Name: שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: חקור אירועי סחר בממברנות בפיתוח שומות בצמחים Arabidopsis thaliana באמצעות טכניקות דימות קונפוקליות וטיפולים פרמקולוגיים. השיטה מסייעת להבנת מנגנוני התאמה ללחות סביבתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (IOS-2217757) (X.Q.) ופרס קרן ברונסון של אוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה (UAMS) (H.Z).

1. הכנת הפתרונות
<ol><li>הכן תמיסת עיקור זרעים על ידי ערבוב 15 מ"ל אקונומיקה עם 35 מ"ל מים מזוקקים ו 50 מיקרוליטר של טריטון X-100.</li>
	<li>הכינו תמיסת ברפלדין A (BFA) על ידי המסת אבקת BFA באתנול לריכוז סופי של 10 mM (מלאי). הכן תמיסת וורטמנין (Wm) על ידי המסת אבקת Wm ב- DMSO לריכוז סופי של 10 mM (מלאי).</li>
</ol>2. זריעת הזרעים
<ol><li>Aliquot 10-50 זרעים מכל אחד מהצמחים הטרנסגניים הדרושים לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של תמיסת עיקור זרעים לכל צינור, וערבב היטב על ידי היפוך הצינור בעדינות במשך 10 דקות על שייקר.</li>
	<li>השליכו את תמיסת עיקור הזרעים ושטפו את הזרעים ב-1 מ"ל מים מזוקקים חמש פעמים.</li>
	<li>הוסיפו 300 μL של מים מזוקקים אוטוקלאביים לכל צינור, וזרעו את הזרעים על מצע טרשת נפוצה בחצי חוזק המכיל 1% (w/v) סוכרוז ו-0.75% (w/v) אגר. השלם את המדיום עם אנטיביוטיקה המתאימה לפי הצורך.</li>
	<li>שמור את הצלחת הפוכה ב 4 ° C בחושך במשך 2 ימים כדי לסנכרן את הנביטה.</li>
	<li>לאחר יומיים, העבירו את הצלחת לחדר גדילה עם מחזור אור / 8 שעות חושך של 16 שעות (80 μmol / m2/s1) ב 22 ° C. זה נחשב היום הראשון לאחר הנביטה (1 dpg).</li>
	<li>שתול את השתילים באדמה ב 10 dpg לצמיחה נוספת.</li>
</ol>3. הכנת צמחים טרנסגניים F1 בצבע כפול
<ol><li>לגדל צמחים טרנסגניים הומוזיגוטיים הנושאים ERL1-YFP (צמח A) וצמחים טרנסגניים הומוזיגוטיים הנושאים חלבון סמן RFP-Ara7 (צמח B)20 זה לצד זה עד לפריחה בחדר צמיחה עם מחזור אור / 8 שעות כהה (80 μmol/ m 2/s1) ב 22 ° C.</li>
	<li>בחרו תפרחת צעירה מצמח A. שמרו על פרח אחד שעומד להיפתח על התפרחת להצלבות גנטיות. מוציאים את כל הפרחים והסיליקים הישנים יותר. בנוסף, הסירו בזהירות את הפרחים הצעירים ואת המריסטמים הפרחוניים כדי למנוע בלבול עתידי.</li>
	<li>נתחו בעדינות את הפרח שלא נפתח על ידי הסרת עלי הגביע, עלי הכותרת והאבקנים באמצעות זוג פינצטות חדות. השאירו רק את הפיסטיל על התפרחת.</li>
	<li>לוקחים אבקן בוגר מפרח פתוח על צמח B, ומפקידים את גרגרי האבקה על הצלקת של הפיסטיל המנותח על צמח A.</li>
	<li>תייגו את הפרח המוצלב ידנית על ידי ציון אביו, אמו ותאריך הצלב הגנטי. תנו לפרח להתבגר, וקצרו את זרעי F1 כאשר הסיליק הופך צהוב/חום (~ 20 יום לאחר הצלב). בדוק אם יש מפעל F1 מוצלח שיש לו גם אותות YFP וגם RFP.</li>
</ol>4. טיפול תרופתי
<ol><li>לטיפול BFA, הסר את הקוטילדונים של שתילים בני 7 ימים, טבול את שאר השתילים בתמיסת דמה (0.3% אתנול) או בתמיסת BFA של 30 מיקרומטר, החל ואקום למשך דקה אחת ושמור את הדגימה שקועה במשך 30 דקות לפני ההדמיה.</li>
