Name: שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום MicroSiM (μSiM) למידול מחסום הדם-מוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: חקור מודל רקמת מחסום MicroSiM לחקר מחסום הדם-מוח ותפקידו בהשפעת דלקת מערכתית על המוח. השיטה משתמשת בתאי גזע אנושיים ומאפשרת הערכת גורמים גנטיים בחולים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. ו-L.W. מומנו על ידי מענק R33 HL154249 של ה-NIH. J.L.M. מומן על ידי R44 GM137651. M.M. מומן על ידי פרס תוכנית שמידט מכון דל מונטה למדעי המוח, אוניברסיטת רוצ'סטר. M.T. מומן על ידי RF1 AG079138. K.C. מומן על ידי הקרן הבינלאומית למחקר אתי.

ניתוח מודלים של מחסום דם-מוח באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית

<ol><li>Villabona-Rueda, A., Erice, C., Pardo, C. A., Stins, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+concept+of+the+blood+brain+barrier+%28BBB%29%3A+from+a+single+static+barrier+to+a+heterogeneous+and+dynamic+relay+center%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The evolving concept of the blood brain barrier (BBB): from a single static barrier to a heterogeneous and dynamic relay center.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 405(2019).</li>
<li>Nation, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+is+an+early+biomarker+of+human+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown is an early biomarker of human cognitive dysfunction.</a> Nature Medicine. 25 (2), 270-276 (2019).</li>
<li>Ferrari, C. C., Tarelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+systemic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons+Disease%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and systemic inflammation.</a> Parkinsons Disease. 116 (3), 436813(2011).</li>
<li>Koch, E. V., Ledwig, V., Bendas, S., Reichl, S., Dietzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+barrier-on-chip%3A+a+technology+for+reproducible+practice+in+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Tissue barrier-on-chip: a technology for reproducible practice in drug testing.</a> Pharmaceutics. 14 (7), 1451(2022).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+blood-brain+barrier+dysfunction+contributes+to+multiple+sclerosis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis.</a> Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).</li>
<li>Ortiz, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+blood-brain+barrier+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Role of the blood-brain barrier in multiple sclerosis.</a> Archives of Medical Research. 45 (8), 687-697 (2014).</li>
<li>Orhun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+inflammatory+markers+and+cognitive+outcome+in+patients+with+acute+brain+dysfunction+due+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neuropsychiatry%22%5BJournal%5D)">Association between inflammatory markers and cognitive outcome in patients with acute brain dysfunction due to sepsis.</a> Archives of Neuropsychiatry. 56 (1), 63-70 (2019).</li>
<li>Chen, Y., Yang, W., Chen, F., Cui, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19+and+cognitive+impairment%3A+neuroinvasive+and+blood-brain+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">COVID-19 and cognitive impairment: neuroinvasive and blood-brain barrier dysfunction.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 222(2022).</li>
<li>Hughes, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+activation+and+blood-brain+barrier+injury+as+risk+factors+for+delirium+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial activation and blood-brain barrier injury as risk factors for delirium in critically ill patients.</a> Critical Care Medicine. 44 (9), e809-e817 (2016).</li>
<li>Saraiva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-mediated+brain+drug+delivery%3A+Overcoming+blood-brain+barrier+to+treat+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases.</a> Journal of Control Release. 235 (10), 34-47 (2016).</li>
<li>Jolliet-Riant, P., Tillement, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transfer+across+the+blood-brain+barrier+and+improvement+of+brain+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 13 (1), 16-26 (1999).</li>
<li>Abbott, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2009).</li>
<li>Siflinger-Birnboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+sieving+characteristics+of+the+cultured+endothelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer.</a> Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).</li>
<li>Bischoff, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+in+assessing+microvascular+endothelial+barrier+function%3A+impedance-based+devices+versus+the+classic+macromolecular+tracer+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Pitfalls in assessing microvascular endothelial barrier function: impedance-based devices versus the classic macromolecular tracer assay.</a> Scientific Reports. 6, 23671(2016).</li>
<li>van der Helm, M. W., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., van den Berg, A., Segerink, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-chip+technology+for+blood-brain+barrier+research%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1142493(2016).</li>
<li>Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microfluidic+models+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">In vitro microfluidic models for neurodegenerative disorders.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).</li>
<li>Girard, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+low+permeability+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+blood-brain+barrier+models+depend+on+epithelial+or+endothelial+features%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">High and low permeability of human pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models depend on epithelial or endothelial features.</a> FASEB Journal. 37 (2), e22770(2023).</li>
<li>Vigh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transendothelial+electrical+resistance+measurement+across+the+blood-brain+barrier%3A+a+critical+review+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods.</a> Micromachines. 12 (6), 685(2021).</li>
<li>Lea, T., et al. Caco-2 cell line. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLea%2C+T+%22The+Impact+of+Food+Bioactives+on+Health%3A+in+vitro+and+ex+vivo+models%22">The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models</a>. Verhoeckx, K., et al. , Cham (CH): Springer. (2015).</li>
<li>Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+are+affected+by+junctional+length+in+immature+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers.</a> Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Mossu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silicon+nanomembrane+platform+for+the+visualization+of+immune+cell+trafficking+across+the+human+blood-brain+barrier+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A silicon nanomembrane platform for the visualization of immune cell trafficking across the human blood-brain barrier under flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (3), 395-410 (2019).</li>
<li>Castro Dias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+endothelial+tricellular+junctions+as+novel+sites+for+T-cell+diapedesis+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Brain endothelial tricellular junctions as novel sites for T-cell diapedesis across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cell Science. 134 (8), jcs253880(2021).</li>
<li>Hudecz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+silicon+membranes+for+in+situ+optical+analysis+of+nanoparticle+translocation+across+a+human+blood-brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model.</a> ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).</li>
<li>Khire, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+mimetics+for+the+study+of+lukocyte-endothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microvascular mimetics for the study of lukocyte-endothelial interactions.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (2), 125-139 (2020).</li>
<li>Salminen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+apicobasal+polarity+coordinates+distinct+responses+to+luminally+versus+abluminally+delivered+TNF-alpha+in+a+microvascular+mimetic%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%3A+Quantitative+Biosciences+from+Nano+to+Macro%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell apicobasal polarity coordinates distinct responses to luminally versus abluminally delivered TNF-alpha in a microvascular mimetic.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 12 (11), 275-289 (2020).</li>
<li>DesOrmeaux, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoporous+silicon+nitride+membranes+fabricated+from+porous+nanocrystalline+silicon+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoporous silicon nitride membranes fabricated from porous nanocrystalline silicon templates.</a> Nanoscale. 6 (18), 10798-10805 (2014).</li>
<li>Hill, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+generation+nanoporous+silicon+nitride+membranes+for+high+toxin+clearance+and+small+format+hemodialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Second generation nanoporous silicon nitride membranes for high toxin clearance and small format hemodialysis.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (4), e1900750(2020).</li>
<li>Salminen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+dual-scale+nano-+and+microporous+membranes+for+vascular+transmigration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Ultrathin dual-scale nano- and microporous membranes for vascular transmigration models.</a> Small. 15 (6), e1804111(2019).</li>
<li>Gillmer, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+the+failure+of+ultrathin+porous+membranes+in+bulge+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Thin+Solid+Films%22%5BJournal%5D)">Predicting the failure of ultrathin porous membranes in bulge tests.</a> Thin Solid Films. 631, 152-160 (2017).</li>
<li>Ishimatsu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+permeability+of+ultrathin+nanopore+silicon+membrane+as+studied+using+nanofabricated+micropipet+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ion-selective permeability of ultrathin nanopore silicon membrane as studied using nanofabricated micropipet probes.</a> Analytical Chemistry. 82 (17), 7127-7134 (2010).</li>
<li>Kim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structure-permeability+relationship+of+ultrathin+nanoporous+silicon+membrane%3A+a+comparison+with+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A structure-permeability relationship of ultrathin nanoporous silicon membrane: a comparison with the nuclear envelope.</a> Journal of American Chemical Society. 130 (13), 4230-4231 (2008).</li>
<li>Snyder, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+analysis+of+molecular+separations+by+diffusion+through+ultrathin+nanoporous+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Science%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes.</a> Journal of Membrane Science. 369 (1-2), 119-129 (2011).</li>
<li>McCloskey, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modular+%C2%B5SiM%3A+a+mass+produced%2C+rapidly+assembled%2C+and+reconfigurable+platform+for+the+study+of+barrier+tissue+models+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">The modular µSiM: a mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (18), e2200804(2022).</li>
<li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modular+microSiM+reconfigured%3A+integration+of+microfluidic+capabilities+to+study+in+vitro+barrier+tissue+models+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">The modular microSiM reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (21), e2200802(2022).</li>
<li>Su, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue+chip+with+integrated+digital+immunosensors%3A+In+situ+brain+endothelial+barrier+cytokine+secretion+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A tissue chip with integrated digital immunosensors: In situ brain endothelial barrier cytokine secretion monitoring.</a> Biosensors and Bioelectronics. 224, 115030(2023).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100563(2021).</li>
<li>Hudecz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+silicon+membranes+for+in+situ+optical+analysis+of+nanoparticle+translocation+across+a+human+blood-brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model.</a> ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).</li>
<li>Gastfriend, B. D., Stebbins, M. J., Du, F., Shusta, E. V., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+brain+pericyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of brain pericyte-like cells from human pluripotent stem cell-derived neural crest.</a> Current Protocols. 1 (1), e21(2021).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+blood-brain+barrier+models+for+studying+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions.</a> FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).</li>
<li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li>
<li>Bechmann, I., Galea, I., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+blood-brain+barrier+%28not%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">What is the blood-brain barrier (not).</a> Trends in Immunology. 28 (1), 5-11 (2007).</li>
</ol>

