגידים השוכנים בתוך שק העובר (הגמטופיט הנשי)1,2. מכיוון שקליטת צינור האבקה מתרחשת עמוק בתוך הפרח, נקבעה שיטה המאפשרת הדמיה של תאים חיים של התהליך, הנקראת קליטת צינור אבקה למחצה במבחנה (SIV). בשיטה זו, ביציות Arabidopsis נכרתו מונחות על מדיום נביטת אבקה נוזלי למחצה וממוקדות על ידי צינורות אבקה הגדלים דרך הצלקת והסגנון של פיסטיל שנקטע בצומת דרכי העברת הסגנון 3,4. מאז פיתוח טכניקה זו, תצפיות מפורטות הובילו למספר תגליות סביב הנחיית צינור אבקה, קליטה והפריה. בין היתר, תגליות אלה כוללות רכישת יכולת מיקוד של צינור אבקה על ידי צמיחה באמצעות סטיגמה3, הופעת תנודות סידן תוך תאיות בסינרגידים עם הגעת צינור האבקה 5,6,7,8,9, והדינמיקה של שחרור תאי זרע והפריה עם פיצוץ צינור אבקה 10 . עם זאת, מכיוון שטכניקה זו מסתמכת על כריתת ביציות, התצפיות על ההפריה מוגבלות במספרן, וקליטת צינור האבקה היא לעתים קרובות חריגה, וכתוצאה מכך כישלון של קרע בצינור האבקה (וידאו 1 וקובץ משלים 1). לכן, יש צורך בגישה יעילה יותר המאפשרת ניתוחים בתפוקה גבוהה של קליטת צינור אבקה והפריה.
בפיתוח פרוטוקול זה, נבדקו מספר גישות חדשות לניתוח קליטת צינור אבקה, החל מהשיטות ה"חוץ גופיות" ביותר ועד לשיטות "in vivo" ביותר, והוחלט על טכניקה יעילה המבוססת על כריתה של המחיצה כולה, המאפשרת עד 40 תצפיות של הפריה ביום. כאן מתוארים הניואנסים והנקודות הקריטיות של הטכניקה, כולל בימוי פרחים, דיסקציה, הכנה בינונית והגדרות הדמיה. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, יש להקל על מחקר המתמקד בהנחיית צינור אבקה, קליטת צינור אבקה והפריה כפולה. גודל הדגימות הגבוה יותר שהשיטה מאפשרת צפוי לחזק את האיתנות המדעית של המסקנות שהוסקו מניסויי הדמיה חיים. היישומים האפשריים של טכניקה זו כוללים, אך אינם מוגבלים, לביצוע תצפיות של השינויים המולקולריים והפיזיולוגיים בריכוזי סידן ציטוסולי ([Ca2+]cyt), pH, או H 2 O2 במהלךאינטראקציות gametophyte באמצעות שימוש biosensors מקודדים גנטית. יתר על כן, שינויים ציטולוגיים, כגון ניוון של סינרגיד הקבלה, נדידת תאי זרע, או קאריוגמיה, ניתן לראות בקלות רבה יותר באמצעות שיטה משופרת זו. לבסוף, ניתן לעקוב אחר העיתוי של שלבי ההפריה השונים תחת מיקרוסקופ שדה רחב, ולאחר מכן ניתן לבצע ניתוחים מפורטים יותר באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) או מיקרוסקופ עירור שני פוטונים (2PEM) לרזולוציה גבוהה יותר ולשחזור תלת ממדי.

<table><tbody><tr><td>שקופית זכוכית 1 מ"מ&nbsp;</td><td>אפרדיה&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16211551 צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ (באר 14 מ"מ)מט</td><td>&nbsp;</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי&nbsp;</td><td>רוט&nbsp;</td><td>CN93.1</td><td></td></tr><tr><td>קולומביה (Col-0)&nbsp;</td><td>מרכז המניות נוטינגהאם ארבידופסיס (NASC)</td><td></td><td>תורם סטיגמה</td></tr><tr><td>ניתוח היקף&nbsp;</td><td>אולימפוס&nbsp;</td>מחט אינסולין <td>SZX2-ILLT</td><td></td></tr><tr><td>(0.3 גרם)</td><td>BD</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>לנדסברג ארקטה (Ler-0)&nbsp;</td><td>מרכז המניות של נוטינגהאם ארבידופסיס (NASC)</td><td></td><td>תורם מחיצה</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>Merck</td><td>5886</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>רוט</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>Beldura</td><td>7026797</td><td></td></tr><tr><td>סרט דו צדדי סקוטי&nbsp;</td><td>סקוטש</td><td>768720</td><td>פחות עבה וטוב לדיסקציה של סטיגמה</td></tr><tr><td>נתרן כלורי&nbsp;</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ריאגנטים סוכרוז ITW</td><td>A2211,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tesa סרט דו צדדי&nbsp;</td><td>Tesa</td><td>05681-00018</td><td>דביק מאוד וטוב לדיסקציה של מחיצה</td></tr><tr><td>טמפרטורת ג'ל נמוכה במיוחד אגרוז</td><td>FMC SeaPrep</td><td>50302</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה של קליטת צינור אבקה arabidopsis והפריה כפולה בשיטת semi-in vitro cum septum

