Name: בידוד ותרבית של מקרופאגים סינוביאליים ראשוניים ופיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים מורין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: למד פרוטוקול לבידוד מקרופאגים ופיברובלסטים סינוביאליים ראשוניים מרקמת דלקת מפרקים מורין. השיטה מאפשרת ניתוח מנגנונים פתולוגיים בדלקת פרקים שיגרונית עם טוהר גבוה של תאים מבודדים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לצוות האגף לתמיכה במחקר רפואי, למרכז התמיכה במחקר מתקדם (ADRES), ולחברי החטיבה לפתופיזיולוגיה אינטגרטיבית, מרכז פרוטאו-מדע (PROS), אוניברסיטת אהימה (Ehime), על עזרתם הטכנית ותמיכתם המועילה. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענקי KAKENHI JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (ל- NS) ו- JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (ל- YI); מענקים מקרן המחקר הרפואי של אוסקה למחלות עקשניות, קרן נקטומי, האגודה היפנית לחקר עצמות ומינרלים (JSBMR) מענק כוכבים עולים, קרן סומיטומו, קרן המחקר הרפואי SENSHIN, קרן הזיכרון מוצ'ידה (ל- NS); ומענק מחקר רפואי של קרן המדע טקדה, מענק פרויקט UCB יפן (UCBJ) ומענק JSBMR Frontier Scientist לשנת 2019 (ל-YI).