J.L.M. הוא מייסד שותף של SiMPore ומחזיק במניות בחברה. SiMPore מסחור טכנולוגיות מבוססות סיליקון דק במיוחד, כולל הממברנות המשמשות במחקר זה.

בעוד שבבי הממברנה תוכננו ליציבות, הם יכולים להיסדק או להישבר אם מטפלים בהם בצורה לא נכונה במהלך ההרכבה. לכן, קריטי לאחוז את השבב בחריצי פינצטה השבב ולמקם אותו בעדינות בגוף התאורה. בעת טיפול במכשירים באופן כללי, יש לנקוט משנה זהירות שלא להקפיץ או להפיל את המכשירים. במהלך החיבור של שבב הממברנה למתקן A1, השבב חייב להיות מונח שטוח וממורכז על עמוד המתקן A1 כדי למנוע סדקים בקרום במהלך החיבור לרכיב 1. יתר על כן, יש להימנע מכל מגע עם שכבות ה- PSA החשופות לאחר הסרת מסכות המגן. בעת הטיפול ברכיב 2 לאחר הסרת מסכות המגן, רצוי להחזיק אותו לאורך קצה הרכיב ולהשתמש בפינצטה כדי לתפוס את פינת המשולש שהיא נטולת PSA.
בעוד פרוטוקולים של תרביות תאים תוארו עבור מודלים אפשריים של BBB, מודל התרבית המשותפת BMEC/pericyte של BBB המתואר כאן עשוי להיות מספיק או לא מספיק בהתאם להקשר הפיזיולוגי ולשאלות המעניינות. לדוגמה, סחר בתאי מערכת החיסון מתרחש בעיקר בוורידים הפוסט-נימיים של המוח41,42. באזורים אלה, מרחב פריווסקולרי מפריד בין מחסום BMEC/פריציטים לבין גבולות הגליה שנוצרו על ידי אסטרוציטים. לפיכך, בוורידים פוסט-נימיים, היחידה הנוירו-וסקולרית (NVU) מורכבת משני מחסומים מופרדים פיזית בסדרה, וכפות רגליים אסטרוציטיות אינן נוגעות ישירות במחסום הדם BMEC/פריציטים, המיוצג היטב על ידי המודל הנוכחי. אם המטרה היא מודל NVU שלוקח בחשבון את ההשפעה של גורמים המופרשים על ידי אסטרוציטים על מחסום הדם, ניתן להוסיף תא אסטרוציטים למכשיר המאפשר חילופי גורמים מסיסים דרך החלל הפריווסקולרי. דוגמה זו הודגמה בעבר34 וניתן להרחיב אותה כך שתכלול תאים אחרים כגון מיקרוגליה ונוירונים בתא "מוח" תלת-ממדי. הארכיטקטורה המודולרית של הפלטפורמה מאפשרת להשתמש באסטרטגיות הרכבה פשוטות כדי להשיג תצורות מחדש אלה, כך שהפלטפורמה תהיה פשוטה או מורכבת ככל שיידרש כדי לענות על ההשערות העומדות על הפרק. כל מערך תרבית תאים; עם זאת, חייב להיות מותאם עבור קווי תאים חדשים ותרבויות מרובות. לדוגמה, בשל התכונות של ממברנות סיליקון-ניטריד, ייתכן שיהיה צורך להתאים את פתרונות הציפוי בהשוואה ללוחות תרבית רקמות. הכללת פיברונקטין מסייעת בדרך כלל בהתקשרות תאים ובהישרדותם. יתר על כן, משתמשים יכלו לגדל תאי אנדותל ופריציטים בכיוונים מנוגדים. במקרה זה, ייתכן שיהיה צורך לשנות, למשל, את האופן שבו מדידות החדירות נעשות ומפורשות. עם זאת, מתן צעדים לסוג זה של תרבות הוא מעבר להיקף של מאמר זה.
אתגר נוסף שניתן להיתקל בו במהלך תרבית תאים הוא אידוי מהיר של מדיה, שכן המכשירים יכולים להיות רגישים יותר לשינויים בסביבה בהשוואה לצלחות וצלוחיות סטנדרטיות של תרביות רקמה. אם רואים אידוי עודף או מאטים את גדילת התא, יש למדוד את כל הפרמטרים הקריטיים של האינקובטור כדי להבטיח הגדרות מדויקות. ניתן להוסיף יותר מים לפקק הרקמה או לצלוחית פטרי קטנה הממוקמת בתוך תא תרבית התא, או להחליף מדיה בתדירות גבוהה יותר. יתר על כן, בועות יכולות להיכנס לערוץ התחתון ולהיתקע בתעלה עבור מכשירי תעלות. אמנם ניתן להסיר אותם, אך הכי קל להימנע מהוספת בועות מלכתחילה. כדי לעשות זאת, חשוב לבדוק כי אין בועות בקצה פיפטה או אוויר בקצה פיפטה קצה פיפטה לפני pipeting מדיה לתוך החדר התחתון. יתר על כן, אידוי מדיה בערוץ יכול להוביל לפער בין משטח המדיה לבין ראש הנמל. נפח קטן של מדיה יכול להיות מפוצץ לתוך יציאה אחת עד שהמדיה מגיעה לפני השטח של היציאה הנגדית, ולאחר מכן ניתן להחליף את המדיה באותה יציאה נגדית. בעוד hECSR ו E6 + 10% FBS מדיה לא צריך להיות מחומם באמבט המים, מדיה אחרת ניתן לחמם מראש כדי להפחית היווצרות בועות. אם בועה אכן נכנסת לתא התחתון, ניתן להסיר אותה על ידי הזרמה מהירה של 100 μL דרך התעלה. עם זאת, שיטה זו עלולה להוביל לזיהום בין תאים או מדיה שנשפכים על פני השטח של המכשיר. זה עלול גם לשבש את שכבות התא. לחלופין, ניתן להסיר תחילה את המדיה מהערוץ ולאחר מכן להציג אותה מחדש בנפח של 50 μL. עם זאת, הסרת המדיה תחילה עלולה לגרום להיווצרות בועות נוספות בערוץ. אם בועה אינה נמצאת ישירות מתחת לאזור הממברנה, ניתן להשאיר אותה בתעלה ללא השפעה על תרבית תאים.
התקשרות וגדילה של פריציט, כפי שמודגם באיור 2, יכולות להיות מאתגרות. שימוש בצפיפות זריעה אופטימלית חיוני ליצירת שכבה עם יחס מתאים פיזיולוגית בין תאי פריציט לאנדותל. יתר על כן, כמו pericytes רגישים גזירה, כל חילופי התקשורת בערוץ צריך להיעשות לאט מאוד כדי להגן על התאים. עבור תרבית BPLC, חיבור משופר יכול להיות מושג על ידי ציפוי התא התחתון עם 800 מיקרוגרם / מ"ל קולגן סוג IV או 100 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין .
אימונוציטוכימיה במכשירים המתוארים כאן מאפשרת ניתוח איכותני של בריאות התא ותפקודו. שיטות להכתמה בצלחות תרבית רקמה או פלטפורמות אחרות צריכות להיות ניתנות לתרגום ישיר לפלטפורמה. עבור תרבית תאים רק בתא העליון, לאחר קיבוע, PBS ניתן להוסיף לתוך החדר התחתון ולהשאיר לשלבים הנותרים, עם חסימה וצביעה נעשה בתא העליון בלבד. זה ממזער את הסיכונים של שבירת הממברנות או מקבל בועות לתוך החדר התחתון. לצביעת תרבית משותפת, אנו ממליצים להשתמש בשני התאים בכל השלבים. חשוב לציין כי צמיגות הקיבוע וה- PBS שונה מזו של המדיה. לכן, זה יכול להיות קל יותר להוסיף בועות לתוך החדר התחתון, ויש לנקוט משנה זהירות כדי לבדוק את קצות פיפטה עבור אוויר בקצה הקצה לפני pipeting לתוך החדר התחתון.
הפרוטוקול המתואר עבור בדיקת חדירות המולקולות הקטנות מאפשר הערכה פונקציונלית וכמותית של תפקוד המחסום של תאי האנדותל בתרבית במכשיר μSiM. בעיה אחת שעשויה להיתקל במהלך בדיקה זו היא משיכת בועות אוויר לתוך פיפטה במהלך איסוף הדגימה מהערוץ התחתון בשלב פרוטוקול 4.1.7.4. כדי להימנע מבעיה זו, חשוב לוודא שהקצה אטום ליציאה לפני תחילת איסוף הדגימה ואין לשאוב את הדגימה מהר מדי. אם פעולה זו אינה פותרת את הבעיה, גודל הקצוות שבהם נעשה שימוש עשוי להיות קטן מדי או גדול מדי מכדי להתאים ליציאות; השתמש בעצות המפורטות בטבלת החומרים. אם ערכי חדירות גבוהים באופן בלתי צפוי נמדדים למרות חד-שכבה קונפלואנטית בריאה למראה, יש לבדוק את שלמות החד-שכבה לאיתור הפרעה במהלך איסוף הדגימה. אנו ממליצים תמיד לבדוק את החד-שכבה מתחת למיקרוסקופ מיד לאחר איסוף הדגימה. אם השכבה החד-שכבתית עדיין נראית שלמה ובריאה, ניתן לתקן את הדגימה ולהעריך סמנים ביולוגיים של תפקוד המחסום, למשל, באמצעות אימונוסטיין של חלבוני הצומת. לעומת זאת, אם נמדדים ערכי חדירות נמוכים באופן בלתי צפוי, חשוב לוודא כי 50 μL של מדיה נדגמים מהערוץ התחתון ללא בועות אוויר. אם התווך יוצא מפתח הדגימה מיד עם מיקום קצה המאגר, יש לאסוף מדיה זו לפני התאמת הפיפטה לפתח הדגימה מכיוון שרוב המולקולה הקטנה הפלואורסצנטית תהיה נוכחת בנפח הראשוני של 10 μL שנדגם מהתעלה התחתונה. ציור עיגולים סביב היציאות באמצעות עט הידרופובי או הנחת סרט הידרופובי עם חור סביב היציאה מונע התפשטות של מדיה שאובה פסיבית. אם הבועות נמשכות במהלך הדגימה או אם הדגימה המלאה של 50 μL אינה מוסרת, אין להשתמש בדגימה. לחלופין, ניתן לקבוע את הנפח המדויק ולהשתמש בו בחישוב החדירות; עם זאת, זה צריך להיעשות רק אם נפח הוסר הוא ≥40 μL, אשר מתאים ~ 98-99% התאוששות צבע34.