	<li>לטיפול בוורטמנין, הסר את הקוטילדונים של שתילים בני 7 ימים, טבול את שאר השתילים בתמיסת DMSO 0.25% או וורטמנין 25 mM, החל ואקום למשך דקה אחת ושמור את הדגימה שקועה למשך 30 דקות לפני ההדמיה.</li>
	<li>לטיפול ואקום של דגימות, בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל, להוסיף 500 μL של פתרון התרופה המתאימה, ולטבול את שתילים מנותחים לתוך הפתרון. חברו בחוזקה מזרק בנפח 10 מ"ל לצינור המיקרוצנטריפוגה, והפעילו ואקום למשך דקה אחת (איור 1). הסר את המזרק, ולשמור את הדגימה בתמיסה למשך הזמן הנדרש. מוציאים בעדינות את השתילים להכנת הדמיה.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig01.jpg"> איור 1: התקן ואקום פשוט. מזרק 10 מ"ל מחובר לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל לטיפול ואקום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
5. הכנת דגימה להדמיה
<ol><li>נתחו את העלה האמיתי מהדגימה שטופלה באמצעות סכין גילוח חד. הניחו בעדינות את העלה האמיתי בטיפת מים על מגלשת זכוכית, והשאירו את הצד האבקסי למעלה. כסו באיטיות את העלה האמיתי עם כיסוי תוך הימנעות מלכידת בועות.</li>
</ol>6. הדמיה קונפוקלית
הערה: מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה הפוכה של Leica SP8 שימש לצילום האות הפלואורסצנטי של הדגימות בעבודה זו.
<ol><li>הגדרת נתיב אלומה<ol><li>בחר לייזר של 514 ננומטר לעירור YFP. השתמש בעוצמת לייזר גבוהה כדי להגביר את עוצמת האות, ובכך להשיג איכות תמונה גבוהה. עם זאת, עוצמת לייזר מעל 5% מסתכנת בהלבנה, ובריאות הדגימה עלולה להיפגע. אם אות הדגימה אינו עמום מדי, התחל בעוצמת לייזר נמוכה.</li>
		<li>הפעל PMT/HyD לצורך זיהוי, והגדר את ספי פס הפליטה העליון והתחתון בהתבסס על הספקטרום של פלואורופור YFP. הגדר חלון זיהוי של 530-570 ננומטר כדי לאסוף את אות YFP.</li>
		<li>הדמיה רציפה לצבע השני: לחצו על כפתור Seq והוסיפו ערוץ חדש. כברירת מחדל, נתיב קרן YFP שתוכנן בעבר יהיה Seq 1. ב- Seq 2, בחר לייזר של 561 ננומטר עבור עירור RFP, והגדר חלון זיהוי של 570-630 ננומטר כדי לאסוף את אות ה- RFP.</li>
	</ol></li>
	<li>הגדרת תנאי סריקה (איור 2)<ol><li>כדי לדמות את פעילות התנועה של הממברנה התת-תאית בתוך תאים מקדימים סטומאטליים, בחר עדשת Corr 63x/1.2 W במערכת לצורך הדמיה.</li>
		<li>התבנית מתייחסת לגודל התמונה בפיקסלים. התחל עם 1,024 פיקסלים x 1,024 פיקסלים, ולאחר מכן מטב זאת בהתבסס על גורם הזום והגדרות המטרה לקבלת רזולוציה טובה של איכות פרסום.</li>
		<li>המהירות מתייחסת למהירות ראש הסריקה כאשר הלייזר עובר מעל כל פיקסל. למרות שמהירויות סריקה איטיות גורמות לעתים קרובות ליחס אות לרעש טוב יותר, ייתכן שהן לא ילכדו ביעילות את אירועי הסחר בממברנות המשתנים במהירות. התחל במהירות של 400 הרץ, ובצע אופטימיזציה זו בהתבסס על המצב הספציפי של הדגימות.</li>
		<li>מקדם הזום משמש להתקרבות של אזור עניין מבלי לשנות את עדשת המטרה. התחל עם מקדם זום של 1, ומטב אותו בהתאם לצרכים הספציפיים של הניסוי.</li>