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת Ehime ובוצעו בהתאם להנחיות אוניברסיטת Ehime לניסויים בבעלי חיים (37A1-1*16).
1. הכנת מכשירים, ריאגנטים ומדיום תרבית
<ol><li>הכינו את מדיום התרבית באופן הבא: השלימו את מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית (אנטי-אנטי).</li>
	<li>הכן את מדיום העיכול כדלקמן: להשלים את המדיום תרבית עם 1 מ"ג / מ"ל collagenase סוג IV. יש להתאים את ריכוז ה-collagenase ממש לפני השימוש.</li>
	<li>יש לדלל קולגן מסוג I-C לריכוז של 0.15 מ"ג/מ"ל בתמיסת HCl של 1 mM. הציפו את כלי התרבית (בקוטר של 40 או 60 מ"מ) בתמיסת הקולגן המדוללת. לאחר 6-12 שעות בטמפרטורת החדר, מוציאים את תמיסת הקולגן מהכלים ומייבשים בטמפרטורת החדר. ניתן לשמור את הכלים המצופים בקולגן בטמפרטורת החדר למשך שבוע אחד לפחות. יש לשטוף את הכלים המצופים מראש במי מלח חוצצים פוספט (PBS) או בינוני לפני השימוש.</li>
	<li>הכינו כלי ניתוח סטריליים, כגון מספריים, פינצטה עם קצוות משוננים ופינצטה עדינה. יש להשרות 70% אתנול לפני השימוש.</li>
</ol>2. הכנת רקמת סינוביטיס בעכברים ( איור 1A)
<ol><li>הכינו עכבר עם דלקת מפרקים דלקתית בכפות האחוריות. הערה: נקבות עכברי C57BL/6 (18-20 גרם), 7-8 שבועות לאחר הלידה, עם דלקת מפרקים הנגרמת על ידי נוגדני קולגן (CAIA) או דלקת מפרקים בהעברת סרום K/BxN (STA) שימשו לפרוטוקול זה8. בידוד SMs מרקמה לא נפוחה (כלומר, בריאה) עשוי להיות קשה, כמו מספר התאים אינו מספיק.</li>
	<li>מרדימים את העכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו-16 מ"ג/ק"ג קסילזין. נקו את העכברים עם 70% אתנול.</li>
	<li>פתח את אזור החזה עם מספריים כדי לחשוף את הלב. חותכים את האפרכסת הימנית של הלב עם מספריים, ולאחר מכן תוקעים מחט פרפר 23 G לחדר השמאלי דרך קודקוד הלב, ואחריו ריפלוקס של 15-20 מ"ל של PBS סטרילי באמצעות מזרק כדי להסיר באופן ידני דם היקפי (כ 1 מ"ל / 2 שניות).</li>
	<li>נטרלו את הכפות האחוריות על ידי חיתוך העור באמצעות מספריים ומשיכת העור באמצעות פינצטה עם קצוות משוננים. הערה: לאחר שלב זה, מומלץ להשתמש בפינצטה לטיפול בדגימות. אין לגעת ברקמה מעוטרת באצבעות, כדי למנוע חיבור של שיער מורין.</li>
	<li>נקע את המפרקים metatarsophalangeal על ידי משיכה, ואחריו חיתוך הרצועות של המפרקים באמצעות מספריים כדי להסיר את הבהונות.</li>
	<li>חותכים את הגידים של שרירי הרגליים התחתונות ליד הקרסול באמצעות מספריים. אחזו בגיד בפינצטה וקילפו את השרירים בסמיכות ברגל התחתונה כדי לחשוף את השוקה. הסר את הפיבולה.</li>
	<li>נקע את מפרק הברך על ידי משיכה, ולאחר מכן חיתוך רצועות המפרקים באמצעות מספריים כדי לנתק את השוקה עם הכף האחורית הנפוחה. שמור את הדגימות בתרבית קרה כקרח בינונית (0.3 מ"ל/ס"מ2) עד לעיבוד לשלב 3.1.</li>
</ol>3. עיכול רקמת סינוביטיס ( איור 1B)
<ol><li>שאפו את מדיום התרבית, הימנעו מהדגימה, ולאחר מכן הוסיפו מדיום תרבית טרי (0.3 מ"ל/ס"מ2). חזרו על תהליך הכביסה שלוש או ארבע פעמים. הערה: משלב זה, הטיפול בדגימות צריך להתבצע באופן אספטי בספסל נקי או בארון בטיחות.</li>
	<li>נקע את כל מפרקי הדגימות על ידי משיכה באמצעות פינצטה עדינה בתווך התרבית תחת סטריאומיקרוסקופ (בהגדלה של פי 10-20). פינצטה עדינה נוחה בשלב זה. הסירו את השוקה וכמה שיותר כלי דם, גידים ורצועות. היזהר לא לשבור את העצמות בעת פריקה.</li>
	<li>הכינו שתי שפופרות של 15 מ"ל לדגימה. מעבירים את העצמות המנותקות עם רקמות רכות לצינור הראשון של 15 מ"ל באמצעות פינצטה. הוסף 4 מ"ל של מדיום העיכול לכל דגימה, המתקבל משתי הכפות האחוריות, לתוך הצינור.</li>
	<li>כדי לאסוף תאים שיוריים ושברי רקמות, להעביר את המדיום שבו הדגימה נכללה לצינור השני 15 מ"ל. צנטריפוגה את המדיום ב 500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת supernatant, resuspend את הגלולה עם 1 מ"ל של מדיום העיכול ולהעביר את תמיסת התא ואת מקטע הרקמה לצינור הראשון 15 מ"ל המכיל כמעט את כל הרקמה (סה"כ 5 מ"ל של עיכול בינוני / כפות אחוריות).</li>
	<li>לעכל את הדגימה במשך 60-120 דקות ב 37 ° C עם ניעור בתנור היברידי. הערה: יש להחליט על הזמן האופטימלי לעיכול הדגימות. הזמן תלוי במידת הנפיחות בקרסוליים ובקולגנאזות. ברוב המקרים, 60-120 דקות מספיק. לאחר 60 דקות של דגירה, לאסוף חלק מהדגימה מעוכל על ידי pipetting, ולצפות תחת מיקרוסקופ. אם העיכול אינו מספיק, הדגירה צריכה להמשיך, ואת העיכול נבדק כל 30 דקות.</li>
