בידוד דו-שלבי ללא תגים של מיטוכונדריה לשיפור גילוי וכימות חלבונים
2 ביוני 2023
אנו מציגים פרוטוקול דו-שלבי לבידוד מיטוכונדריה באיכות גבוהה התואם לגילוי וכימות חלבונים בקנה מידה של פרוטאום. הפרוטוקול שלנו אינו דורש הנדסה גנטית ולכן מתאים לחקר מיטוכונדריה מכל תא ורקמות ראשוניים.
המעבדה שלנו חוקרת שינויים במיטוכונדריה ובמטבוליזם של אנרגיה, וכיצד הם משפיעים על תהליכים בריאים ופתולוגיים כמו הפעלת מערכת החיסון, סרטן או הפרעות מטבוליות. מטרתנו היא לעזור לפתח טיפולים חדשים למגוון רחב של הפרעות על ידי מתן הבנה טובה יותר של תפקוד המיטוכונדריה ומטבוליזם של אנרגיה. כלים כגון פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות, מטבולומיקה ומסכים גנטיים מסוג CRISPR-Cas9 הופכים פופולריים יותר לזיהוי מנגנונים מולקולריים הן בתפקוד המיטוכונדריה והן במטבוליזם של אנרגיה בסוגי תאים ובסביבות ספציפיות.
בניגוד לשיטות אחרות, הפרוטוקול שלנו משתמש בשני שלבי טיהור, צנטריפוגה דיפרנציאלית ולכידת מערכת החיסון לבידוד מיטוכונדריאלי. זה מציע כמה יתרונות, כמו סילוק משופר של מזהמים, וזה גם כלי רב עוצמה לזיהוי חלבונים מיטוכונדריאליים חדשים. הפרוטוקול שלנו מספק תובנה לגבי הרכב, ולכן תפקוד המיטוכונדריה בסוגי תאים וסביבות שונות.
זה יכול לעזור לנו להבין טוב יותר תהליכים נורמליים כמו הפעלת מערכת החיסון, אבל גם תהליכים פתולוגיים כמו סרטן. נתמקד במקרופאגים מיטוכונדריאליים. נבדוק כיצד הרכב המיטוכונדריה משתנה במהלך התגובה החיסונית כדי להבין טוב יותר את תפקודם.
הממצאים שלנו יכולים להוביל לפיתוח תרופות עם, למשל, השפעות אנטי דלקתיות.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול דו-שלבי לבידוד מיטוכונדריה באיכות גבוהה, שמטרתו לשפר את הבנת התפקוד המיטוכונדריאלי ומטבוליזם האנרגיה בהקשרי ביולוגיים שונים, כולל הפעלה חיסונית וסרטן. התאימות של השיטה לתאים ורקמות ראשוניים מאפשרת יישום רחב יותר בגילוי וכימות של חלבונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- תפקוד מיטוכונדריאלי
- מטבוליזם של אנרגיה
- תהליכים פתולוגיים כגון סרטן והפעלה חיסונית
רקע
- חקירת האופן שבו שינויים מיטוכונדריאליים משפיעים על בריאות ומחלה
- קידום אסטרטגיות טיפוליות באמצעות הבנה מולקולרית משופרת
- שימוש בספקטרומטריית מסות ובכלים אחרים לניתוח פרוטאומי
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פרוטוקול טיהור דו-שלבי באמצעות סרסיפוגציה דיפרנציאלית ולכידה אימונית
- תאים ורקמות ראשוניים לבידוד מיטוכונדריה
- טכנולוגיות פרוטאומיקה ומטבוליזומיקה
תוצאות עיקריות
- טיהור מיטוכונדריואלי משופר המוביל לזיהוי טוב יותר של חלבונים מיטוכונדריאליים
- תובנות לגבי הרכב מיטוכונדריאלי המשפיע על תגובות חיסוניות
- השלכות פוטנציאליות לפיתוח תרופות ממוקדות, כגון טיפולים אנטי-דלקתיים
מסקנות
- המחקר מבסס פרוטוקול חדש לניתוח מיטוכונדריאלי ללא מניפולציה גנטית
- לממצאים יש השלכות משמעותיות על ההבנה והטיפול בהסברים שונים הקשורים לתפקוד לקוי של מיטוכונדריה
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מרכזית
בידוד נאמן של מיטוכונדריה הוא קריטי לגילוי ולכימות מדויקים של חלבונים במערכות רלוונטיות למחלה. פרוטוקול זה, המבוצע בשני שלבים וללא תגים, מאפשר אפיון חסון של הפרוטאומיות המיטוכונדריאלית מתאים ראשוניים ומרקמות, ובכך תומך בביטחון ניבוי בשלבי הגילוי המוקדמים ובמחקר תרגומי. רמת טוהר משופרת ותוצרי ספקטרומטריית מסה כמותית מספקים מידע ישיר לתיקוף מטרות ולהפחתת סיכונים מכניסטיים בתחומי טיפול מגוונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של הרכב חלבונים מיטוכונדריאליים במצבים פתולוגיים ופיזיולוגיים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי בידוד אבניי עם מינימום מזהמים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות פרוטאומיקה חיסורית ואנליזה כמותית.
- משפר את הביטחון החזוי עבור מטרות מיטוכונדריאליות בתהליך מיון תיקי פיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת תכשירי מיטוכונדריה באיכות גבוהה עבור תהליכי עבודה פרוטאומיים המשכיים.
- מסטנדרטת את כמות הדגימה להשגת בדיקות ספקטרומטריה של מסות כמותיות הניתנות לשחזור.
- מאפשרת זיהוי מהימן של חלבוני מיטוכונדריה חדשים עבור קמפיינים של סריקה.
- תומכת ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר בפלטפורמה על פני קווי תאים, תאים ראשוניים ורקמות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פרופילים של חלבונים מיטוכונדריאליים למודלים רלוונטיים למחלה ולגילוי סממנים ביולוגיים.
- מבטיחה רצף משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי אפשור השוואות בין מערכות שונות.
- מפחיתה סיכון ביולוגי במחקרים תרגומיים באמצעות אספקת אפיון מקיף של האורגנלה.
- תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על נתונים פרוטאומיים כמותיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד למחקר פרה-קליני, ומאפשר ניתוח מיטוכונדריאלי חסון בכל שלב.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לאפיון מדויק של חלבונים מיטוכונדריאליים.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליזה: מספק מדידות מבוססות ספקטרומטריית מסות וחישובים של העשרה לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקל על התאמת סמנים ביולוגיים ותיקוף מודלים של מחלות באמצעות פרוטאומיקה ספציפית לאבנים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה סטנדרטית ללא תגיות, הניתנת להתאמה למספר מערכות ביולוגיות ותוכניות מחקר.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר מיטוכונדריאלי.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בידוד ואנליזה של מיטוכונדריה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון על ידי אספקת נתונים באיכות גבוהה לתיקוף מטרות.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון וקידום של מטרות ומסלולים מיטוכונדריאליים.
שיקולים ליישום
- דורש מומחיות בבידוד אברונים ובספקטרומטריית מסות כמותית.
- מחייב גישה לציוד צנטריפוגה ותשתית פרוטאומיקה.
- מפיק תועלת מסטנדרטיזציה בין-צוותית להכנת דגימות וניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה לסוגי תאים ורקמות שונים ללא צורך במודיפיקציה גנטית.
- תלוי באופטימיזציה קפדנית לצמצום זיהומים ומקסום היבול.