		<li> ממוצע הקו מתייחס למספר הפעמים שכל קו X ייסרק כדי לקבל תוצאה ממוצעת. ממוצע קו גדול יותר מפחית את הרעש בתמונה המתקבלת, אך גם מאריך את זמן הסריקה ואת זמן החשיפה לאור הלייזר. כדי לדמות אירועי סחר בממברנה, אל תשתמש בממוצע קו גבוה. התחל עם ממוצע שורות פי 2, ומטב לפי הצורך.</li>
	</ol></li>
	<li>איסוף סדרת זמן הערה: כאשר חוקרים אירועי סחר בממברנה, לעתים קרובות יש צורך בסדרת זמן כדי לתעד את התנועה המהירה של האנדוזומים התת-תאיים.<ol><li>במצב רכישה, בחר במצב סריקה xyt כדי להפעיל את כלי השירות של סידרת הזמן.</li>
		<li>החלט על תקופת המתנה בין נקודות הזמן תחת מרווח זמן. לחלופין, לחץ על מזער כדי לצלם את התמונות מיד בזו אחר זו. מרווח זמן של 7 שניות שימש בניסוי סדרת הזמן הבאה.</li>
		<li>בחר משך זמן והזן את הזמן הכולל להפעלת הניסוי. לחלופין, הגדר את מספר המסגרות שייאספו על-ידי בחירה באפשרות 'מסגרות ' (איור 3).</li>
	</ol></li>
	<li>כדי לאסוף את המידע התלת-ממדי בנוגע לאירוע הסחר בממברנה בתוך התא כולו, השתמש במצב סריקה Z-stack. הקרנת העוצמה המרבית של תמונות מחסנית Z משמשת לעתים קרובות לניתוח.<ol><li>בחר את מצב הסריקה xyz במצב רכישה, ולאחר מכן כלי השירות Z-Stack יהפוך לנגיש.</li>
		<li>בחר באפשרות Z-wide. תחת מצב סריקה, הגדר את התמונה העליונה ואת התמונה התחתונה של ערימת Z באמצעות הלחצנים התחלה וסיום.</li>
		<li>הגדר את העובי של z-step על ידי לחיצה על גודל z-step. לחלופין, הגדירו כמה תמונות לצלם כדי לכסות את כל הטווח של ערימת Z. כדי להבטיח עקביות בין הדגימות, הגדירו את גודל שלב z (איור 4).</li>
	</ol></li>
	<li>עיבוד תמונה<ol><li>הקרנת העוצמה המרבית של תמונות z-stack נוצרת על ידי התוכנה הקונפוקלית (http://www.leica-microsystems.com). בכרטיסייה ראשית תהליך , בחר תחילה את קובץ z-stack המעוניין תחת הכרטיסייה פתיחת פרויקטים בצד שמאל קיצוני. לאחר מכן, עבור לכרטיסייה האמצעית בשם Process Tools, בחר את פונקציית ההקרנה , בחר Maximum בחלונית הנפתחת של Method, ולחץ על הלחצן Apply . תמונת הקרנה של מחסנית z תיווצר תחת הכרטיסיה פרוייקטים פתוחים.</li>
		<li>הווידאו של תמונות סדרת הזמן נוצר על ידי פיג'י (https://imagej.net/Fiji). בכרטיסיה קובץ , השתמש בפונקציה פתח כדי לפתוח את כל התמונות של סדרות הזמן בסדר הנכון. בכרטיסייה תמונה , אתר את הפונקציה Stack ובחר Images to stack כדי ליצור סרטון. שמור את הקובץ בתבנית .avi עם קצב המסגרות הרצוי (5 מסגרות לשנייה לווידאו 1).</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig02.jpg"> איור 2: לוח מצב הסריקה של ממד XY. החלונית 'מצב סריקה' משמשת להגדרת תנאי סריקת התמונה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig03.jpg"> איור 3: כלי השירות של סדרת הזמן במצב סריקה xyt. כלי השירות Time Series משמש להגדרת תנאי ההדמיה לאיסוף רצף של סידרת תמונות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig04.jpg"> איור 4: כלי השירות z-stack במצב סריקה xyz. כלי השירות z-stack משמש להגדרת תנאי הדמיה לאיסוף סדרה של תמונות על ציר z. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