	<li>מפטפט היטב את הפתרון. סנן את תמיסת התא דרך מסננת תאים (גודל נקבוביות 40 מיקרומטר) לצינור של 50 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של מדיום תרבית לצינור 50 מ"ל דרך מסננת התא. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר הסרת supernatant, resuspend עם 10 מ"ל של מדיום תרבות. חזור על הצנטריפוגה. לאחר הסרת supernatant, resuspend עם 2 מ"ל של מדיום תרבות.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65196/65196fig01.jpg"> איור 1: הליך הדגימה של רקמת דלקת מפרקים מורין ועיכול קולגנאז . (A) (i) כף אחורית מורין עם דלקת מפרקים דלקתית. (ii) הסרת העור בכפה האחורית. (iii) נקע של המפרקים metatarsophalangeal והסרת הבהונות. (4) חיתוך הגידים בקרסול. (v) הסרת השרירים ברגליים התחתונות. (vi) נקע של מפרק הברך. (ב) שמאל; רגליים נכרתו במדיום התרבות. ימין; נקע tarsus ו metatarsus במדיום תרבית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65196/65196fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
4. בידוד של פיברובלסטים סינוביאליים ( איור 2A)
<ol><li>זרעו את כל מתלי התאים המתקבלים משני הקרסוליים על צלחת מצופה קולגן. הערה: אם משתמשים בקרסוליים עם נפיחות חלשה או בינונית כדי להשיג את התאים, מוחלים צלחת בקוטר 40 מ"מ. ניתן לשנות את גודל הכלי המצופה בקולגן לצלחת בקוטר 60 מ"מ אם לשני הקרסוליים יש נפיחות חמורה.</li>
	<li>מוסיפים מדיום תרבית (כ-222 מיקרוליטר/ס"מ2). יש לדגור במשך שעה אחת ב-37°C (75 °F) באווירה לחה עם 5% CO2.</li>
	<li>אסוף תאים שאינם דבקים באמצעות פיפט (השתמש בשלב 5.1). שוטפים את הכלי המצופה בקולגן במדיום תרבית ואוספים את המדיום. תרבית את התאים הדבקים בתווך טרי (איור 2B,i). רוב התאים שנצמדים במהירות לצלחת מצופה הקולגן מציגים מורפולוגיה פיברובלסטואידית (בצורת ציר).</li>
	<li>מעבר תאים תת-משתלבים על ידי טיפול ב-0.05% טריפסין בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS). בשיטה זו, הזיהום של תאים אחרים מוגבל, גם אם בהרחבה הראשונית. אם נדרשים תאים מטוהרים יותר דמויי פיברובלסט, בצע מעברים חוזרים ונשנים כדי לאפשר שיפור של טוהר; אולם נצפתה גם התרחבות הציטופלסמה של התאים בהידבקות (איור 2B,ii). מכיוון שמעברים מוגזמים משפיעים על אובדן תכונות נאיביות בתאים, השתמשו בתאים עם פחות מ-5 מעברים.</li>
</ol>5. בידוד מקרופאגים סינוביאליים ( איור 2A)
<ol><li>זרעו את כל התאים שאינם נדבקים משלב 4.4 על צלחות (קוטר של 40 או 60 מ"מ) שלא צופו בקולגן. הערה: תאים שאינם דבקים כוללים מקרופאגים, לימפוציטים אחרים ושאריות פיברובלסטים מרקמת סינוביטיס.</li>
	<li>תרבית את התאים בתפזורת במשך יום אחד ב 37 ° C באווירה לחה עם 5% CO2.</li>
	<li>כדי להסיר לימפוציטים שאינם דבקים, לשאוף את המדיום בתרבית, ולאחר מכן להוסיף מדיום תרבית טרי. חזרו על התהליך הזה פעמיים או שלוש (איור 2B,iii).</li>
	<li>תרבית את התאים הדבקים בתפזורת במשך שבוע-שבועיים בתווך התרבית, עם שינויים בינוניים כל יומיים תוך שמירה על מפגש (איור 2B,iv). הערה: מספר הודעות SM גדל לאט בתנאי תרבות משותפת עם SFs. לפיכך, יש להתאים את תקופת התרבות המשותפת לפי הצורך.</li>
	<li>יש לשטוף עם PBS או HBSS פעמיים. יש לטפל עם 0.05% טריפסין ב-HBSS (כ-55 מיקרוליטר/ס"מ 2) למשך 3 דקות ב-37°C באווירה לחה עם 5% CO2. פיברובלסטים מתנתקים בקלות מצלחת התרבית על ידי טיפול בטריפסין, ומקרופאגים מפגינים עמידות לטיפול בטריפסין. השתמש במאפיין זה לבחירת מקרופאגים סינוביאליים.</li>
	<li>יש להוסיף מדיום תרבית (כ-222 מיקרוליטר/ס"מ2) בעדינות ל-0.05% טריפסין ב-HBSS. לאחר שלב זה, אין לשפוך את המדיום ישירות על התאים.</li>
	<li>כדי להסיר תאים מנותקים, שאפו את המדיום התרבית, ולאחר מכן הוסיפו מדיום תרבית טרי בעדינות. חזור על תהליך זה פעמיים או שלוש. שמרו את התאים הנותרים על הצלחת בתרבית טרייה עד לשימוש (איור 2B,v). הערה: לאחר טיפול בטריפסין, תאים דבקים מפגינים מאפיינים מורפולוגיים דמויי מקרופאגים.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65196/65196fig02.jpg"> איור 2: הפרדה של שברים עשירים במקרופאגים ועשירים בפיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים דלקתית. (A) סכימה של ההליך להפרדת תאים עשירים במקרופאגים ועשירים בפיברובלסטים מרקמת דלקת פרקים. (B) תמונות ניגודיות פאזה מייצגות של שלבי ההליך, (i) עד (v) באיור 2A. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65196/65196fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

