ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי
28 באפריל 2023
מוצג כאן פרוטוקול להדמיית מוח שלם in vivo של דגי זברה זחלים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת ממדי. הליך הניסוי כולל הכנת דגימה, רכישת תמונה והדמיה.
אנו מפתחים מערכות חיסון אופטיות ואלגוריתמים חישוביים כדי להקליט ולנתח את הנוירואקטיביות של המוח כולו ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה. דגי מעבדה הם חיית מודל אידיאלית למחקר. הודות לכל שקיפות אופטית וזמינותם של כלים גנטיים מגוונים איכות התמונה האופטית עלולה להיפגע עקב הסטייה שהציג ג'ל האגרוז המשמש להרכבת דגימה, והדגים עלולים לנוע במהלך ההקלטה ולגרום לתנועת ארטיפקטים בתמונות או לעכב את מיצוי האות המדויק מהתמונות.
פרוטוקולים הזמינים לציבור מספקים רק סקירה קצרה של ההליך הניסיוני, חיים חלקים ניכרים מהפרטים, כגון התמצקות אגרוז, טכניקות הרכבה מדויקות ומיקום פשוט. לכן, יש צורך בפרוטוקול יעיל וניתן לשחזור כדי לרכוש נתוני תמונה באיכות גבוהה. במינימום רעש ותנועה.
הפרוטוקול שלנו מספק הליך ניסיוני אופטימלי וניתן לשחזור. פרוטוקול זה מאפשר in vivo הדמיה של המוח כולו לאורך תקופה ממושכת והדמיות של נתוני ההדמיה שנרכשו. תהליך העבודה התמקד בדימות מוחי שלם, אך ניתן ליישם אותו בקלות כדי לדמיין איברים אחרים של רבים מדגי הזברה שלנו.
המטרה שלנו היא לפענח את העקרונות הבסיסיים של חישוב עצבי. לשם כך נמשיך לעבוד על צינור הכולל הדמיה בקנה מידה גדול של פעילות עצבית ומבנה וניתוח חישובי של כאלה לצורך מיפוי מוח שיטתי.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לדימות in vivo של המוח השלם בזבובי זבוב-זברה (zebrafish) בשלב הזחלים, תוך שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית תלת-ממדית. מודל דגי זבוב-הזברה מועדף בשל השקיפות האופטית שלו והנגישות הגנטית המאפשרת לחקור חישוב ופעילות עצבית. הפרוטוקול מטפל בבעיות נפוצות כגון ארטיפקטים של תנועה ועיוותים של ג'ל אגרוז, ובכך מבטיח רכישת נתוני דימות באיכות גבוהה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- טכניקות דימות
רקע
- זבקי zebrafish בשלב הזחלים מהווים מודל חיוני למחקרי פעילות עצבית בשל השקיפות שלהם.
- אתגרים משמעותיים כוללים עיוותים הנובעים מגל agarose וארטיפקטים של תנועה במהלך הדימוי.
- בפרוטוקולים הנוכחיים חסרים שלבים מפורטים להרכבה ומיקום יעילים של הדגימה.
- דימוי ברזולוציה גבוהה הוא קריטי להבנת חישוב עצבי.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול הניתן לשחזור עבור דימות באיכות גבוהה של פעילות המוח בדגי zebrafish.
- הפחתת רעשים וארטיפקטים של תנועה במהלך מפגשי הדימות.
- סיוע בחקר חישוב עצבי לאורך תקופות זמן ממושכות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הפלטפורמה העיקרית שבה נעשה שימוש היא מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תלת-ממדית.
- המודל הביולוגי כולל זחלי zebrafish, שהוכנו וקובעו לצורך הדמיה.
- הוטמע זרימת עבודה ניסויית אופטימלית כדי להבטיח מינימום של ארטיפקטים.
- שלבים קריטיים כוללים מיקום מדויק של ה-zebrafish והתאמות נכונות של פרמטרי ההדמיה.
- ויזואליזציה של הנתונים שנרכשו מתבצעת באמצעות כלי תוכנה כגון napari.
תוצאות עיקריות
- פרוטוקול הדימות מאפשר ויזואליזציה מקיפה של אזורי המוח, כולל מבנים נוירונליים במוח הקדמי, במוח האמצעי ובמוח האחורי.