חקירה מרחבית-זמנית של דינמיקת ERL1 באמצעות הדמיה קונפוקלית

<ol><li>Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+endomembrane+trafficking+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants.</a> Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).</li>
<li>Sigismund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+and+signaling%3A+Cell+logistics+shape+the+eukaryotic+cell+plan%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan.</a> Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).</li>
<li>Lyu, Z., Genereux, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+measuring+protein+trafficking+across+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPlusChem%22%5BJournal%5D)">Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes.</a> ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).</li>
<li>Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+roads%3A+Chemical+tools+and+cell+biology+to+study+unconventional+protein+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion.</a> Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).</li>
<li>Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+wortmannin-induced+reorganization+of+the+trans-Golgi+network+the+key+to+explain+charasome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 756(2016).</li>
<li>Qi, X., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+and+environmental+signals+guiding+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal and environmental signals guiding stomatal development.</a> BMC Biology. 16 (1), 21(2018).</li>
<li>Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+lineage+control+by+developmental+program+and+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 751852(2021).</li>
<li>Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid-induced+stomatal+closure%3A+An+important+component+of+plant+defense+against+abiotic+and+biotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 615114(2021).</li>
<li>Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBecklin%2C+KM+%22Photosynthesis%2C+Respiration%2C+and+Climate+Change.%2C+1st+edition%22">Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition</a>. , Springer. Cham, Switzerland. (2021).</li>
<li>Yang, M., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+too+many+mouths+and+four+lips+mutations+affect+stomatal+production+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).</li>
<li>Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+peptide+gene+EPF1+enforces+the+stomatal+one-cell-spacing+rule%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule.</a> Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).</li>
<li>Hara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cell+density+is+autoregulated+via+a+secretory+peptide%2C+EPIDERMAL+PATTERNING+FACTOR+2+in+Arabidopsis+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves.</a> Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).</li>
<li>Hunt, L., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+peptide+EPF2+controls+asymmetric+cell+divisions+during+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development.</a> Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).</li>
<li>Sugano, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomagen+positively+regulates+stomatal+density+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis.</a> Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).</li>
<li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+density+is+controlled+by+a+mesophyll-derived+signaling+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule.</a> Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).</li>
<li>Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signalling+peptide+EPFL9+is+a+positive+regulator+of+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development.</a> New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).</li>
<li>Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+patterning+and+differentiation+by+synergistic+interactions+of+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases.</a> Science. 309 (5732), 290-293 (2005).</li>
<li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+receptor-like+protein+acts+as+a+specificity+switch+for+the+regulation+of+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development.</a> Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).</li>
<li>Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+of+ligand-receptor+pairs+specifying+stomatal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning.</a> Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+manifold+actions+of+signaling+peptides+on+subcellular+dynamics+of+a+receptor+specify+stomatal+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate.</a> Elife. 9, e58097(2020).</li>
<li>MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+control+of+asymmetric+cell+divisions+that+establish+the+stomatal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage.</a> Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).</li>
<li>Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+asymmetric+cell+division+and+differentiation+of+stomata%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata.</a> Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).</li>
<li>Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+FAMA+controls+the+final+proliferation%2Fdifferentiation+switch+during+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development.</a> Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).</li>
<li>Kanaoka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCREAM%2FICE1+and+SCREAM2+specify+three+cell-state+transitional+steps+leading+to+Arabidopsis+stomatal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation.</a> Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).</li>
<li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+development+and+pattern+controlled+by+a+MAPKK+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase.</a> Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).</li>
<li>Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+development+and+patterning+are+regulated+by+environmentally+responsive+mitogen-activated+protein+kinases+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).</li>
<li>Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulators+of+stomatal+lineage+signal+transduction+alter+membrane+contact+sites+and+reveal+specialization+among+ERECTA+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases.</a> Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).</li>
<li>Le, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin+transport+and+activity+regulate+stomatal+patterning+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development.</a> Nature Communications. 5, 3090(2014).</li>
<li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+GNOM+ARF-GEF+mediates+endosomal+recycling%2C+auxin+transport%2C+and+auxin-dependent+plant+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth.</a> Cell. 112 (2), 219-230 (2003).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+regulation+of+stomatal+differentiation+potential+by+EPF1+and+ERECTA-LIKE1+ligand-receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling.</a> Elife. 6, 24102(2017).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li>
<li>Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+super-resolution+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free super-resolution imaging techniques.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).</li>
<li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy%3A+Present+technology+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), (2019).</li>
<li>Nwaneshiudu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Introduction to confocal microscopy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).</li>
<li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634(2023).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