חשיפת דלקת מפרקים דלקתית: חקירת תפקודים של תאים סינוביאליים

<ol><li>Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).</li>
<li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).</li>
<li>Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+tissue+macrophages%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22RMD+Open%22%5BJournal%5D)">Synovial tissue macrophages: friend or foe.</a> RMD Open. 3 (2), (2017).</li>
<li>Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+macrophages%3A+from+ordinary+eaters+to+extraordinary+multitaskers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers.</a> Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).</li>
<li>Alivernini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+synovial+tissue+macrophage+subsets+regulate+inflammation+and+remission+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis.</a> Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).</li>
<li>Saeki, N., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+synovial+macrophage+metabolism+by+synovial+fibroblasts+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188(2020).</li>
<li>Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+protocol+for+the+isolation+and+culture+of+normal+and+arthritogenic+murine+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts.</a> Protocol Exchange. , (2009).</li>
<li>Saeki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulator+UHRF1+orchestrates+proinflammatory+gene+expression+in+rheumatoid+arthritis+in+a+suppressive+manner%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner.</a> The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).</li>
<li>Midwood, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin-C+is+an+endogenous+activator+of+Toll-like+receptor+4+that+is+essential+for+maintaining+inflammation+in+arthritic+joint+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease.</a> Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).</li>
<li>You, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolically+engineered+stem+cell-derived+exosomes+to+regulate+macrophage+heterogeneity+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis.</a> Science Advances. 7 (23), 0083(2021).</li>
<li>Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+propagation+method+for+resident+macrophages+by+co-culture+and+subculture%2C+and+their+isolation+from+various+organs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs.</a> BMC Immunology. 20 (1), 34(2019).</li>
<li>Andrä, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+T-cell+functionality+after+flow+cytometry+sorting+revealed+p38+MAPK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation.</a> Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).</li>
<li>Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheath+fluid+impacts+the+depletion+of+cellular+metabolites+in+cells+afflicted+by+sorting+induced+cellular+stress+%28SICS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS).</a> Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).</li>
<li>Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+in+rheumatoid+arthritis%3A+dangerous+liaisons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons.</a> Frontiers in Medicine. 7, 601618(2020).</li>
<li>Croft, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fibroblast+subsets+drive+inflammation+and+damage+in+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis.</a> Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).</li>
<li>Wei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+drives+synovial+fibroblast+identity+and+arthritis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology.</a> Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