רקמות חיות ממודרות על ידי תאים מיוחדים היוצרים ומתחזקים מחסומים ומווסתים אילו תאים ומולקולות מועברים מתא אחד למשנהו. ויסות לא תקין של תפקודי מחסום יכול להיות המקור הן למחלות חריפות והן למחלות כרוניות. מחסום הדם-מוח (BBB) הוא מחסום הרקמה המגביל ביותר בגוף האדם1. תפקוד לקוי של BBB עומד בבסיס מגוון רחב של מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), כולל מחלת אלצהיימר2, מחלת פרקינסון3,4, וטרשת נפוצה 5,6. פגיעה ב- BBB קשורה גם לפגיעה קוגניטיבית ארוכת טווח כתוצאה של הפרעות אקוטיות, כגון אלח דם7, COVID-198 והזיה9 לאחר הניתוח. הפיתוח של תרופות בעלות פוטנציאל לטיפול בהפרעות מוחיות היה קשה באופן מתסכל בגלל האתגר של פריצה מכוונת של מחסום הדם-מוח כדי לספק מולקולות ביו-אקטיביות למטרות במוח10. מסיבות אלה, שיטות לחקר תפקוד BBB במבחנה הן בעלות חשיבות עליונה להבנה וטיפול במחלות של מערכת העצבים המרכזית.
השיטות הבסיסיות למדידת תפקוד מחסום במבחנה כוללות הקמת חד-שכבה או תרבית משותפת על קרום חדיר למחצה ומדידת העמידות שמקנים התאים לדיפוזיה של מולקולות קטנות או לזרמים חשמליים קטנים11,12,13,14. בעוד הופעתן של מערכות מיקרופיזיולוגיות (MPS) הניבה שפע של אפשרויות למידול BBB בתלת-ממד15,16, המגוון של גיאומטריות המערכת מקשה על השוואת מדידות חדירות בין MPS או לערכי ספרות מבוססים. קביעת ערכי בסיס מהימנים חשובה במיוחד במחקר BBB שבו, בגלל ויסות המחסום הנרחב על ידי תאי אנדותל כלי דם במוח, ערכי חדירות במבחנה נבדקים היטב12,17,18. מסיבות אלה, מדידות חדירות על פני חד-שכבות שהוקמו על ממברנות דו-ממדיות יישארו מצרך עיקרי במחקרי BBB במשך שנים רבות. זה נכון לגבי מחסומי רקמות אחרים, כולל מחסומי אפיתל, שבהם ערכים מוחלטים של חדירות בסיסית משמשים כדי לאמת ולהשוות מודלים במבחנה 19,20,21.
במטרה להקים כלי חדש ובעל ערך עבור קהילת המחקר BBB, הצגנו22 וקידמנו 23,24,25,26 את מכשיר המיקרוהכולל פלטפורמת silicon membrane (μSiM) לשימוש במידול רקמת מחסום במהלך 5 השנים האחרונות. התכונה המאפשרת של הפלטפורמה היא קרום דק במיוחד (<100 ננומטר) עם מאות מיליוני ננו-נקבוביות 27,28 או תערובת של ננו-נקבוביות ומיקרו-נקבוביות29. שבבי הממברנה העצמאיים מיוצרים על 'שבב' סיליקון של 300 מיקרומטר המייצב את המבנים האולטרה-דקים30 ומאפשר לטפל בהם בפינצטה להרכבת מכשירים. בגלל אופיים האולטרה-דק, לממברנות יש חדירות גבוהה בשני סדרי גודל מזו של ממברנות רגילות חרוטות מסילה המשמשות בהתקני תרבית ממברנות מסחריים31,32. בפועל, משמעות הדבר היא שההפרעה של הממברנה לפיזור מולקולות קטנות מהננו-נקבוביות (<60 ננומטר) היא זניחה33. לכן, עבור מחסומים תאיים, רק התאים והמטריצות שהם מפקידים יקבעו את קצב המעבר של מולקולות קטנות מהתאים האפיקליים לתאי הבסיס המופרדים על ידי הממברנה34. עיצוב המכשיר והאופי האולטרה-דק של הממברנות מספקים גם יתרונות רבים למיקרוסקופיה אופטית. אלה כוללים 1) היכולת לעקוב אחר תרביות חיות באמצעות ניגודיות פאזה או הדמיית שדה בהיר, 2) היכולת להכתים ולצלם באופן פלואורסצנטי באתרו ללא צורך לחלץ ולהעביר את הממברנה לזכוכית כיסוי, ו -3) העובדה שהממברנות דקות יותר מ"פרוסות" קונפוקליות, כך שלתרביות משותפות ישירות יש מרווח טבעי יותר בין סוגי תאים מאשר ניתן להשיג עם ממברנות עקובות בעובי 6-10 מיקרומטר.
לאחרונה, קידמנו את הפלטפורמה לפורמט מודולרי כדי להקל על הרכבה מהירה34 והתאמה אישית35,36. מינפנו את הפורמט המודולרי כדי להפיץ רכיבי התקנים בין ההנדסה הביולוגית שלנו לבין מעבדות מחסום המוח המשתפות פעולה. לאחר מכן פיתחנו במשותף פרוטוקולים להרכבת מכשירים, מונוקולטורה ותרבית משותפת, צביעה אימונופלואורסצנטית וחדירות מולקולות קטנות והראינו ששיטות אלה ניתנות לשחזור בין מעבדות. באמצעות פרוטוקולים אלה, הראינו גם כי הפלטפורמה המודולרית תומכת ב-BBB מאומת שפותח באמצעות שיטת תרבית אנדותל מורחבת (EECM) ליצירת תאי אנדותל דמויי כלי דם במוח (BMEC) מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs)37. מטרת הדו"ח הנוכחי היא לסקור שיטות אלה בפירוט רב יותר, ובעזרת הסרטון הנלווה, לאפשר אימוץ רחב יותר של הפלטפורמה בקהילת BBB.