מערכת האנדוממברנה מפרידה את הציטופלסמה של התא האיקריוטי לתאים שונים, מה שמאפשר את התפקוד הביולוגי המיוחד של אברונים אלה. כדי להעביר חלבוני מטען ומקרומולקולות ליעדם הסופי בזמן הנכון, שלפוחיות רבות מונחות לעבור בין אברונים אלה. אירועי סחר בממברנות מוסדרים מאוד ממלאים תפקידים בסיסיים בכדאיות, התפתחות וצמיחה של תאים. המנגנון המסדיר את התהליך החיוני והמסובך הזה עדיין אינו מובן.
תוארו כאן מספר גישות לצפייה בלוקליזציה תת-תאית של חלבוני ממברנה, ניתוח הקו-לוקליזציה בין שני חלבוני ממברנה המתויגים בחלבונ...

תנועת ממברנות היא תהליך תאי שמור המפיץ רכיבי ממברנה (הידועים גם בשם מטענים), כולל חלבונים, שומנים ומוצרים ביולוגיים אחרים, בין אברונים שונים בתוך תא אאוקריוטי או על פני קרום הפלזמה אל החלל החוץ תאי וממנו1. תהליך זה מתאפשר על ידי אוסף של ממברנות ואברונים הנקראים מערכת האנדוממברנה, המורכבת מקרום הגרעין, הרשתית האנדופלסמית, מנגנון גולג'י, החללית / ליזוזומים, קרום הפלזמה ואנדוזומים מרובים1. מערכת האנדוממברנה מאפשרת שינוי, אריזה ושינוע של רכיבי הממברנה באמצעות שלפוחיות דינמיות העוברות בין אברונים אלה. אירועי סחר בממברנות חיוניים להתפתחות תאים, גדילה והסתגלות סביבתית, ולכן הם נמצאים תחת רגולציה מחמירה ומורכבת2. כיום, גישות רבות בביולוגיה מולקולרית, ביולוגיה כימית, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסות פותחו ויושמו בתחום הסחר בממברנות וקידמו מאוד את ההבנה של הוויסות המרחבי-זמני של מערכת האנדוממברנה 3,4. ביולוגיה מולקולרית משמשת למניפולציות גנטיות קלאסיות של שחקנים פוטנציאליים המעורבים בסחר בממברנה, כגון שינוי ביטוי הגנים של החלבון המעניין או תיוג החלבון המעניין בתגים מסוימים. כלים בביולוגיה כימית כוללים שימוש במולקולות המפריעות באופן ספציפי לתנועה של נתיבים מסוימים 4,5. ספקטרומטריית מסות היא רבת עוצמה לזיהוי הרכיבים באברון שבודד מכנית על ידי גישות ביוכימיות 3,4. עם זאת, תנועת הממברנות היא תהליך ביולוגי דינמי, מגוון ומורכב1. כדי להמחיש את תהליך הסחר בקרום בתאים חיים בתנאים שונים, מיקרוסקופ אור הוא כלי חיוני. התקדמות מתמדת נעשתה בטכניקות מיקרוסקופ מתקדמות כדי להתגבר על האתגרים במדידת היעילות, הקינטיקה והמגוון של האירועים4. כאן, מחקר זה מתמקד במתודולוגיות המקובלות בביולוגיה כימית/פרמקולוגית, ביולוגיה מולקולרית ומיקרוסקופ לחקר אירועי סחר בממברנות במערכת פשוטה ונגישה באופן טבעי, תהליך ההתפתחות הסטומטאלי.