שיטה זו שפותחה כאן משפרת טכניקות קודמות לבידוד הן SFs מדלקת מפרקים מורין והן מקרופאגים תושבים ממספר איברים 7,11. השיטה המתוקנת יכולה לבודד הן מקרופאגים והן פיברובלסטים מסינוביום דלקתי עם טוהר גבוה, והיא פשוטה וניתנת לשחזור. מכיוון שהשיטה אינה דורשת מכשירים מורכבים כגון ממיין תאים, כל אחד יכול לבצע אותה. בנוסף, הטכניקה הנוכחית מונעת חששות הקשורים לשיטות אחרות, כגון מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) ומיון תאים המופעלים מגנטית (MACS) אשר עלולים לגרום נז...

דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה אוטואימונית המאופיינת בהיפרפלזיה של הסינוביום, המובילה להרס מפרקים 1,2. מקרופאגים ופיברובלסטים שומרי רקמות נמצאים בסינוביום בריא כדי לשמור על הומאוסטזיס משותף. בחולי RA, פיברובלסטים סינוביאליים (SFs) מתרבים, ותאים חיסוניים, כולל מונוציטים, מסתננים לתוך סינוביום ונוזל המפרקים, תהליכים הקשורים לדלקת 1,3,4. מקרופאגים סינוביאליים (SMs), הכוללים מקרופאגים תושבים ומקרופאגים היקפיים שמקורם במונוציטים בדם, ו-SFs מופעלים באופן חריג ויש להם תפקידים חשובים בפתוגנזה של RA. מחקרים אחרונים הראו כי אינטראקציות תא-תא בין SMs ו- SFs תורמות הן להחמרה והן להפוגה של RA 5,6.
כדי להבין את הפתוגנזה של RA, נעשה שימוש במספר מודלים של מכרסמים של דלקת מפרקים דלקתית, כולל דלקת מפרקים בנסיוב K/BxN, דלקת מפרקים הנגרמת על ידי קולגן ודלקת מפרקים הנגרמת על ידי נוגדני קולגן. בדיקות מבוססות תאים נדרשות בדרך כלל כדי להבהיר פונקציות מולקולריות בדלקת פרקים. לכן, תאים ראשוניים ממודלים של בעלי חיים של דלקת פרקים בודדו. השיטה לבידוד SFs מרקמת דלקת מפרקים מורין מבוססת היטב, ותאים אלה תרמו להבהרת מנגנונים מולקולריים בפתוגנזה של דלקת פרקים 7,8. מצד שני, מקרופאגים שמקורם במח עצם, מקרופאגים שמקורם במונוציטים בדם וקווי תאי מקרופאגים שימשו לעתים קרובות כמשאבי מקרופאגים למחקרי דלקת פרקים 9,10. מאחר שמקרופאגים יכולים לרכוש תפקודים הקשורים למיקרו-סביבה שלהם, מקורות כלליים של מקרופאגים עשויים להיות חסרים תגובות ספציפיות לרקמת דלקת פרקים. בנוסף, קשה להשיג מספיק תאים סינוביאליים על ידי מיון, כמו סינוביום murine היא רקמה קטנה מאוד אפילו מודלים דלקת פרקים. חוסר השימוש במקרופאגים סינוביאליים למחקרי מבחנה היווה מגבלה במחקרי דלקת פרקים. הקמת פרוטוקול לבידוד והרחבה של מקרופאגים סינוביאליים תהווה יתרון להבהרת מנגנונים פתולוגיים ב- RA.
בשיטה הקודמת לבידוד SFs, SMs הושלכו7. מלבד זאת, דווח על שיטה לבודד ולהרחיב מקרופאגים מקומיים מאיברים מסוימים11. לכן, פרוטוקולים קיימים שונו בשילוב. השינוי נועד להשיג את התרבות העיקרית של SMs ו- SFs עם טוהר גבוה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד ולהרחיב הן SMs והן SFs מרקמת דלקת מפרקים מורין.

