Name: שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 39 s
Description: למד שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים באמצעות מיקרופיפטה מיוחדת. טכניקה זו מאפשרת חקר אינטראקציות בין נגיפים לנשאים בביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המו"פ הלאומית של סין (מס '2022YFD1401700) ועל ידי הקרן הלאומית למדע של סין (מס '32090013 ומס '32072385).

1. גידול חרקים
<ol><li>העלו את ה-SBPHs המשמשים בניסוי זה בשתילי אורז (Oryza sativa cv. Nipponbare). שתול 20 שתילי אורז באינקובטור (65 מ"מ x 200 מ"מ), וגדל ב 25 ° C תחת 16 שעות אור / 8 שעות כהה.</li>
</ol>2. נתיחת SBPHs לאוסף המולימפה
<ol><li>הכניסו את SBPHs לתוך צינור צנטריפוגה, והניחו אותם באמבט קרח למשך 10-30 דקות. הערה: אין להניח את ה-SBPHs באמבט הקרח למשך פחות מ-10 דקות, אחרת החרקים עלולים להתעורר.</li>
	<li>הניחו SBPH קפוא על מגלשת זכוכית (ראו טבלת חומרים) מתחת לסטריאומיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים) כשהבטן שלו פונה כלפי מעלה. התאימו את המיקוד לשש רגליו של החרק.</li>
	<li>הכינו שתי פינצטות בדיוק גבוה (ראו טבלת חומרים) עם קצוות עדינים במיוחד. השתמש בפינצטה אחת כדי ללחוץ על גוף החרק כדי לשמור אותו במקומו, והשתמש בפינצטה השנייה כדי למשוך בזהירות את אחת הרגליים מהחרק. הערה: עבור חרקים עם קליפה קשה, אזמל עיניים יכול לשמש לחיתוך אחת הרגליים.</li>
	<li>לחץ בעדינות על החזה של החרק עם פינצטה כדי לגרום להמולימפה לזרום החוצה דרך הפצע. הערה: ההמולימפה מוצגת כטיפות שקופות ללא כל פלוקול לבן נראה לעין. יש להשליך את השומנים אם יש פלוקול לבן, המייצג זיהום גוף שומן.</li>
</ol>3. אוסף המולימפה באמצעות מיקרופיפטות
<ol><li>הכינו מיקרופיפטה. הניחו צינור נימי (ראו טבלת חומרים) בנפח של 1 μL לתוך נורת פיפטה (ראו טבלת חומרים). למדידות מדויקות, ודא שקו קנה המידה גלוי. הערה: יש צורך בחור קטן בחלק העליון של נורת הפיפטה.</li>
	<li>בעת איסוף ההמולימפה, להחזיק את נורת פיפטה של micropipette, ומניחים את צינור נימי קרוב לפצע החרק. לאסוף את hemolymph exparing מן הפצע פשוט על ידי נגיעה בקצה הנימים כדי hemolymph.</li>
	<li>חסום מעט את החור הקטן בחלק העליון של נורת פיפטה עם האצבע כדי לעצור את תהליך הספיגה כאשר הנוזל בתוך צינור הנימים מגיע לקו קנה המידה הרצוי. הערה: יש לאסוף דגימה אחת של 1 מיקרוליטר של המולימפה ללא הרף ובמהירות כדי למנוע זיהום שומנים וחיבור צינורות.</li>
	<li>לחץ על נורת פיפטה כדי לפרוק את ההמולימפה שנאספה לתוך 100 μL של חיץ PBS (137 mmol / L NaCI, 2.7 mmol / L KCI, 4.3 mmol / L Na 2 HPO 4, 1.4 mmol / L KH 2 PO 4, pH 7.2-7.4). הערה: צינור הנימים מוכנס למאגר PBS.</li>
	<li>שנה לצינור נימי חדש בעת איסוף דגימה נוספת של 1 μL של המולימפה.</li>
</ol>4. צביעה כחולה קומאסי
<ol><li>אסוף 3 דגימות המולימפה באותו נפח (1 μL) מזחלי השלב השלישי בהתאם לפרוטוקולים המתוארים בשלב 3, ושחרר את ההמולימפה שנאספה לתוך מאגר PBS כדי ליצור נפח כולל של 100 μL.</li>
	<li>הוסף 25 μL של מאגר העמסת חלבון 5x (250 mmol / L Tris-HCI [pH 6.8], 10% W/V SDS, 0.05% W/V ברומופנול כחול, 50% W/V גליצרול, 5% W/V β-מרקפטואתנול) לתוך 100 μL של דגימות המולימפה מדולל, וחממו כדי לנטרל את החלבונים.</li>
	<li>טען 20 μL של הדגימות המבושלות על ג'ל חלבון 10% SDS-PAGE (ראה טבלת חומרים) כדי להפריד את החלבונים.</li>