סטומטות הן מיקרו-נקבוביות על משטחים אוויריים של צמחים שנפתחים ונסגרים כדי להקל על חילופי הגזים בין התאים הפנימיים לסביבה 6,7,8. לפיכך, הפיוניות חיוניות לפוטוסינתזה ולטרנספירציה, שני אירועים חיוניים להישרדות הצמח ולצמיחתו. התפתחות סטומטית מותאמת באופן דינמי על ידי רמזים סביבתיים כדי לייעל את הסתגלות הצמח לסביבה9. זיהוי חלבון הקולטן Too Many Mouths (TMM), שראשיתו במחקרים בשנת 2002, פתח את הדלת לעידן חדש של חקירת המנגנונים המולקולריים של התפתחות סטומטית בצמח המודל Arabidopsis thaliana10. לאחר כמה עשורים בלבד, זוהה מסלול איתות קלאסי. ממעלה הזרם אל במורד הזרם, מסלול זה כולל קבוצה של ליגנדות פפטידים מפרישים ממשפחת גורמי דפוס האפידרמיס (EFP), מספר קינאזות קולטן לאוצין עשיר בחוזר (LRR) ממשפחת EREECTA (ER), חלבון קולטן LRR TMM, מפל MAPK, וכמה גורמי שעתוק bHLH כולל SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA וצעקה (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. עבודות קודמות מצביעות על כך שאחת הקינאזות של הקולטן, ER-LIKE 1 (ERL1), מדגימה התנהגויות תת-תאיות פעילות בתפיסת EPF20. ERL2 גם נע באופן דינמי בין קרום הפלזמה לבין כמה אברונים תוך-תאיים27. חסימת שלבי תנועת הממברנות גורמת לדפוס סטומטלי לא תקין, וכתוצאה מכך נוצרים אשכולות סטומטיים על פני העלה28. תוצאות אלה מצביעות על כך שתעבורת הממברנות ממלאת תפקיד חיוני בהתפתחות סטומטלית. מחקר זה מתאר פרוטוקול לחקירה מרחבית-זמנית של דינמיקת ERL1 באמצעות ניתוח לוקליזציה תת-תאית של חלבון-חלבון בשילוב עם טיפול תרופתי באמצעות כמה מעכבי סחר בממברנה.

<table><tbody><tr><td>מזרקים 10 מ"ל</td><td>VWR</td><td>BD309695</td><td>דגימות ואקום</td></tr><tr><td>ברפלדין A (BFA)</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td>סחר בממברנה סמים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica</td><td>Lecia SP8 TCS עם חבילת תוכנה LAS-X</td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>מלקחיים לניתוח</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td>צלב גנטי</td></tr><tr><td>פיג'י</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>תוכנת עיבוד תמונה</td></tr><tr><td>Leica LAS AF Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com</td><td>עיבוד תמונה</td></tr><tr><td>זרעים טרנסגניים של ERL1-YFP</td><td></td><td></td><td>Qi, X. et al. הפעולות הרבות של פפטידי איתות על דינמיקה תת-תאית של קולטן מציינות את גורל תאי הפיוניות. אלייף. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).</td></tr><tr><td>זרעים טרנסגניים של RFP-Ara7</td><td></td><td></td><td>Ebine, K. et al. מסלול סחר ממברנה המווסת על ידי RAB GTPase ARA6 הספציפי לצמח. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).</td></tr><tr><td>Wortmannin (Wm)</td><td>Sigma</td><td>W1628</td><td>סם סחר בממברנה</td></tr></tbody></table>