<table><tbody><tr><td>5.0 גרם/ליטר טריפסין/5.3 מילימול/ליטר תמיסת EDTA</td><td>טק</td><td>35556-44</td><td>מדולל</td></tr><tr><td>באנטיביוטיקה HBSS&ndash; אנטי-פטרייתי (אנטי/נגד)</td> <td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>מחט פרפר</td><td>TERUMO</td><td>SV-23DLK</td><td>23G</td></tr><tr><td>מסננת תאים</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>40 ומיקרו; m נקבוביות, ניילון</td></tr><tr><td>Cellmatrix סוג I-C</td><td>ניטה ג'לטין</td><td>637-00773</td><td>סוג I-C קולגן</td></tr><tr><td>צינור צנטריגוג 15</td><td>TPP</td><td>91014</td><td>צינור 15 מ"ל</td></tr><tr><td>צינור צנטריגוג 50</td><td>TPP</td><td>91050</td><td>50 מ"ל</td></tr><tr><td>צינור קולגנאז מ- C. Histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td>סוג IV קולגנאז</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>SIGAM</td><td>173012</td><td>השבתת חום בוצעה</td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)</td><td>Wako</td><td>085-09355</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>מרכז מחקר ביולוגי</td><td>PRI28-1525A</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 40</td><td>TPP</td><td>93040</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 60</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>KFI</td><td>1-9749-31</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td> עדינה <td>מרכז מחקר ביולוגי</td><td>PRI28-1522</td><td>קצה משונן</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 305</td><td>ZEISS</td><td>STEMI305-EDU</td><td>סטריאומיקרוסקופ</td></tr></tbody></table>

בידוד ותרבית של מקרופאגים סינוביאליים ראשוניים ופיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים מורין

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

דלקת מפרקים שגרונית היא מחלה אוטואימונית המובילה לדלקת כרונית של המפרקים. מקרופאגים סינוביאליים ופיברובלסטים סינוביאליים ממלאים תפקידים מרכזיים בפתוגנזה של דלקת מפרקים שגרונית. חשוב להבין את תפקידיהן של שתי אוכלוסיות התאים כדי לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס התקדמות פתולוגית והפוגה בדלקת מפרקים דלקתית. באופן כללי, תנאי ניסוי חוץ גופיים צריכים לחקות את הסביבה in vivo ככל האפשר. תאים ראשוניים שמקורם ברקמה שימשו בניסויים המאפיינים פיברובלסטים סינוביאליים בדלקת פרקים. לעומת זאת, בניסויים שחקרו את התפקודים הביולוגיים של מקרופאגים בדלקת מפרקים דלקתית, נעשה שימוש בקווי תאים, מקרופאגים שמקורם במח עצם ומקרופאגים שמקורם במונוציטים בדם. עם זאת, לא ברור אם מקרופאגים כאלה אכן משקפים את תפקודם של מקרופאגים שוכני רקמות. כדי להשיג מקרופאגים מקומיים, פרוטוקולים קודמים שונו כדי לבודד ולהרחיב הן מקרופאגים ראשוניים והן פיברובלסטים מרקמה סינוביאלית במודל עכבר של דלקת מפרקים דלקתית. תאים סינוביאליים ראשוניים אלה עשויים להיות שימושיים לניתוח חוץ גופי של דלקת מפרקים דלקתית.

נקבות עכברי C57BL/6 בגיל 7-8 שבועות עברו דלקת מפרקים הנגרמת על ידי נוגדני קולגן. תאים דמויי מקרופאגים ותאים דמויי פיברובלסטים בודדו באופן עצמאי מרקמת דלקת מפרקים דלקתית בהתאם להליך שתואר לעיל (איור 2A,B). תאים דמויי מקרופאגים שימשו מיד לאחר שלב 5.7. תאים דמויי פיברובלסטים גודלו בתחילה בתרבית לאחר שלב 4.4, ולאחר מכן עברו לצלחת תרבית חדשה ולאחר מכן נעשה בהם שימוש. כדי להעריך אם SMs ו- SFs בודדו בהצלחה, בוצעו הניסויים הבאים.
כדי להעריך את טוהר התאים ...