	<li>מכתימים את הג'ל בתמיסת Coomassie Blue (מערבבים 1 גרם של Coomassie Brilliant Blue R-250 עם 250 מ"ל איזופרופנול, 100 מ"ל חומצה אצטית קרחונית ו-650 מ"ל של ddH2O, ומסננים את כל החלקיקים באמצעות נייר פילטר) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן מסירים את צבע הג'ל למשך שעה אחת עם תמיסת דה-צבעה (100 מ"ל חומצה אצטית, 400 מ"ל מתנול, 500 מ"ל של ddH2O).</li>
</ol>5. קביעת ריכוז החלבונים
<ol><li>יש לדלל אלבומין בסרום בקר (BSA) במינון 10 מ"ג/מ"ל ל-5 מ"ג/מ"ל, 2.5 מ"ג/מ"ל, 1.25 מ"ג/מ"ל, 0.625 מ"ג/מ"ל ו-0.3125 מ"ג/מ"ל באמצעות חיץ PBS בשיטת הדילול הכפול.</li>
	<li>שאפו 5 מיקרוליטר של חיץ PBS וכל ריכוז של תמיסות BSA בשלב 5.1, הוסיפו 1 מ"ל של מגיב צבע ברדפורד 1x (ראו טבלת חומרים), ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש במאגר PBS בריאגנט צבע ברדפורד כבקרה, ואפס ב- OD = 595 ננומטר. למדוד את ערכי הספיגה של כל אחד מריכוזי החלבונים הנותרים, ולבצע עקומה סטנדרטית.</li>
	<li>הוסף 1 μL של המולימפה מזחלים, נקבות או זכרים SBPHs לתוך 100 μL של חיץ PBS, ולאחר מכן צנטריפואט את הדגימות ב 1,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את המוציטים.</li>
	<li>יש לשאוף 90 מיקרוליטר של סופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש, ולמדוד את ערכי הספיגה של הסופרנאטנט בהתאם להוראות בשלב 5.2.</li>
	<li>חישוב ריכוזי החלבונים של דגימות ההמולימפה על פי משוואת הרגרסיה של העקומה הסטנדרטית. כלול שלושה משכפלים ביולוגיים עם שלושה שכפולים טכניים בניסויים.</li>
</ol>6. גילויים מיקרוסקופיים
<ol><li>השתמש micropipettes לאסוף hemolymph מ 10-15 SBPHs בשלבים התפתחותיים שונים. הוסף את ההמולימפה שנאספה לתוך צינור המכיל 20 μL של תמיסת 4% paraformaldehyde (ראה טבלה של חומרים). דוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לתקן את ההמולימפה.</li>
	<li>פיפטה 20 μL של המוציטים קבועים על מרכז שקופית מצופה סילאן (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>יבשו את הטיפה במתלה לייבוש שקופיות. הערה: יש להימנע מייבוש יתר.</li>
	<li>כסו את הדגימה בריאגנט אנטי-דהייה זהב 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (ראו טבלת חומרים), ובדקו את השקופית תחת מיקרוסקופ הפוך (ראו טבלת חומרים).</li>
</ol>7. כימות התא
<ol><li>לאסוף 1 μL של hemolymph מן SBPHs עם micropipette, ולהמיס אותו לתוך 20 μL של מאגר PBS.</li>
	<li>לדלל את דגימות ההמולימפה פי חמישה עם חיץ PBS.</li>
	<li>פיפטה 20 μL של תמיסת המולימפה למרכז תא ספירת התאים (ראה טבלת חומרים). כסו את הטיפה בפתק כיסוי (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>ספרו את התאים בחמשת הריבועים בתא ספירת התאים (איור משלים 1), תחת מיקרוסקופ הפוך (ראו טבלת חומרים). כלול שלושה משכפלים ביולוגיים עם שלושה שכפולים טכניים בכל אחד מהניסויים. תאים/μL = ספירה כוללת של חמישה ריבועים אמצעיים × 5 × גורם דילול × 104</li>
</ol>8. ניתוחים סטטיסטיים
<ol><li>בצע ניתוחים סטטיסטיים עם התוכנה המתאימה (ראה טבלת חומרים). צור קובץ חדש, בחר בעמודה, ייבא את הנתונים וצור התוויית פיזור עם סרגל.</li>
	<li>חשב את הממוצע וה- SD עבור כל קבוצת נתונים באמצעות סטטיסטיקת עמודות, והשתמש בכלי ANOVA חד-כיווני כדי להעריך את משמעות ההבדלים בין הקבוצות. לקבוע את הממוצע ואת SD מתוך שלושה עותקים ביולוגיים עם שלושה ניסויים עצמאיים.</li>
</ol>

איסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Ray, S., Casteel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector-mediated+plant-virus-vector+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Effector-mediated plant-virus-vector interactions.</a> Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).</li>
<li>Islam, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-insect+vector-virus+interactions+under+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Plant-insect vector-virus interactions under environmental change.</a> Science of the Total Environment. 701, 135044(2020).</li>
<li>Cory, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+virus+transmission%3A+Different+routes+to+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Insect virus transmission: Different routes to persistence.</a> Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).</li>
<li>Wang, X. W., Blanc, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transmission+of+plant+single-stranded+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses.</a> Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).</li>
<li>Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antimicrobial+peptides+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Insect antimicrobial peptides and their applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).</li>
<li>Liu, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+interaction+between+a+plant+virus+and+its+vector+insect+reveals+new+functions+of+hemipteran+cuticular+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).</li>
<li>Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bee+hemolymph+metabolome%3A+A+window+into+the+impact+of+viruses+on+bumble+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees.</a> Viruses. 13 (4), 600(2021).</li>
<li>Jia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+mediated+transmission+of+persistently+transmitted+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses.</a> Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).</li>
<li>Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+and+vertical+transmission+of+West+Nile+Virus+by+Aedes+vexans+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).</li>
<li>Gadhave, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+of+horizontal+and+vertical+transmission+of+cucurbit+leaf+crumple+virus+in+whitefly+Bemisia+tabaci+Gennadius%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius.</a> Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).</li>
<li>Logan, R. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+and+horizontal+transmission+of+cell+fusing+agent+virus+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222(2022).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949(2014).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).</li>
<li>Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antiviral+innate+immunity%3A+Pathways%2C+effectors%2C+and+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).</li>
<li>Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+hepatitis+B+virus+replication+by+interferons+and+Toll-like+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).</li>
<li>Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+dengue+virus+circumvents+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How dengue virus circumvents innate immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2860(2018).</li>
<li>Gilliam, M., Shimanuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+of+hemolymph+of+the+larval+honey+bee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L).</a> Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909(2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+virus+ensures+viral+stability+in+the+hemolymph+of+vector+insects+through+suppressing+prophenoloxidase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation.</a> mBio. 11 (4), e01453(2020).</li>
<li>Vidano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phases+of+maize+rough+dwarf+virus+multiplication+in+the+vector+Laodelphax+striatellus+%28Fall%C3%A9n%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén).</a> Virology. 41 (2), 218-232 (1970).</li>
<li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laodelphax+striatellus+Atg8+facilitates+Rice+stripe+virus+infection+in+an+autophagy-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner.</a> Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).</li>
<li>Zhang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+monooxygenases+CYP6AY3+and+CYP6CW1+regulate+Rice+black-streaked+dwarf+virus+replication+in+Laodelphax+striatellus+%28Fallen%29%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen).</a> Viruses. 13 (8), 1576(2021).</li>
<li>Ribeiro, C., Brehelin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+haemocytes%3A+What+type+of+cell+is+that%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Insect haemocytes: What type of cell is that.</a> Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).</li>
<li>Butolo, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+quality+method+for+hemolymph+collection+from+honeybee+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae.</a> PLoS One. 15 (6), e0234637(2020).</li>
<li>Nesa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+potential+of+a+ponericin-like+peptide+isolated+from+Bombyx+mori+L.+hemolymph+in+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Scientific Reports. 12 (1), 15493(2022).</li>
<li>Mahmoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-injected+Musca+domestica+larval+hemolymph%3A+Cecropin+upregulation+and+potential+anticancer+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect.</a> Molecules. 27 (5), 1570(2022).</li>
<li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((salivary+gland%2C+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3894(2012).</li>
<li>Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph+amino+acid+variations+following+behavioral+and+genetic+changes+in+individual+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae.</a> Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).</li>
<li>Fiorotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disclosing+hemolymph+collection+and+inoculation+of+metarhizium+blastospores+into+Rhipicephalus+microplus+ticks+towards+invertebrate+pathology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59899(2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