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

בתאים אאוקריוטים, מרכיבי הממברנה, כולל חלבונים ושומנים, מועברים באופן מרחבי-זמני ליעדם בתוך מערכת האנדוממברנה. זה כולל הובלה הפרשה של חלבונים מסונתזים חדשים אל פני התא או אל מחוץ לתא, הובלה אנדוציטית של מטענים חוץ-תאיים או רכיבי קרום פלזמה לתוך התא, והובלה מיחזור או העברה של מטענים בין האברונים התת-תאיים וכו'. אירועי סחר בממברנות חיוניים להתפתחות, צמיחה והסתגלות סביבתית של כל התאים האיקריוטים, ולכן הם נמצאים תחת רגולציה מחמירה. קינאזות קולטן פני השטח של התא, אשר קולטות אותות ליגנד מהמרחב החוץ-תאי, עוברות הן הובלה הפרשה והן הובלה אנדוציטית. גישות נפוצות לחקר אירועי סחר בממברנות באמצעות קינאז קולטן לאוצין עשיר בחזרת פלזמה, ERL1, מתוארות כאן. הגישות כוללות הכנת חומר צמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית. כדי לעקוב אחר הוויסות המרחבי-זמני של ERL1, מחקר זה מתאר את ניתוח הלוקליזציה המשותפת בין ERL1 לבין חלבון סמן גוף רב-שלפוחיתי, RFP-Ara7, ניתוח סדרות הזמן של שני חלבונים אלה, וניתוח מחסנית z של ERL1-YFP שטופל במעכבי סחר בקרום ברפלדין A וורטמנין.

מחקר קודם הצביע על כך ש-ERL1 הוא קולטן קינאז פעיל שעובר אירועי סחר דינמיים בממברנות20. ERL1 הוא קינאז קולטן LRR טרנסממברנה על קרום הפלזמה. ERL1 מסונתז חדש ברשתית האנדופלסמית מעובד בגופי גולג'י ומועבר הלאה לקרום הפלזמה. מולקולות ERL1 על קרום הפלזמה יכולות לקלוט ליגנדות EPF באמצעות תחום LRRחוץ-תאי 18. עם הפעלתו על ידי EPF מעכבים, כולל EPF1, ERL1 מופנם לתוך אנדוזומים, מועבר לגוף הרב-שלפוחית (MVB), ולאחר מכן מועבר לתוך vacuoles עבור השפלה כדי לסיים את האות20</...

מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

טכניקה זו חוקרת את אירועי הסחר בממברנות בהתפתחות סטומטלית, את המיקרו-נקבוביות על פני השטח האוויריים של הצמח, כדי להקל על הפוטוסינתזה והטרנספירציה. טכניקות שונות משמשות לחקר התפתחות סטומטית של צמחים. זה כולל ביולוגיה מולקולרית, ביולוגיה של התא או מיקרוסקופיה, ביולוגיה כימית, ספקטרומטריית מסות, ביוכימיה וביולוגיה מבנית.פיוניות בודדות נוצרות באופן אסינכרוני. כל סטומה נוצרת על-ידי שלושה מעברי גורל תאים טרנסנדנטים. כך שאיסוף מספיק תאי שושלת פיוניות בגורל תא מסוים הוא אחד האתגרים הגדולים.סחר בממברנות חיוני להישרדות התאים ולצמיחתם. תא שושלת סטומטות אינו יוצא מן הכלל. פרוטוקול זה מתייחס לגישה הנפוצה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת הפיוניות.צמחים מתמודדים עם סביבה מאתגרת לנוכח שינויי האקלים. סטומטות הן מעברים לחילופי גזי צמחים, והן גמישות מאוד לעקה סביבתית לצורך הסתגלות. אנו מעוניינים לחקור כיצד עקה אביוטית משפיעה על התפתחות הפיוניות על-ידי התמקדות בתנועת הממברנות של חלבונים מסוימים בתאי שושלת הפיוניות.

image-based-methods-to-study-membrane-trafficking-events-stomatal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פיתחנו פרוטוקול פשוט לגשת לשחזור בתגובה הפיוניות לחיידקים לחיות. שיטה זו מקטינה ופצע ומניפולציה של העלה, לעומת השימוש קליפות אפידרמיס שדווח קודם לכן.