המחקר הנוכחי מספק פרוטוקול שונה לבידוד מקרופאגים סינוביאליים ופיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים דלקתית מורין.

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...

בדיקות מבוססות תאים נדרשות כדי להבהיר פונקציות מולקולריות. במחקרי דלקת פרקים, השיטה לבידוד תאים ראשוניים מבוססת היטב בפיברובלסטים סינוביאליים, אך לא במקרופאגים סינוביאליים. לכן, פיתחנו פרוטוקול לבידוד והרחבה של מקרופאגים סינוביאליים ופיברובלסטים סינוביאליים ממודלים של דלקת פרקים.פיברובלסטים סינוביאליים ראשוניים מרקמת דלקת מפרקים מורין תרמו להבהרת מנגנונים מולקולריים בפתוגנזה של דלקת פרקים. מצד שני, מקרופאגים שמקורם במח עצם, מקרופאגים שמקורם במונוציטים בדם ושורות תאי מקרופאגים שימשו לעתים קרובות כמשאבי מקרופאגים למחקרי דלקת פרקים. מאחר שמקרופאגים יכולים לרכוש תפקודים הקשורים למיקרו-סביבה שלהם, מקורות כלליים של מקרופאגים עשויים להיות חסרים תגובות ספציפיות לרקמת דלקת פרקים.בנוסף, קשה להשיג מספיק תאים סינוביאליים על ידי מיון, כמו סינוביום murine היא רקמה קטנה מאוד אפילו מודלים דלקת פרקים. בשיטה הקודמת לבידוד פיברובלסטים סינוביאליים הושלכו מקרופאגים סינוביאליים. מלבד זאת, דווח על שיטה לבודד ולהרחיב מקרופאגים מקומיים מאיברים מסוימים.לכן, הפרוטוקולים הקיימים שונו בשילוב כדי לבודד ולהרחיב הן מקרופאגים סינוביאליים והן פיברובלסטים סינוביאליים מרקמת דלקת מפרקים מורין. שיטה זו יכולה לבודד הן מקרופאגים והן פיברובלסטים מסינוביום דלקתי עם טוהר גבוה, והיא פשוטה וניתנת לשחזור. שיטה זו מאפשרת הרחבה של מקרופאגים סינוביאליים תחת תרבית משותפת עם פיברובלסטים סינוביאליים.כמו כן, השיטה מספקת יתרון, בכך שניתן להשתמש בפיברובלסטים סינוביאליים עם פחות מעברים. הפרוטוקול שנקבע יהווה יתרון להבהרת מנגנונים פתולוגיים בדלקת מפרקים שגרונית.

isolation-culture-primary-synovial-macrophages-fibroblasts-from

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מציג טיפול מבוסס תאים לדלקת מפרקים אוטואימונית בעכברים. תאי בקרת T שמקורם ב-iPSC המבטאים קולטנים ספציפיים לאובאלבומין מוזרקים עם אלבומין בסרום בקר שעבר מתילציה (mBSA) ומתחלב באדג'ובנט. תאים מציגי אנטיגן מורין (APCs) מעבדים ומציגים את mBSA לתאי T, מה שגורם להפעלת תאי T ונדידה לקרום הסינוביאלי של מפרק הברך. זריקות עוקבות כוללות mBSA לבד בברך שמאל ושילוב של mBSA ואובלבומין בברך ימין. בברך שמאל, התגובה החיסונית ל- mBSA מעוררת דלקת פרקים, ואילו בברך ימין, תאי T מווסתים אינטראקציה עם...