המולימפה הוא המדיום של מערכת הדם בפרוקי רגליים, וארבו-וירוסים יכולים לפלוש לרקמות פרוקי רגליים אחרות רק אם הם מסוגלים לשרוד את סביבת ההמולימפה העוינת. איסוף מדגם איכותי של המולימפה הוא הצעד הראשון בחקר אינטראקציות וקטור-וירוס המתרחשות בהמולימפה. דווח כי ניתן להשיג המולימפה של חרקים ממספר אתרים בגוף החרק, כולל פצע ברגל הקדמית, חתך קל באזור הראש, או פצע קרע בבטן26,27,28,29. שיטות איסוף שונות עשוי...

וירוסים הן של בעלי חיים והן של צמחים יכולים להיות מועברים על ידי פרוקי רגליים, ונגיפים אלה מהווים איום חמור על בריאות האדם וגורמים להפסדים כלכליים עצומים בחקלאות 1,2,3. חשוב לציין כי המולימפה של פרוקי הרגליים, המשמשת כמערכת הדם וכמרכיב חיוני של מערכת החיסון בפרוקי רגליים, ממלאת תפקיד חשוב בוויסות ההעברה הארבו-ויראלית. וירוסים הנרכשים דרך מעי פרוקי הרגליים מועברים לרקמות אחרות רק לאחר בריחה מוצלחת מסביבת המולימפה השלילית 4,5,6,7. מחזור החיים של וירוסים בהמולימפה פרוק הרגליים כרוך בהישרדות הנגיף בפלזמה הנוזלית, כניסה להמוציטים והעברה לרקמות אחרות, ומנגנוני אינטראקציה שונים בין וירוסים לווקטורים מתרחשים בהמולימפה 8,9,10,11,12. לדוגמה, העברה אנכית של RSV על ידי SBPH תלויה באינטראקציה מולקולרית בין חלבון SBPH vitellogenin לבין חלבון RSV (וירוס פס אורז) capsidprotein 13,14. וירוסים מסוימים עשויים לברוח מהתגובה החיסונית של ההמולימפה על ידי קשירת גורמים וקטוריים ספציפיים15,16,17,18. לכן, חקירת אינטראקציות וקטור-וירוס בהמולימפה של פרוקי רגליים חשובה לפיתוח הבנה טובה יותר של העברת arbovirus.
המולימפה של כמה חרקים קטנים, כגון planthoppers, leafhoppers, וכמה יתושים, קשה לאסוף בשל גודלם. כדי להתמודד עם בעיה זו, פותחו מספר שיטות לאיסוף המולימפה, כולל החדרת מחט מזרק ישירות לגוף החרק כדי לחלץ מיקרו-נפח של ההמולימפה, איסוף הפרשה מאתר הפצע באמצעות פינצטה עדינה, וצנטריפוגה ישירה. שיטות אלה אפשרו מדידה של רמות ביטוי גנים יחסיות וטיטרים נגיפיים בתוך המולימפה 19,20,21. עם זאת, שיטה יעילה לכימות נפח המולימפה, הנחוצה לספירת המוציטים, כימות חלבונים וניתוח פעילות אנזימים, אינה זמינה כיום עבור חרקים קטנים אלה.
SBPH (פלנטהופר חום קטן) הוא סוג של וקטור חרקים קטן עם אורך גוף של כ 2-4 מ"מ. SBPH מסוגל להעביר מגוון רחב של וירוסים צמחיים, כולל RSV, תירס גס ננס וירוס, אורז שחור פסים ננס וירוס22,23,24. האינטראקציה בין SBPH ו- RSV נחקרה לעומק בעשור האחרון. כדי להקל על העבודה עם SBPHs, פיתחנו שיטה חדשנית ופשוטה לאיסוף המולימפה. שיטה זו, המבוססת על עקרון הכוחות הנימיים, משתמשת בנימים בעלי סימן קנה מידה כדי לרכוש את ההמולימפה של החרק באופן מדויק וניתן לכימות. זה מאפשר לנו לאסוף נפח מסוים של המולימפה מחרקים קטנים ביעילות וללמוד את סביבת ההמולימפה של וקטורים קטנים בפירוט רב יותר.

