Name: פרוטוקול יעיל לניתוח CUT and RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: למדו פרוטוקול CUT&RUN לניתוח תאי לוויין שריר עכבר מבודדים ב-FACS. שיטה זו מאפשרת חקר רקruitment של גורמי שעתוק ונוף כרומטין בתאי טנוע שריר, ותורמת להבנת תפקוד קולטני סטרואידים בשריר השלד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאנסטסיה באנווארת על מתן סיוע טכני מעולה. אנו מודים למתקן בית החיות IGBMC, לתרבית התא, למכון הקליני לעכברים (ICS, אילקירך, צרפת), להדמיה, למיקרוסקופ האלקטרונים, לציטומטריית הזרימה ולפלטפורמת GenomEast, חברה בקונסורציום 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009).
עבודה זו של המכון התמטי הבינתחומי IMCBio, כחלק מתוכנית ITI 2021-2028 של אוניברסיטת שטרסבורג, CNRS ו- Inserm, נתמכה על ידי IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) ועל ידי פרויקט SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) ו- EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) במסגרת תוכנית ההשקעות הצרפתית לעתיד. מימון נוסף הועבר על ידי INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), התוכנית האסטרטגית AFM-Téléthon 24376 (ל- D.D.), INSERM מענק חוקר צעיר (ל- D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, וקרן ממשלתית צרפתית המנוהלת על ידי ANR במסגרת תוכנית Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. נתמך על ידי התוכנית CDFA-07-22 של אוניברסיטת פרנקו-אלמנדה ו Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, ו K.G. על ידי האגודה pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

בידוד תאי לוויין משרירי גפיים של עכבר וניתוח ציטומטריית זרימה

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+a+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: a brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+progenitor+cells+and+the+role+of+Pax+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes.</a> Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).</li>
<li>Tosic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lsd1+regulates+skeletal+muscle+regeneration+and+directs+the+fate+of+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 366(2018).</li>
<li>Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+regulation+of+muscle+satellite+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).</li>
<li>Collins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Robinson, D. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+elongation+factor+regulates+muscle+progenitor+expansion+for+efficient+myofiber+repair+and+stem+cell+pool+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation.</a> Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li>
<li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85(2019).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Gunther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myf5-positive+satellite+cells+contribute+to+Pax7-dependent+long-term+maintenance+of+adult+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).</li>
<li>Donlin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+high-dimensional+analysis+of+cells+dissociated+from+cryopreserved+synovial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue.</a> Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139(2018).</li>
<li>Rico, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+cell+doublet+profiles%3A+Comparison+of+light+scattering+with+fluorescence+measurement+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques.</a> Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).</li>
<li>Schreiber, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+NEUROG3+occupancy+in+the+human+pancreatic+endocrine+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network.</a> Molecular Metabolism. 53, 101313(2021).</li>
<li>Rovito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myod1+and+GR+coordinate+myofiber-specific+transcriptional+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+calling+by+Sparse+Enrichment+Analysis+for+CUT%26RUN+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling.</a> Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42(2019).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).</li>
<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Atlas+2021+update%3A+a+data-mining+suite+for+exploring+epigenomic+landscapes+by+fully+integrating+ChIP-seq%2C+ATAC-seq+and+Bisulfite-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data.</a> Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Brandhorst, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+human+islet+isolation+utilizing+recombinant+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase.</a> Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).</li>
<li>Nikolic, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+collagenase+XI+and+liberase+H1+for+the+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatogastroenterology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets.</a> Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li>
<li>Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2C12+myoblastoma+cell+differentiation+and+proliferation+is+stimulated+by+androgens+and+associated+with+a+modulation+of+myostatin+and+Pax7+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).</li>
<li>Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+modulation+of+the+nuclear+receptor+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).</li>
<li>Billas, I., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+controls+of+nuclear+receptor+function+in+the+regulation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).</li>
<li>Garcia-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li>
<li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 6, 35(2016).</li>
<li>Schultz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+the+satellite+cell+population+in+postnatal+mouse+lumbrical+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle.</a> The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).</li>
<li>Hyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+pancreatic+digestion+with+liberase+versus+collagenase+on+the+yield%2C+function+and+viability+of+neonatal+rat+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets.</a> Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+skeletal+muscle+for+flow+cytometric+characterization+of+immune+cells+in+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).</li>
<li>Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+tissue+residency+of+lymphocytes+in+the+murine+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 8, 250(2017).</li>
<li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