טיפול מבוסס תאים לדלקת מפרקים אוטואימונית במודל מורין

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים נגרם אדם מן synoviocytes חולה נגזרת כמו-פיברובלסטים, באמצעות מערכת lentiviral ללא תאים מזינים.

הדור של גזע תאים מושרה-פלוריפוטנטיים שימוש פיברובלסטים דמויי Synoviocytes מבודדת מן מפרידים של בחולי דלקת מפרקים שגרונית

מוצג פרוטוקול המבסס תאי גזע מזנכימליים (MSCs) המבודדים מהנוזל הסינוביאלי וממח העצם של מיני-חזירים ונאספים באופן לא פולשני באמצעות שאיבת מזרק. פנוטיפ תאי בוצע באמצעות זרימה ציטומטרית לאחר בידוד תאים וגידול במבחנה של מח עצם ונוזלים סינוביאלים שמקורם ב-MSCs.

בידוד נייד phenotyping של בתאי גזע mesenchymal נגזר הסינוביאלי נוזל מח עצם של Minipigs

מאמר זה מציג פרוטוקול כלכלי ופשוט עבור בידוד ישיר וטיהור של גזע mesenchymal של ניו זילנד הארנב הלבן synovial נוזל.

מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות כדי לבודד ולטהר Synovial נגזר הנוזלים בתאי גזע Mesenchymal ממודל ארנב

שיטה מתישה קריוגניים כדי לעבד כפות מורתיות באמצעות טחנת חנקן נוזלי המקפיא פותחה כדי לשפר את התשואה והאיכות של RNA או חלבון שחולצו מן הרקמות ולאפשר ניתוח של פרופילים מולקולריים הקשורים דלקתיות תגובות.

פרוטוקול הקפאה-מתישה לעיבוד כפות העכבר כדי להעריך מסלולים מולקולריים של דלקת רקמות במודל דלקת מפרקים קולגן המושרה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ציטומיטרי זרימה מפורט ושחזור כדי לזהות מונוציט / מקרופאג ותת-תאים T-ערכות באמצעות שניהם אקסטרה-ותוך תאי כתמים כתמים בתוך הטחול murine, מח עצם, בלוטות הלימפה ורקמות synovial, ניצול מודל כירורגי מבוסס של דלקת מפרקים ניוונית מורין.

ניתוח ציתום זרימה של תת-סטים של תאים חיסוניים בתוך הטחול מורין, מח העצם, בלוטות הלימפה ורקמות Synovial במודל דלקת מפרקים ניוונית

פיתחנו מערכת טרנסוול אנושית מחוץ לחיים המסוגלת להעריך שינויים דלקתיים, זיהומיים ומבניים חריפים בסינוביום.

מודל קדם-קליני של סינוביטיס המשתמש ברקמה סינוביאלית אנושית מחוץ לחיים עם תפקוד וארכיטקטורה נשמרים

הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

Hepatocytes ראשיים מספקים כלי רב ערך כדי להעריך ביוכימיים, פונקציות מולקולרית, ואת חילוף החומרים במערכת ניסיונית רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אנו מתארים פרוטוקול אמין עכברוש זלוף הכבד באתרו, אשר באופן עקבי יוצר hepatocytes קיימא עד to1.0 ×...

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

בפרסום זה, אנו מתארים הליך מהיר ונוח לבידוד ותאי לבלב acinar העיקריים culturing מהלבלב העכברי. שיטה זו מהווה גישה רבת ערך כדי ללמוד את הפיסיולוגיה של תאי לבלב אקסוקרינית רגילים / untransformed העיקריים טריים.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

למד פרוטוקול לבידוד מקרופאגים ופיברובלסטים סינוביאליים ראשוניים מרקמת דלקת מפרקים מורין. השיטה מאפשרת ניתוח מנגנונים פתולוגיים בדלקת פרקים שיגרונית עם טוהר גבוה של תאים מבודדים.

בידוד ותרבית של מקרופאגים סינוביאליים ראשוניים ופיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים מורין

גלה סרטונים נוספים