<table><tbody><tr><td><נוגדנים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31 נוגדן פוליקלונלי</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>PA5-32321</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן IgG לעכבר קלודין-5, 4C3C2</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>עז ואלפא;-עכבר IgG Alexa Fluor 488</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>עז ואלפא;-ארנב IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>NG2, עכבר IgG2a, 9.2.27</td><td>Millipore</td><td>&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>MAB2029 נוגדן IgG של עכבר אוקלודין, OC-3F10</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta;, נוגדן IgG של ארנב, טכנולוגיית</td><td>איתות תאים</td> 28E1 <td>3169</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin עכבר IgG2B שיבוט # 123413</td><td>R& D Systems</td><td>MAB9381</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 ארנב נוגדן IgG, פוליקלונלי</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td><חזק>כימיקלים, פפטידים וחלבונים רקומביננטיים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% מתנול</td><td>VWR</td><td>101443-718</td><td>ניתן להחליף במוצרים דומים</td></tr><tr><td>16% פרפורמלדהיד</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>28908</td><td>ניתן להחליף במוצרים דומים</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>תוסף תזונה Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>קולגן IV משליה אנושית</td><td>קולגן Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr>, <tr><td>תמיסה מסוג I מזנב עכברוש</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>ניתן להחליף במוצרים דומים</td></tr><tr><td>DMEM/Ham' s F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 צמיחת תאי אנדותל Medium-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6</td><td>medium Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Peak Serum</td><td>PS-FB1</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin מפלזמת בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין חלבון אנושי, פלזמה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>ניתן להחליף במוצרים דומים</td></tr><tr><td>hESFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH מלח דיליתיום</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861502</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>500627</td><td>ניתן להחליף במוצרים דומים</td></tr><tr><td>PBS ללא סידן, מגנזיום</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>ניתן להחליף במוצרים דומים</td></tr><tr><td>Pericyte Medium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td>השתמש בערכה מלאה (כולל תוספי מזון)</td></tr> <tr><td>פולי-L-ליזין, 10 מ"ג/מ"ל</td><td>ScienCell</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT Baker</td><td>X198-05</td><td>ניתן להחליף במוצרים דומים</td></tr><tr><td>מים מזוקקים ללא DNase/RNase UltraPure</td><td>Invitrogen ומסחר;</td><td></td><td>10977015 ניתן להחליף במוצרים דומים</td></tr> <tr><td><מודלים חזקים>ניסיוניים: קווי תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחסום דם-מוח hCMEC/D3 קו תאים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>פריציטים כלי דם במוח האנושי</td><td>ScienCell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים</td><td>WiCell</td><td>RRID:CVCL_C437</td><td></td></tr><tr><td><חזק>כלי זכוכית וכלי פלסטיק</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 מ"מ צלחת תרבית תאים מטופלת TC עם 20 מ"מ</td><td>מהדקי פלקון</td><td>353025</td><td></td>רשת</tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>MFLX06832-10</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית רקמות קורנינג (6 בארות)</td><td>קורנינג</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>שטוח 96 בארות מיקרו-פלטות לא מחייבות</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מכשיר שקופיות מיקרוסקופ</td><td>&nbsp; SiMPore</td><td>USIM-SB</td><td>מידות תואמות למחזיקי שקופיות מיקרופסקופ</td></tr><tr><td>Nunc 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים</td><td>תרמו פישר 339651</td><td></td><td></td>מדעי</tr><tr><td>Nunc 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים</td> ניתן למלא מכסי צינור <td>339653 תרמו פישר מדעי</td><td></td><td>במים לתרבית תאים</td></tr><tr><td>P20-200 קצות פיפטה</td><td>VWR</td><td>76322-516</td><td>מותגים חלופיים עשויים שלא לאטום באותה יעילות ליציאות</td></tr><tr><td>מסנני Transwell (12 באר, 12 מ"מ, 0.4 &mu; m גודל נקבוביות, PC)</td><td>CoStar</td><td>3401</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Objective (עבור אנדור)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD00105</td><td>אוויר; WD: 4 מ"מ; NA 0.45</td></tr><tr><td>10X Objective (עבור Nikon)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRP40102</td><td>אוויר; WD: 6.2 מ"מ; NA 0.25</td></tr><tr><td>40X Objective (LWD) (עבור אנדור)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD77410</td><td>טבילה במים; WD: 590-610 מ"מ; NA 1.15</td></tr><tr><td>אנדור דיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אוקספורד אינסטרומנטס, אנדור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ניקון אקליפס Ts2 מיקרוסקופ ניגודיות פאזה</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>ניתן להחליף במוצרים דומים</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td>ניתן להחליף במוצרים דומים</td></tr><tr><td><חזק>אחר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתקדם PAP Pen</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z672548</td><td>קצה 2 מ"מ מומלץ</td></tr><tr><td>ערכת הרכבה עם מתקנים</td><td>SiMPore</td><td>USIM-JIGSET</td><td>כולל קיבוע A1, A2, B1 ו-B2</td></tr><tr><td>מתאם מצלמה למיקרוסקופים</td><td>AmScope</td><td>CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR</td> <td>&Phi; 23.2 - &Phi; מתאם 30 מתאים ל-Nikon Eclipse Ts2</td></tr><tr><td>Canon EOS Rebel SL3 DSLR מצלמה</td><td>Canon</td><td>EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001</td><td>ניתן להחליף במוצרים דומים</td></tr><tr><td>מסננת תאים, 40 ומיקרו; m</td><td>Millipore Sigma (Corning)</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>רכיב 1</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C1</td><td></td></tr><tr><td>רכיב 2</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C2</td><td></td></tr><tr><td>שבבי ממברנה</td><td>SiMPore</td><td>NPSN100-1L</td><td>פורמטים אחרים של שבבים זמינים</td></tr><tr><td>SMD טיפול בפינצטה זווית כפולה</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW003</td> <td>"פינצטת שבבים"</td></tr> <tr><td>אל חלד פינצטה מסוג דיוק פלדה GG</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW534</td> <td>"פינצטה ישרה"</td></tr><tr><td><חזק>תוכנה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>לעיבוד תמונה</td></tr><tr><td>Fusion</td><td>Oxford Instruments, Andor</td><td></td><td>הוראות לגרסה 2.3.0.44</td></tr><tr><td>i-control</td><td>TECAN</td><td></td><td>הוראות לגרסה 2.0</td></tr><tr><td>אימאריס</td><td>אוקספורד אינסטרומנטס</td><td></td><td>לעיבוד תמונה. הוראות לגרסה 9.9.0</td></tr></tbody></table>

שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום microsim (μsim) למידול מחסום הדם-מוח

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

ה-microSiM (μSiM) היא פלטפורמת תרבית מבוססת קרום למידול מחסום הדם-מוח (BBB). שלא כמו פלטפורמות קונבנציונליות מבוססות ממברנה, μSiM מספק לנסיינים יכולות חדשות, כולל דימות תאים חיים, איתות פרקריני ללא הפרעה בין חדרי 'דם' ו'מוח', והיכולת לדמות ישירות אימונופלואורסצנטיות ללא צורך בחילוץ / הרכבה מחדש של ממברנות. כאן אנו מדגימים את השימוש הבסיסי בפלטפורמה כדי לבסס מודלים של מונוקולטורה (תאי אנדותל) ותרבית משותפת (תאי אנדותל ופריציטים) של BBB באמצעות ממברנות סיליקון-ניטריד ננו-נקבוביות אולטרה-דקות. אנו מדגימים תאימות הן עם תרביות תאים ראשוניות והן עם תרביות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC). אנו מספקים שיטות לניתוח איכותני של מודלים של BBB באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית ומדגימים את השימוש ב- μSiM להערכה כמותית של תפקוד מחסום בבדיקת חדירות של מולקולה קטנה. השיטות המסופקות אמורות לאפשר למשתמשים לבסס את מודלי המחסום שלהם על הפלטפורמה, ולקדם את השימוש בטכנולוגיית שבבי רקמות לחקר רקמות אנושיות.