המחקר הנוכחי מדווח על שיטה סטנדרטית, אמינה וקלה לביצוע לבידוד ותרבית של תאי לוויין עכברים, כמו גם על הערכת ויסות שעתוק בשיטת CUT&RUN.
פרוטוקול זה כולל מספר שלבים קריטיים. הראשון הוא הפרעה בשרירים ועיכול סיבים כדי להבטיח מספר גבוה של תאים שנאספו. למרות ריכוז האנזימים המוגבר, התקבלו יותר תאים חיים מאשר באמצעות פרוטוקול 1. תאי לוויין מבטאים תבנית מסוימת של חלבוני ממברנה שונים. כדי להגביר את חומרת המיון שלנו, השתמשנו בשילוב של סמני תאי לוויין שליליים (CD31, TER119, CD45 ו-CD11b) וחיוביים (CD34, IT...

שרירי השלד המפוספסים מייצגים בממוצע 40% ממשקל גוף האדם הכולל1. סיבי שריר מפגינים יכולת יוצאת דופן להתחדשות בעת פציעה, המתוארת על ידי איחוי של מיוציטים חדשים שנוצרו ויצירת מיוסיבים חדשים המחליפים את הפגועים2. בשנת 1961 דיווח אלכסנדר מאורו על אוכלוסייה של תאים חד-גרעיניים שאותם כינה תאי לוויין3. תאי גזע אלה מבטאים את פקטור השעתוק בתיבה 7 (PAX7), וממוקמים בין הלמינה הבסיסית לבין הסרקולמה של סיבי שריר4. הם דווחו כמבטאים את אשכול ההתמיינות 34 (CD34; אב המטופוייטי, אנדותל וסמן תאי גזע מזנכימליים), אינטגרין אלפא 7 (ITGA7; סמן שרירי לב ושלד חלקים), כמו גם קולטן כימוקין C-X-C מסוג 4 (CXCR4; סמן לימפוציטים, המטופויטים ותאי לוויין)5. בתנאי בסיס, תאי לוויין שוכנים במיקרו-סביבה מסוימת השומרת אותם במצב שקט6. עם פגיעה בשרירים, הם הופכים מופעלים, מתרבים ועוברים מיוגנזה7. עם זאת, הם תורמים רק לחלק קטן מכלל תאי השריר, והניתוחים הכלל-גנומיים שלהם מאתגרים במיוחד, במיוחד בתנאים פיזיולוגיים (<1% מכלל התאים).
תוארו שיטות שונות לבידוד כרומטין מתאי לוויין, הכוללות משקעים חיסוניים של כרומטין ואחריו ריצוף מקבילי מסיבי (ChIP-seq) או מחשוף תחת ניסויי מטרות ותיוג (CUT&Tag). עם זאת, שתי טכניקות אלה מציגות כמה מגבלות משמעותיות שנותרו ללא עוררין. ואכן, ChIP-seq דורש כמות גבוהה של חומר מוצא כדי לייצר מספיק כרומטין, שחלק גדול ממנו הולך לאיבוד במהלך שלב הסוניקציה. CUT&Tag מתאים יותר למספר תאים נמוך, אך מייצר יותר אתרי מחשוף מחוץ למטרה מאשר ChIP-seq בשל פעילות טרנספוזאז Tn5. בנוסף, מאחר שלאנזים זה יש זיקה גבוהה לאזורים עם כרומטין פתוח, גישת CUT&Tag עשויה לשמש לניתוח שינויים בהיסטון או גורמי שעתוק הקשורים לאזורים משועתקים באופן פעיל של הגנום, במקום הטרוכרומטיןמושתק 8,9.
מוצג כאן פרוטוקול מפורט המאפשר בידוד של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים על ידי FACS עבור מחשוף מתחת למטרות ושחרור באמצעות ניתוח נוקלאז (CUT&RUN)10,11. השלבים השונים כרוכים בשיבוש מכני של רקמות, מיון תאים ובידוד גרעינים. יעילות השיטה, בכל הנוגע להכנת תרחיף תאים בר קיימא, הודגמה על ידי ביצוע ניתוח CUT&RUN עבור שינויים קוולנטיים בהיסטון וגורמי שעתוק. איכותם של התאים המבודדים הופכת את השיטה המתוארת לאטרקטיבית במיוחד להכנת כרומטין הלוכד נאמנה את מצב התפוסה הגנומי הטבעי, ועשוי להתאים ללכידת קונפורמציית הכרומוזומים בשילוב עם ריצוף בתפוקה גבוהה במוקדים ספציפיים (4C-seq) או ברמות רחבות גנום (Hi-C).