<table><tbody><tr><td>10% ג'ל חלבון SDS-PAGE</td><td>Bio-rad</td><td>4561035</td><td>הפרדה וזיהוי חלבונים</td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>לקיבוע התאים או הרקמות&nbsp;</td></tr><tr><td>מגיב צבע ברדפורד</td><td>Bio-rad</td><td>5000205</td><td>זיהוי ריכוז חלבון</td></tr><tr><td>נימי</td><td>הירשמן</td><td>9000101</td><td>לאיסוף</td></tr><tr><td>תא ספירת תאים</td><td>ACMEC</td><td>AYA0810</td><td>ספירת המוציטים שקופית</td></tr><tr><td>זכוכית</td><td>Gitoglas</td><td>10127105A</td><td>להחזקת</td></tr><tr><td>חרקים שקופית זכוכית מצופה סילאן</td><td>סיגמא</td><td>S4651-72EA</td><td>להחזקת דגימות מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מגיב זהב אנטי-דהייה עם DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td> כיסוי מיקרוסקופ <td>מכתים גרעין</td></tr><tr><td></td><td>Gitoglas</td><td>10212424C</td><td>לתצפית מיקרוסקופית</td></tr><tr><td>נורת פיפטה</td><td>הירשמן</td><td>9000101</td><td>לאיסוף המולימפה</td></tr><tr><td>פריזמה 8.0 תוכנת</td><td>GraphPad</td><td></td> / <td>ניתוחים סטטיסטיים</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ&nbsp;</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>לדיסקציה של חרקים</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Tianld</td><td>P5622</td><td>לדיסקציה של</td></tr><tr><td>חרקים Zeiss מיקרוסקופ הפוך</td><td>Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td>תצפית המוציטים</td></tr></tbody></table>

שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

פרוקי רגליים ידועים כמעבירים מגוון וירוסים בעלי חשיבות רפואית וחקלאית דרך ההמולימפה שלהם, החיונית להעברת הנגיף. אוסף Hemolymph הוא הטכנולוגיה הבסיסית לחקר אינטראקציות וירוס-וקטור. כאן, אנו מתארים שיטה חדשנית ופשוטה לאיסוף כמותי של המולימפה מפרוקי רגליים קטנים באמצעות Laodelphax striatellus (הפלנטהופר החום הקטן, SBPH) כמודל מחקר, שכן פרוק רגליים זה הוא הווקטור העיקרי של וירוס פס האורז (RSV). בפרוטוקול זה, התהליך מתחיל בצביטה עדינה של רגל אחת של פרוק הרגליים הקפוא בפינצטה עדינה ולחיצה על ההמולימפה מתוך הפצע. לאחר מכן, micropipette פשוט המורכב נימים נורה פיפטה משמש לאסוף את hemolymph transudative מן הפצע על פי העיקרון של כוחות נימים. לבסוף, ניתן להמיס את ההמולימפה שנאספה לתוך חיץ ספציפי למחקר נוסף. שיטה חדשה זו לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים היא כלי שימושי ויעיל למחקר נוסף על ארבו-וירוסים ואינטראקציות וקטור-וירוס.

דגם מיקרופיפטה וקולקציית המולימפה פיתחנו מיקרופיפטה פשוטה שפעולתה מבוססת על הכוחות הקפילריים של צינור הנימים. המיקרופיפטה מורכבת מצינור נימי ומנורת פיפטה (איור 1A). צינורות נימים זמינים בגדלי נפח שונים הנעים בין 1 μL ל 20 μL, ונפחי הצינור הנימי נבחרים בהתאם לדרישות. צינורות נימים עם נפחים קטנים יותר אינם מוצעים מכיוון שהפתחים העדינים במיוחד של צינורות בעלי נפח קטן יותר יכולים להקשות על ספיגת נוזלים כגון המולימפה. נורת הפיפט מכילה חור בחלק העליון שלא ניתן לסתום במהלך איסוף...

אנו מתארים שיטה לאיסוף המולימפה הניתנת לכימות ביעילות מפרוקי רגליים קטנים לצורך ניתוח לאחר מכן.

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus ...

המחקר שלנו מתמקד בארבו-וירוסים, חרקים ואינטראקציות בין צמחים. השגת דגימות המולימפה מפרוקי רגליים קטנים מהווה אתגר טכני למחקר על מחלות המועברות על ידי חרקים. פרוטוקול זה מציג טכניקה מדויקת וניתנת לכימות כדי להתמודד עם בעיה זו.התפתחויות מחקריות אחרונות בהעברת ארבו-וירוסים גילו כי וירוסים יכולים לתמרן מספר גורמים וקטוריים חשובים כדי לפרוץ את מחסום המאכסן. פרוטוקול זה הוא טכניקה פשוטה, חסכונית ובעלת ערך המאפשרת כימות מדויק של ההמולימפה. שיטה זו מציעה גם טכנולוגיה רבת ערך להתחלת האינטראקציות בין וירוסים לווקטורים.המחקר הקרוב שלנו יתמקד בהבנת המנגנונים המולקולריים של העברת וירוסים על ידי חרקים וקטוריים תוך חקר ושיפור טכניקות תפעוליות חדשות.

a-precise-quantifiable-method-for-collecting-hemolymph-from-small

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטן פרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס, הוא לטעון את המקור הנוח ביותר עבור כמויות גדולות של דם של חסרי חוליות כלשהו. דם היא פשוטה בהרכב, כאשר רק סוג תא אחד במחזור כללי, amebocyte פרטנית, ורק שלושה חלבונים בשפע בפלסמה, hemocyanin, C-reactive חלבונים, α2-macroglobulin. הדם נאסף מן הלב ותאי דם פלזמה מופרדים על ידי צנטריפוגה.

דם אוסף של סרטן הפרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס

איתות אינסולין נשמרת המסלולים נמצא זבוב...

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

שיטה פשוטה אך מדויקת לאסוף כתם hemocytes יתוש מתואר. השיטה שלנו משלבת את הפשטות של זלוף עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד את ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים. שיטה זו מקלה על מחקרים וידע המחייב של סוגי hemocytes ושפע שלהם.

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti</em

hemocytes חרקים למלא תפקידים חשובים רבים, הוא חיסון ושאינם מחוסנים, לאורך כל שלבי התפתחות חרקים. הידע הנוכחי שלנו של הסוגים והתפקוד hemocyte מגיע ממחקרים על מודלים גנטיים של חרקים. כאן, אנו מציגים שיטה לחילוץ, כימות והמחשת hemocytes מזחלים פרא.