ההרכבה של התקן תעלות למטה מוצגת באיור 1. גופי התאורה מנחים את הרכבת הרכיבים ואת שבב הממברנה. רכיב 1 הוא בעיקר אקריליק עם משטח PSA לחיבור לשבב ופתח לתא התחתון ויציאות לגישה לצנרת לתא התחתון. רכיב 2 הוא שכבת הערוץ ומכיל "משולש" לא דביק, ללא PSA בפינה הימנית העליונה לאחיזה. התקני תעלות למטה מספקים אזור גידול תרבית תאים שטוחה בתא העליון, בעוד שלמכשירי תעלה יש משטח שטוח לתרבית תאים בתא התחתון.
ביצענו מונוקולטורות אנדותל ותרביות משותפות של hCMEC/D3 ו-HBVPs ושל תאים דמויי BPLC שמקורם ב-hiPSC IMR90-4 ורכשנו תמונות פאזה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה Nikon Eclipse Ts2 ומטרה 10x (איור 2). צפיפות זריעה אופטימלית עבור תרבית תאים ראשונית מוצגת (תמונות שצולמו יום אחד לאחר הזריעה), כמו גם HBVPs עם תת-זרעים (איור 2A). תמונות סופיות של שלב החקלאות המשותפת והמונוקולטורה (6 ימים של תרבית תאי אנדותל) יכולות להיות קשות להבחנה (איור 2C), ואישור של תרבית משותפת ראשונית מוצלחת עשוי לדרוש צביעה אימונופלואורסצנטית (ראו פרוטוקול סעיף 3). מודגמות גם צפיפות זריעת BPLC נמוכה, גבוהה ואופטימלית שמקורה ב-hiPSC (איור 2B). ברור יותר להבחין בתרביות משותפות שמקורן ב-hiPSC בדימות ניגודיות פאזה בהשוואה לתרביות משותפות ראשוניות (איור 2D). זריעה נמוכה של BPLC גורמת לכיסוי פריציטים לקוי ולהתגבשות פריציטים, בעוד שזריעה גורמת לשכבת הפריציטים להתקלף מהממברנה. יתר על כן, החלפת המדיום בחדר התחתון מהר מדי עלולה לגרום לאובדן פריציט, שכן תאים אלה רגישים מאוד לגזירה. כיסוי אופטימלי על ידי פריציטים הוא ~90% עבור מודל BBB, ללא רווחים בשכבת האנדותל.
תמונות מייצגות של תרבית משותפת שמקורה ב-hiPSC ממערכת החיסון מודגמות באיור 3 (6 ימים של תרבית תאי אנדותל). BPLCs שמקורם ב-IMR90-4 הוכתמו עבור סמן הפריציטים PDGFRβ, ותאים דמויי EECM-BMEC שמקורם ב-IMR90-4 הוכתמו עבור סמן צומת הדבקים VE-cadherin. הוכסט שימש להכתמת הגרעינים. התמונות נרכשו במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב באמצעות מטרה LWD 40x עם פרוסות 0.2 מיקרומטר ועובדו עם Imaris. ניתן להמחיש את שתי שכבות התא למרות שהננומברנה הדקה אינה נראית.
ביצענו את בדיקת החדירות של מולקולות קטנות המבוססת על דגימה תוך שימוש באותם תנאי ניסוי בשתי מעבדות מרוחקות פיזית באוניברסיטת ברן, שוויץ, ובאוניברסיטת רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב כדי להדגים שחזור בין-מעבדתי של תוצאות (איור 4)34. תאים דמויי EECM-BMEC שמקורם ב-hiPSC IMR90-4 גודלו בתרבית במכשיר μSiM במשך 2, 4 או 6 ימים ובמסנני transwell במשך 6 ימים. הבדיקה בוצעה באמצעות 150 מיקרוגרם / מ"ל לוציפר צהוב (457 Da) בשתי המעבדות. שונות גבוהה בחדירות תאי האנדותל שגודלו בתרבית במשך יומיים במכשיר מצביעה על כך שיומיים של תרבית לא הספיקו להבשלת המחסום. לא נמצאו הבדלים משמעותיים בחדירות בין המעבדות עם הבשלת המחסום - מ-4 ימים ואילך. הראינו גם כי החדירות של תאי אנדותל שגודלו בתרבית במסנני μSiM וטרנסוול במשך 6 ימים תאמה את אלה שפורסמו קודם לכן40.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig01.jpg"> איור 1: שלבים של הרכבת μSiM . (A) הכינו את השבב על ידי הנחתו על מתקן A1. מקם את תעלת השבב למעלה להתקן תעלות סופי. הניחו את תעלת השבב למטה להתקן תעלה סופי. (B) הצמידו את רכיב 1 לשבב על-ידי הסרת מסכות המגן מרכיב 1 והצבתן עם הפנים כלפי מטה לתוך FA1. קשר על ידי הפעלת לחץ עם מתקן A2. (ג) קשר רכיב 2 ורכיב 1 על ידי הסרת רכיב 2 מהיריעה וקילוף שכבות ההגנה העליונות. מקם את התעלה במתקן B1 והנח את רכיב 1 על גבי רכיב 2 כשפניו כלפי מעלה. קשר על ידי הפעלת לחץ עם מתקן B2. קיצורים: FAn = fixture An; FBn = מתקן Bn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig02.jpg"> איור 2: סכמטיות של תרבות משותפת ותמונות ניגודיות פאזה מייצגת של תרביות תאים בהתקנים. (A) מיקום של זריעת תאי פריציטים ואנדותל. (B) סכמה צדדית של מיקומי תאים על פני התעלה של שבב הממברנה. (C) תמונות מייצגות של צפיפות זריעה נמוכה ואופטימלית עבור HBVP ראשוני וקו תאי אנדותל מוח hCMEC/D3. התמונות נרכשו יום אחד לאחר הזריעה (HBVP) ושעתיים לאחר הזריעה (hCMEC/D3). (D) תמונות מייצגות של צפיפויות זריעה נמוכות, גבוהות ואופטימליות עבור תאים דמויי פריציטים במוח שמקורם ב-hiPSC. התמונות נרכשו יום אחד לאחר הזריעה. (E) תמונות מייצגות של התרבות המשותפת הסופית HBVP ו-hCMEC/D3 ומונוקולטורה של hCMEC/D3. התמונות נרכשו 8 ימים לאחר זריעת HBVP ו-7 ימים לאחר זריעת hCMEC/D3. (F) תמונות מייצגות של תרבית תאים כושלת ומוצלחת דמוית BPLC ו-EECM-BMEC ומונוקולטורה של תאים דמויי EECM-BMEC. התמונות נרכשו 7 ימים לאחר זריעת BPLC ו-6 ימים לאחר זריעת EECM-BMAC. תרבויות BPLC חסרות זרע אינן מצליחות לקבל כיסוי מספיק, בעוד שתרבויות BPLC מפקחות יגדלו בזרם יתר ויתחילו להתגבש/לסגת. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (C-F). קיצורים: HBVPs = פריציטים וסקולריים במוח האדם; hiPSC = תא גזע פלוריפוטנטי המושרה על ידי אדם; BPLCs = תאים דמויי פריציטים במוח שמקורם ב-hiPSC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig03.jpg"> איור 3: תמונות מייצגות של תרבית תאי hiPSC המוכתמים במערכת החיסון בהתקנים. התאים הוכתמו עבור סמן תאי אנדותל VE-cadherin (ירוק), סמן pericyte PDGFRβ (אדום), וכתם גרעיני (כחול). ניתן לראות שתי שכבות של תאים בסמיכות, המופרדות רק על ידי ננוממברנה דקה של סיליקון-ניטריד (חץ לבן מסמן את מיקום הממברנה בתמונה השמאלית). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: hiPSC = תא גזע פלוריפוטנטי המושרה על ידי אדם; PDGFRβ = בטא קולטן גורם גדילה הנגזר מטסיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig04.jpg"> איור 4: בדיקת חדירות מולקולות קטנות המבוססת על דגימה. (A) סכמטי של זרימת העבודה הניסויית. (B) הדגמה של יכולת השחזור הבין-מעבדתית בין שתי מעבדות מרוחקות פיזית באוניברסיטת ברן (UniBe), שוויץ, ובאוניברסיטת רוצ'סטר (UR), ניו יורק, ארה"ב: תאי אנדותל שמקורם ב-hiPSC גודלו בתרבית במכשיר μSiM במשך 2, 4 או 6 ימים ובמסנני transwell במשך 6 ימים. בדיקת החדירות בוצעה באמצעות 150 מיקרוגרם / מ"ל לוציפר צהוב (457 Da). הסרגל האדום מציין את נתוני החדירות של נתרן פלואורסצאין (376 Da) שפורסמו בעבר של אותם תאי אנדותל שמקורם ב-hiPSC שגודלו בתרבית במשך 6 ימים במסנני טרנסוול40. N = 4-16 לקבוצה. נעשה שימוש ב-ANOVA דו-כיווני עם מבחן פוסט-הוק של Tukey, והשוואות הוצגו רק עבור p &lt; 0.05 רלוונטי. (C) הדגמה של תגובת ציטוקינים באמצעות תאים דמויי EECM-BMEC שמקורם ב-hiPSC בתרבית ב-μSiM במשך יומיים; 0.1 ננוגרם/מ"ל TNFα + 2 IU/מ"ל IFNγ) או בקרת מדיה (לא מגורה, NS) נוספה לתא העליון למשך 20 שעות לפני בדיקת החדירות באמצעות 150 מיקרוגרם/מ"ל לוציפר צהוב. N = 3 לכל קבוצה. מבחן T לתלמיד, עמ' &lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שטח פנים זריעה של תא עליון</td>
			<td>נפח באר עליון</td>
			<td>שטח פנים של זריעה בתא התחתון</td>
			<td>עוצמת ערוץ תחתונה</td>
		</tr><tr><td>~37 מ"מ2</td>
			<td>100 μL (יכול להכיל ≥115 μL)</td>
			<td>~42 מ"מ2</td>
			<td>10 μL (פיפט 20 μL למניעת בועות)</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: שטח פנים ונפחים קריטיים של μSiM.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>יעד</td>
			<td>קיבוע</td>
			<td>פתרון חסימה</td>
			<td>דילול</td>
		</tr><tr><td>VE-cadherin</td>
			<td>4% PFA או 100% MeOH</td>
			<td>5% GS + 0.4% Tx-100 או 10% GS + 0.3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>4% PFA או 100% MeOH</td>
			<td>5% GS + 0.3-0.4% טריטון X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>קלודין-5</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0.3% טריטון X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>ZO-1</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0.3% טריטון X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>אוקלודין</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0.3% טריטון X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>PDGFRβ</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5% GS + 0.4% טריטון X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>NG2</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5% GS + 0.4% טריטון X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>עז α-עכבר IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>עז α עכבר IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: נוגדנים ושיטות צביעה שאומתו עבור אימונוציטוכימיה של תרבית משותפת במכשירי μSiM. קיצורים: PFA = paraformaldehyde; MeOH = מתנול; GS = סרום עיזים.
קובץ משלים 1: תבנית לחישוב ערך חדירות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258_SupplementalFile_SamplingCalcTemplate_Updated.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