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

בצמחים פורחים, הצמיחה וההכוונה של צינור האבקה (גמטופיט זכרי) בתוך הפיסטיל וקליטת צינור האבקה על ידי נקבת הגמטופיט חיוניים להפריה כפולה ולהתפתחות זרעים לאחר מכן. יחסי הגומלין בין הגמטופיטים הזכריים והנקביים במהלך קליטת צינור האבקה מגיעים לשיאם בקרע של צינור האבקה ובשחרור שני תאי זרע כדי לגרום להפריה כפולה. מכיוון שצמיחת צינור האבקה וההפריה הכפולה חבויים עמוק בתוך רקמות הפרח, קשה להבחין בתהליך זה in vivo.
שיטת SIV (Semi-in vitro ) להדמיית תאים חיים של דישון בצמח המודל Arabidopsis thaliana פותחה ויושמה במספר חקירות. מחקרים אלה סייעו להבהיר את המאפיינים הבסיסיים של האופן שבו תהליך ההפריה מתרחש בצמחים פורחים ואילו שינויים תאיים ומולקולריים מתרחשים במהלך האינטראקציה של הגמטופיטים הזכריים והנקביים. עם זאת, מכיוון שניסויי הדמיה אלה של תאים חיים כרוכים בכריתה של ביציות בודדות, הם מוגבלים למספר נמוך של תצפיות בכל מפגש הדמיה, מה שהופך גישה זו למייגעת וגוזלת זמן רב. בין שאר הקשיים הטכניים, לעתים קרובות מדווח על כישלון של צינורות האבקה להפרות את הביציות במבחנה, מה שמבלבל מאוד ניתוחים כאלה.
כאן, פרוטוקול וידאו מפורט להדמיית קליטה והפריה של צינור אבקה באופן אוטומטי ובתפוקה גבוהה, המאפשר עד 40 תצפיות של קליטת צינור אבקה וקרע בכל מפגש הדמיה. בשילוב עם השימוש בחיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית וקווי סמן, שיטה זו מאפשרת יצירת דגימות גדולות בהשקעת זמן מופחתת. ניואנסים ונקודות קריטיות של הטכניקה, כולל בימוי פרחים, דיסקציה, הכנה בינונית והדמיה, מפורטים בבירור בפורמט וידאו כדי להקל על מחקר עתידי על הדינמיקה של הנחיית צינור אבקה, קליטה והפריה כפולה.

כדי להעריך את העיתוי של ניוון גרעיני בסינרגיד הקלטן ביחס לקרע בצינור האבקה בארבידופסיס, כמו גם כדי לבחון אם הסינרגיד השמאלי או הימני נועד מראש להפוך לסינרגיד הקולט, שיטת SIV cum septum שתוארה כאן שימשה באמצעות סמן גרעיני גמטופיט נשי מוערם עם סמן ציטוסולי סינרגידי (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) כתורם המחיצה וסמן גמטופיט זכר (pLAT52:R-GECO) כתורם האבקה. הספטה והסטיגמות המואבקות נותחו 24 שעות לאחר הכריתה, לפי סעיפים 4-5 לפרוטוקול, והונחו על כלי זכוכית עם מדיום שהוכן יום קודם. ...

כאן, אנו מתארים שיפור של שיטת Semi-in vitro (SIV) לצפייה בהנחיית צינור אבקה וקליטה ב- Arabidopsis thaliana, אשר מגביר את הקבלה של הביציות. ניתן לשלב את שיטת SIV cum septum בעלת תפוקה גבוהה עם קווי סמן gametophyte וחיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית כדי לפקח על התהליך הדינמי של ההפריה.

הדמיה חיה של קליטת צינור אבקה Arabidopsis והפריה כפולה בשיטת Semi-in vitro cum septum

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...