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

מקור: Wagner, K. et al., חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי קולטני אור של דרוזופילה באמצעות חלבונים מתויגים eGFP. J. Vis. Exp. (2022). סרטון זה מדגים את ההדמיה של סחר בחלבון ממברנה בתאי קולטני אור של דרוזופילה באמצעות חלבוני TRPL מתויגים eGFP. הוא מפרט את הכנת הזבובים הטרנסגניים להדמיה, לכידת תמונות פלואורסצנטיות של תאים קולטני אור וכימות סחר TRPL על ידי מדידת פלואורסצנטיות eGFP יחסית ברבדומרים.

חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי קולטני אור של דרוזופילה

ההשתקפות הפנימית מוחלטת המבוסס על קיטוב מיקרוסקופ פלואורסצנטי (pTIRFM) מאפשר זיהוי של דינמיקת קרום תא בזמן אמת. מאמר זה מתאר את היישום של pTIRFM לחקר שיפוץ קרום במהלך exocytosis המוסדר. הטכניקה היא להכליל לתהליכים אחרים בביולוגיה של תא באופן ישיר או עקיף כרוך בשינויים בצורת קרום.

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לפקח דינמיקת fluorescently- מתויג חלבון על משטחי תא צמח עם מיקרוסקופיה epifluorescence זווית משתנה, מראה מהבהב נקודות של PATROL1 מתויג GFP, חלבון סחר קרום, בקליפת התא של המתחם הפיוניות ב thaliana ארבידופסיס.

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

ברמה התת-תאית, אירועי איתות מווסתים באופן דינמי על ידי רמזים התפתחותיים וסביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת הביטוי החולפת של הטבק כדי לנטר אינטראקציה דינמית של חלבון-חלבון ולחשוף ארגון מרחבי של העברת אותות בתאי צמחים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

פרוטוקול זה מתאר שיטת הכנת מועשר בתאי המשמר stomatal שימושי עבור מחקרים ביולוגיים פיזיולוגיים ואחרים.

הפיוניות הקלטת-פיל: שיטה משופרת עבור הכנת הדוגמא משמר תא

מקרופינוציטוזה היא תהליך אנדוציטי שמור מאוד שהחל על ידי היווצרות של הקרנות ממברנה דמויות יריעות F-אקטין, הידועות גם בשם קפלים ממברנה. שיעור מוגבר של הפנמה מקרופינוציטוטית של מומסים היה מעורב במצבים פתולוגיים שונים. פרוטוקול זה מציג שיטה לכימות היווצרות קפלים בקרום במבחנה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

הדמיה של היווצרות קפלים בממברנה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת

מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפ ללא שימוש בקליפות אפידרמיס כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות הסטומטלית. השיטה הראשונה מדגימה כיצד לנתח פנוטיפ סטומטלי באמצעות אפידרמיס צמחי מוכתם O כחול טולוידין. השיטה השנייה מתארת כיצד לזהות ליגנדות סטומטיות ולנטר את פעילותן הביולוגית.

זיהוי הגנים המעורבים בהתפתחות סטומאטלית באמצעות ניקוד פנוטיפ אפידרמלי

פרוטוקול זה מציג שיטה השוואתית להערכת תכונות סטומטליות ואפידרמליות בשני מינים מובחנים, באמצעות פילינג אפידרמלי, טכניקות ניקוי וניתוח תמונות בעזרת בינה מלאכותית. המטרה היא לאפשר כימות בתפוקה גבוהה וניתנת לשחזור של מבנים תאיים הבסיס לתפקוד הפיוניתי ליישומים חקלאיים ולמחקר צמחי רחב.

אפיון תכונות פטיחות ואפידרמליות באמצעות פילינג, ניקוי וניתוח תמונות מבוסס בינה מלאכותית

חקור אירועי סחר בממברנות בפיתוח שומות בצמחים Arabidopsis thaliana באמצעות טכניקות דימות קונפוקליות וטיפולים פרמקולוגיים. השיטה מסייעת להבנת מנגנוני התאמה ללחות סביבתית.

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

גלה סרטונים נוספים