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל מיקרו-שפופרת</td><td>אפנדורף</td><td>2080422</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל מיקרו-שפופרת</td><td>סטאר לאב</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינורות</td><td>קורנינג-פלקון</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל</td><td>פלקון</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-AR</td><td></td><td>ab108341</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD11b</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>eBioscience</td><td>48-0341-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td></td></tr><tr><td>anti-CXCR4</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-DMD</td><td></td><td>abcam ab15277</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K27ac</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K4me2</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>anti-ITGA7</td><td>MBL</td><td>k0046-4</td><td></td></tr><tr><td>anti-PAX7</td><td>DSHB</td><td>AB_528428</td><td></td></tr><tr><td>anti-TER119</td><td>BD Pharmingen TM</td><td>553673</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים</td><td>Polysciences</td><td>86057-3</td><td>BioMag&reg; בתוספת Concanavalin</td></tr><tr><td>מסננת תאים 100 ומיקרו; מ</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td>431752</tr><tr><td>מסננת תאים 40 ומיקרו; מ</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים 70 ומיקרו; מ</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td>431751</tr><tr><td>צנטריפוגה 1</td><td>אפנדורף</td><td>521-0011</td><td>צנטריפוגה 5415 R</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 2</td><td>צנטריפוגה 5805000010 אפנדורף</td><td></td><td>5804 R</td></tr><tr><td>מערכת שקופיות קאמרית&nbsp;</td><td>ThermoFischer</td><td>171080</td><td>Syst&egrave; me Nunc&trade; מעבדה-טק וסחר; חומר ניקוי שקופיות קאמרי</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא&nbsp; &nbsp;</td><td>SLBQ7780V</td><td>RNaseZAPTM</td></tr><tr><td>קולגנאז, סוג I&nbsp;</td><td>תרמו פישר</td><td>17100017</td><td>10 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>7913</td><td>5 U/mL</td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-2 Aimant</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>כתם כדאיות קבוע</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>BD FACSAria&trade; Fusion Flow Cytometer</td><td>23-14816-01</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G עם DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>דפדפן גנום&nbsp;</td><td>IGV</td><td></td><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td></tr> <tr><td>גליצרול&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>הידרוג'ל</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td>354277</td><td>Matrigel תוכנת עיבוד תמונה מטריצה מוסמכת hESC</td></tr><tr><td></td><td>Image J&reg;</td><td></td><td>V 1.8.0</td></tr><tr><td>סרט מעבדה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>PARAFILM&reg; M</td></tr><tr><td>Liberase LT</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>פרופיל גלאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Sequencer&nbsp;</td><td>Illumina Hiseq 4000</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים רועדים</td><td>ביובלוק פוליטסט מדעי 20</td><td>18724</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול יעיל לניתוח cut&amp;run של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-fac

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

ניתוחים גנומיים עם אוכלוסיות תאים קטנות הם אילוץ מרכזי למחקרים, במיוחד בתחום תאי הגזע. עבודה זו מתארת פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין משריר הגפיים, רקמה עם תכולה גבוהה של חלבונים מבניים. שרירי גפיים מנותחים מעכברים בוגרים שובשו מכנית על ידי טחינה במדיום בתוספת דיספאס וקולגנאז מסוג I. עם העיכול, ההומוגנט סונן דרך מסננות תאים, והתאים הושעו במאגר FACS. הכדאיות נקבעה עם כתם כדאיות הניתן לתיקון, ותאי לוויין מוכתמים חיסונית בודדו על ידי FACS. התאים עברו ליזה עם Triton X-100 וגרעינים ששוחררו נקשרו לחרוזים מגנטיים מסוג concanavalin A. קומפלקסים של גרעין/חרוזים הודגרו עם נוגדנים כנגד גורם השעתוק או שינויי ההיסטון המעניינים. לאחר השטיפה, קומפלקסים של גרעין/חרוזים הודגרו עם חלבון A-micrococcal nuclease, ומחשוף הכרומטין החל עם CaCl2. לאחר מיצוי הדנ"א נוצרו ורוצפו ספריות, והפרופילים לקשירת פקטורי שעתוק ברחבי הגנום ושינויים קוולנטיים בהיסטון התקבלו על ידי אנליזה ביואינפורמטית. הפסגות שהתקבלו עבור סימני ההיסטון השונים הראו כי אירועי הקישור היו ספציפיים לתאי לוויין. יתר על כן, ניתוח מוטיב ידוע גילה כי גורם השעתוק קשור לכרומטין באמצעות אלמנט התגובה הקוגנטית שלו. פרוטוקול זה מותאם אפוא לחקר בקרת גנים בתאי לוויין של שרירי גפיים של עכברים בוגרים.