שיטה זו תקל על מחקר על רבייה מינית בארבידופסיס בכך שתאפשר תצפית על אינטראקציות גמטופיטים ביעילות גבוהה ועם מספר דגימה גבוה לכל מפגש הדמיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא על ידי שמירה על הביציות על המחיצה, כמות ופתיחות של הביציות גדל מאוד על פני שיטות קודמות. טכניקת הדיסקציה יכולה להיות קשה בתחילה ודורשת יד יציבה.לכן, מומלץ להתאמן כמה פעמים על פיסטולות מסולקות לפני תחילת הניסוי. התחל בהכנת אמצעי נביטת האבקה כפי שמוסבר בטקסט. לאחר שהאגר נמס לחלוטין, פיפטה 130 מיקרוליטר של המדיום לתוך באר 14 מ"מ של צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ.מסובבים את המנה עד שהמדיום מכסה את הבאר. שואפים 40 מיקרוליטר של מדיום ממרכז המנה באמצעות פיפטה, ומשאירים מאחור 90 מיקרוליטר של מדיום. כדי להבטיח קירור אחיד של המדיום, קררו את הכלי על גוש אלומיניום בתא לחות לפני אחסון הצלחות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.בבוקר שלפני ההדמיה, בחרו צמחי ארבידופסיס בריאים שהחלו לאחרונה לייצר כתורמי מחיצה ותורמי סטיגמה. הסר את הפרחים הישנים יותר על התפרחת לפני הסרת שלושת השלבים 12B תורם פרחים תורם 12B ו 12 שלב 12B סטיגמה תורם פרחים על ידי הסרת אבקנים, גביעים, עלי כותרת ועלי הכותרת שלהם. בבוקר 24 שעות לאחר מכן, להאביק את תורמי הסטיגמה עם פרחי תורם האבקה כי הם משירים אבקה בקלות.ההאבקה מושלמת כאשר הסטיגמות מכוסות כמעט לחלוטין באבקה. 30 דקות

live-imaging-arabidopsis-pollen-tube-reception-double-fertilization

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

החתמה היא תופעה במפעל ורבייה יונק. מתילציה DNA ממלא תפקיד חשוב במנגנוני של הטבעה. האנדוספרם בידוד וקביעת מעמד מתילציה של גנים...

קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח...

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

פרוטוקול זה מתאר שיטת התבוננות מופרה ב תודרנית באמצעות סיווג ביצית ואחריו את הבדיקה של היווצרות תבנית העובר תחת מיקרוסקופ.

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

כתב יד זה מתאר במבחנה ביצית טיפוח שיטה המאפשרת הדמיה לחיות תאים של תודרנית מופרות, העוברים. בשיטה זו הוא מנוצל כדי להמחיש את הדינמיקה תאיים במהלך זיגוטה קיטוב מפרט הגורל תא בפיתוח עוברי.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

אנו מדגימים שיטה לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה על בסיס מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידרופזיס הפריה כפולה באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי.

הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

שיטה משופרת למדידת פרופילי הידרציה של אבקה ב- Arabidopsis thaliana מתוארת כאן. השיטה החדשה מציעה רזולוציה גבוהה יותר, אינה פולשנית וניתנת לשחזור רב. הפרוטוקול מהווה כלי חדש לניתוח עדין יותר של התהליכים המווסתים את השלבים המוקדמים של ההאבקה.

בדיקה ביולוגית ברזולוציה גבוהה, מדגן יחיד, In Vivo אבקת הידרציה עבור Arabidopsis thaliana

פרוטוקול זה מתאר הכנת דגימות שלמות של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי Arabidopsis thaliana . השיטה דורשת רק ציוד מעבדה נפוץ, כגון מחט הזרקה ומלקחיים מדויקים, ומאפשרת הדמיה של תאים חיים פלואורסצנטיים ברזולוציה גבוהה של תאי אנדוספרם בזרעים מתפתחים ובוגרים כאחד.

הכנת רקמה שלמה לאנליזה מיקרוסקופית של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי ארבידופסיס מתפתחים ובוגרים

תנועת כרומוזומים במהלך פרופאזה מיוטית היא תופעה לא מובנת היטב שהיא בסיסית להיווצרות נבגים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה, ניתוח וכימות של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית במיוציטים זכריים של Arabidopsis thaliana .

אפיון הדמיה חיה של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית זכרית ב- Arabidopsis thaliana

זהו תפוקה גבוהה cryopreservation זרע פרוטוקול דג הזברה. זרע cryopreserved בפרוטוקול זה יש ממוצע של 25% פוריות הפריה חוץ גופית לאחר מכן והוא יציב לאורך שנים רבות.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

למדו שיטת SIV cum septum משופרת לניטור קליטת צינור אבקה ואינטראקציות גמטופיט ב-Arabidopsis thaliana. השיטה מגבירה את קליטת הביציות ומאפשרת תצפית יעילה של הפריה בצמחים.

הדמיה חיה של קליטת צינור אבקה Arabidopsis והפריה כפולה בשיטת Semi-in vitro cum septum

גלה סרטונים נוספים