פרוטוקול פשוט לחילוץ Hemocytes מזחלי Wild

המולימפה של דרוזופילה משמשת הן כדם והן כנוזל אינטרסטיציאלי, המסתובב בכל הגוף במהלך שלבי הזחל והבוגרים. סרטון זה מתאר פרוטוקול לאיסוף המולימפה של הזחלים על מנת לכמת את התאים במחזור.

הפרעה בקוטיקולה: שיטה לאיסוף המולימפה מזחלי דרוזופילה

סרטון זה מדגים את בדיקת הפרעות ההמוציטים, ומעריך הידבקות חוזרת של המוציטים בכיסים ההמטופויטיים של זחלי דרוזופילה. הפרעה מכנית משחררת המוציטים תושבים, ומעלה את ספירת ההמוציטים במחזור. לאחר ההחלמה, דבקות מחדש של המוציטים תושב הוא אישר, הממחיש הפיכות.

בדיקת הפרעה המוציטית להערכת היצמדות חוזרת של המוציטים לכיסים המטופויטיים

תאי דם דרוזופילה, או המוציטים, עוברים בין אתרי מגורים למחזור הדם.  בזחל, המוציטים תושבים (יושבים) מתמקמים במיקרו-סביבות אינדוקטיביות, הכיסים ההמטופויאטיים, בעוד המוציטים במחזור נעים בחופשיות בהמולימפה. מטרת פרוטוקול זה היא בידוד וכימות סטנדרטיים של שתי אוכלוסיות ההמוציטים הללו, הנבדלות מבחינה התנהגותית אך משתנות זו בזו.

אוכלוסיות תאי דם Assaying של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; זחל

תסיסנית ומערכות hematopoietic יונקים חולקים הרבה מאפיינים משותפים, מה שהופך תסיסנית מודל גנטי אטרקטיבי ללמוד hematopoiesis. כאן אנו מדגימים לנתיחת הרכבה של איבר hematopoietic הגדול זחל אימונוהיסטוכימיה. כמו כן, אנו מתארים שיטות Assay שונים תאי hematopoietic זחל כולל hemocytes במחזור ותאי קריסטל נייחים.

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

שיטה זו מדגימה כיצד להמחיש הפתוגן הפלישה לתוך תאים חרקים עם דגמים תלת ממדיים (3D). Hemocytes של הזחלים דרוזופילה נדבקו בנגיף פתוגנים נגיפי או חיידקי, או vivo לשעבר או ויוו. Hemocytes נגוע היו לאחר מכן קבועה, צבעונית עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, עוקבות שיחזור תאי תלת-ממד.

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

ניתוח של שנתות המוליקמ מייצג מקור חשוב של מידע על איך כמה פתוגנים לגרום למחלה וכיצד קרציות מגיבים באופן חיסוני לזיהום זה. המחקר הנוכחי מדגים כיצד לחסן מפיץ פטרייתי ולאסוף המוליםקמ מ הנשים המנוסות מיקרופיאוס .

בגילוי המוליל אוסף והחיסונים של מטרהיזיפיאוס לתוך ריפיקו מיקרופלוס קרציות לקראת לימודי חסרי חוליות פתולוגיה

פרוטוקול זה מתאר בvivo של פאיגוציטוזה המשמש להערכת ולכמת את היכולת של דרוסופילה מלאנוזוזה בגיל צעיר ומיושן לחיידק הפאגוציטוז.

הערכת היכולת הייחודית ביותר לגיל מיוחד למבוגרים דרוזופילה מלאנוטציטים באמצעות שיטת בVivo פגוציטוזה

למד שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים באמצעות מיקרופיפטה מיוחדת. טכניקה זו מאפשרת חקר אינטראקציות בין נגיפים לנשאים בביולוגיה.

שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים

גלה סרטונים נוספים