- ניתן ללכוד פעילות נוירונלית באמצעות דימוי סדרות זמן, החושף תובנות משמעותיות לגבי תפקודים עצביים.
- נראות ברורה של כל אזורי המוח מעידה על יעילות הפרוטוקול.
מסקנות
- מחקר זה מציג גישה חדשנית לדימות המשפרת את ההבנה של הפעילות העצבית בדגי zebrafish.
- הפרוטוקול לא רק קובע סטנדרט לדימות של zebrafish, אלא בעל השלכות גם למחקר עצבי רחב יותר.
- פיתוח נוסף של תהליכי (pipelines) דימות צפוי לשפר את מיפוי המוח ואת המחקרים בתחום החישוב העצבי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי פלואורסצנציה תלת-ממדי של מוחות של זבקי זברה בשלב הזחלים מאפשר מיפוי ברזולוציה גבוהה, in vivo, של מבנה ופעילות עצבית, ובכך תומך בגילויים במדעי העצבים בשלבים מוקדמים. פרוטוקול זה מתמקד בשחזוריות ובצמצום ארטיפקטים, ומספק בסיס איתן להפחתת סיכונים מכניסטיים ולתיקוף מטרות במחקר נוירוביולוגי. יכולת ההסתגלות שלו והפלט הכמותי ממצבים אותו ככלי רב-פעמי עבור תהליכי מו"פ תעשייתיים המתמקדים בניתוח מעגלים עצביים ובסריקה פונקציונלית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה שיטתית של מסלולים עצביים ופעילות תאית במודל של חוליתן.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מזעור ארטיפקטים של תנועה וסטיות בדימות.
- מסייע בביטחון חיזוי בזיהוי מטרות עצביות באמצעות נתונים כמותיים של המוח כולו.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין דגימות Zebrafish מקובעות ומאומתות עבור תהליכי דימוי הניתנים לשחזור.
- מנstandardיז פרמטרי דימוי ומיקום דגימות כדי להבטיח עקביות בבדיקה.
- מייצר נתונים נפחיים כמותיים ונתוני סדרות זמן המתאימים לניתוחים המשכיים ולסריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מספק מערכת חולייתים רלוונטית למחלה לצורך מיפוי תפקודי של מעגלים עצביים.
- מאפשר רציפות מהדמיה בשלב הגילוי ועד לפיתוח מודל פרה-קליני עבור תרכובות נוירו-אקטיביות.
- תומך בקידום מבוסס הערכת סיכונים על ידי אספקת תוצרי הדמיה בעלי תוכן גבוה וניתנים לשחזור.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול הדמיה זה משתלב ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשר בדיקת היפותזות, מיפוי מסלולים ואנליזה כמותית במודלים של מדעי העצבים בחולייתנים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך במיפוי מונחה-היפותזה של פעילות ומבנה עצבי ברזולוציה תאית.
- סריקה: מספק פלטי דימוי כמותיים וניתנים לשחזור למחקרי הפרעות גנטיות או תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מערכי נתונים נפחיים וסדרות זמן לצורך ניתוח חישובי והשוואה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: תואם לפיתוח מודלים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות לדימוי תפקודי במערכת של חולייתנים.
- שימוש חוזר ארגוני: הפרוטוקול ניתן להתאמה לדימוי איברים או מערכות אחרות בזבוב zebrafish בשלב הזחלת, ובכך תומך במדרגיות של הפלטפורמה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות עצביות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה בניסויי דימות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון בפורטפוליו של מדעי העצבים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות עצביות ומבחנים תפקודיים בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בדגי zebrafish, קיבוע (immobilization) ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- נדרשת גישה לפלטפורמות של דימיון קונפוקאלי או פלואורסצנטי מותאם אישית וכלי ניתוח חישוביים.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת הדגימות ופרמטרי הדימיון.
- ניתן להתאימו לאיברים אחרים של זחלי zebrafish, אך ייתכן שיידרש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור רקמות שונות.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות ארטיפקטים של דימיון מהאגרוז ותנועה במקרה שהקיבוע אינו מלא.