תאי לוויין משרירי השלד של עכבר בודדו על ידי שילוב הפרוטוקולים של Gunther et al. (להלן פרוטוקול 1)12 ושל Liu et al.23 (להלן פרוטוקול 2). מאחר שנצפו סיבי שריר לא מעוכלים לאחר העיכול בעת שימוש בריכוז של collagenase ו-dispase שהוצע בפרוטוקול 1, כמות האנזימים הוגדלה כדי לשפר את הדיסוציאציה של סיבי השריר, כפי שמתואר בשלבים 1.2.1 ו-1.2.3. כפי שצוין בפרוטוקול 2, הדגימות היו נתונות לתסיסה עדינה באמבט מים כדי לשמור על כדאיות התא. ביצענו סינון באמצעות מסננות תאים, כפי שהוזכר בפרוטוקול...

מוצג כאן פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים המותאם לחקר ויסות שעתוק בסיבי שריר על ידי שסע מתחת למטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&RUN).

פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&amp;RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

מאז יותר מ -20 שנה, המעבדה שלנו מתעניינת בתפקיד הפתופיזיולוגי של קולטנים גרעיניים. כדי לפענח את פונקציית in vivo שלהם, הנדסנו מודל עכבר המאפשר שליטה מרחבית וזמנית על הביטוי שלהם. במקביל, פיתחנו טכניקות חדשניות לחקר תפקודן המולקולרי ברקמות העכבר.העניין המדעי שלנו הוביל אותנו לאחרונה לקבוע איתות קולטן סקוסטרואידים וסטרואידים ברקמות שונות, כולל שרירי השלד. לאחרונה הוכחנו כי קולטן אנדרוגן במיוסיבים הממיינים תאים של שריר השלד הוא אינסטרומנטלי בתפקודים התכווצים ומטבוליים שלהם. הממצאים האחרונים שלנו מספקים הבנה עמוקה יותר של הדינמיקה הפתופיזיולוגית של שרירי השלד, שהיא חיונית לפיתוח טיפולים יעילים להפרעות הקשורות לשרירים.פיתחנו פרוטוקול זה כדי להיות מסוגל לבצע ניתוח cistrome על תאי גזע שריר in vivo. כל הפרוטוקולים הקודמים ששימשו במודאלי מבחנה, מה שמנתק לחלוטין את החקירה מהקשר אורגניזם שלם. בנוסף להיותו זול וחסכוני בזמן, פרוטוקול זה מספק הגדרה ניסיונית יעילה לחקר גיוס פקטורי שעתוק ונוף הכרומטין בתאי אב של שרירי השלד.כרומטין שהוכן על ידי פרוטוקול זה סיפק את הניתוח הגנומי הראשון של ציסטרומה AR בתאי לוויין, ויקל על מחקרים עתידיים על בקרת גנים. בין רבים, מטרתנו העתידית תהיה להרחיב את החקירות הללו על קולטני אוקסוסטרואידים אחרים ולחקור את הרגולטורים הספציפיים שלהם בסוגי התאים השונים המעורבים בתהליך ההתחדשות בשרירי השלד.

an-efficient-protocol-for-cut-run-analysis-facs-isolated-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

התנהגות פיברובלסטים עומדת בבסיס ספקטרום של ישויות קליניות, אך הן נשארות מאופיינות בצורה גרועה, בעיקר בשל ההטרוגניות הטבועה בהן. מחקר פיברובלסטים מסורתי מסתמך על מניפולציה במבחנה, המסווה התנהגות פיברובלסטים in vivo. אנו מתארים פרוטוקול מבוסס FACS לבידוד פיברובלסטים של עור עכבר שאינו דורש תרבית תאים.

עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS

מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

השיטה המוצגת כאן מסכמת פרוטוקולים ממוטבים להערכת ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים שאינם דבקים ובתאי אב פרימיטיביים (HSPCs) תוך שימוש במנתח השטף החוץ-תאי כדי למדוד את קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) ואת קצב צריכת החמצן (OCR) של HSPCs בזמן אמת.

הערכה של ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים ובתאי אב פרימיטיביים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי

CUT&amp;RUN והוריאנטים שלה יכולים לשמש לקביעת תפוסת החלבון בכרומטין. פרוטוקול זה מתאר כיצד לקבוע לוקליזציה של חלבון על כרומטין באמצעות uliCUT&amp;RUN של תא יחיד.

לוקליזציה של גורם תא יחיד בכרומטין באמצעות מחשוף קלט אולטרה-נמוך תחת יעדים ושחרור באמצעות נוקלאז

הזיהוי המדויק של תאי אב פיברו-אדיפוגניים (FAPs) ותאי גזע של שרירים (MuSCs) הוא קריטי לחקר תפקודם הביולוגי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מספק הנחיות לבידוד, לטיהור ולתרבות של FAPs ו-MuSCs משרירי עכברים בוגרים.

בידוד ותרבית FACS של אבות פיברו-אדיפוגניים ותאי גזע של שרירים משרירי שלד עכברים לא מופרעות ופצועים

חוקרים חדשים בתחום האפיגנטי ימצאו את CUT&amp;Tag חלופה קלה משמעותית למבחני ChIP. CUT&amp;Tag הועילה מאוד למחקרים אפיגנטיים על אוכלוסיות תאים נדירות וראשוניות, והפיקה נתונים באיכות גבוהה ממעט מאוד תאים. פרוטוקול זה מתאר ביצוע בדיקות H3K4me1 CUT&amp;Tag על מיובלסטים של עכברים שבודדו משרירי הגפיים האחוריות של העכבר.

שימוש במחשוף תחת מטרות ותיוג (CUT&#38;Tag) בדיקה במחקר מיובלסטים עכבר

פרוטוקול זה מתאר בדיקת הצטרפות קצה חוץ-כרומוזומלית לא הומולוגית (NHEJ) ובדיקת רקומבינציה הומולוגית (HR) כדי לכמת את היעילות של NHEJ ו- HR בתאי HEK-293T.

ניתוח של חיבור קצה לא הומולוגי ויעילות רקומבינציה הומולוגית בתאי HEK-293T באמצעות מערכות דיווח מבוססות GFP

כדי להשיג פריציטים קורטיקליים במוח העכבר העומדים בדרישות scRNA-seq, אנו מציגים פרוטוקול FACS מותאם באופן קריטי המבוסס על בחירת CD13⁺/CD31⁻. השיפורים המרכזיים שלנו משפרים משמעותית את חיוניות התא ואת שלמות ה-RNA, ומאפשרים פרופיל טרנסקריפטומי אמין.

בידוד פריציטים מרקמת קורטיקת העכבר באמצעות FACS לצורך ריצוף תא יחיד

פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לבידוד והעשרת מיובלסטים ראשוניים משרירי השלד של עכברים בוגרים ויילודים באמצעות ניתוק רקמות, סינון רציף, ציפוי מוקדם ותנאי תרבית מוגדרים, המאפשר הקמה ותחזוקה של תרביות מיובלסטים שמקורן בתאי לוויין ליישומים ניסיוניים במורד הזרם.

בידוד תאי לוויין שריר השלד למחקרי מיוגנזה במבחנה

למדו פרוטוקול CUT&RUN לניתוח תאי לוויין שריר עכבר מבודדים ב-FACS. שיטה זו מאפשרת חקר רקruitment של גורמי שעתוק ונוף כרומטין בתאי טנוע שריר, ותורמת להבנת תפקוד קולטני סטרואידים בשריר השלד.

פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

גלה סרטונים נוספים