דוח זה מספק פרוטוקולים להרכבה, תרבית תאים ובדיקות על פלטפורמת μSiM לבניית מודלים של מחסום דם-מוח.

שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום MicroSiM (μSiM) למידול מחסום הדם-מוח

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

אנו מפתחים מודל רקמה GI של מחסום הדם-מוח כדי להבין את ההשפעה של אלח דם על המוח ואת תרומתם של גורמים הנישאים בדם. שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. אנו מתכננים להעריך את תרומתם של גורמים גנטיים לרגישות של אוכלוסיות חולים מסוימות.אתגרי הניסוי הנוכחיים בקהילת שבבי הרקמות הם שחזור התוצאות ואימוץ טכניקות על ידי מעבדות חיצוניות. עיצובים ייחודיים של שבבי רקמות, נפחים קטנים בתוך שבבי רקמות, והיעדר בדיקות פונקציונליות סטנדרטיות תורמים כולם לאתגרים אלה ולעתים קרובות מגבילים את המשתמשים לבדיקות מבוססות פלורסנט כפלט העיקרי שלהם. התקני Micro simm מציעים מודולריות למידול רב-תכליתי במבחנה, משטח אור זכוכית אידיאלי להדמיית סגנון חיים ברזולוציה גבוהה וננו-ממברנה אולטרה syn 100 ננומטר, המיוצרת היטב, המבטיחה דיבור צולב גורם מסיס חלק ומבחני חדירות מדויקים.עם המיקרו סים, ראינו שסוגי תאים מסוימים נוטים לייצר יותר חלבוני מטריצה המספקים פיגום תומך סביב כלי הדם במוח. כעת אנו יכולים לשאול אם דלקת גורמת לאותם תאים לחזק או לפרק את המטריצות שלהם, ובכך לשנות את שלמות המחסום. בעתיד, נוסיף תא נוסף למודל עם תאים ירוקים כגון אסטרוציטים ומיקרוגליה כדי לחקור כיצד תאים אלה מתקשרים עם מחסום הדם-מוח במקרים של דלקת מערכתית כמו אלח דם.אנו מתכננים גם לחקור גורמים נוספים לדלקת מערכתית כמו הזיות לאחר ניתוח, המבוססות על דמנציה.

use-microsim-sim-barrier-tissue-platform-for-modeling-blood-brain

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטה זו מתארת ​​כיצד לבודד ולהנציח תאי אנדותל כלי דם ממוח עכבר. אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד החל מהומוגניזציה של רקמת מוח, שלבי עיכול, זריעה והנצחה של התאים. בדרך כלל, זה לוקח בערך חמישה שבועות כדי להשיג קו אחיד, שהונצח כלי דם האנדותל תא.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

הקמת מודלים האנושיים של מחסום דם המוח (BBB) ​​יכולה להועיל למחקר לתנאי מוח הקשורים לכישלון BBB. אנו מתארים כאן טכניקה משופרת להכנת מודל BBB מגע, המאפשר coculturing של האסטרוציטים אנושיים ותאי האנדותל במוח בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לאמת את שחזור של מודל במבחנה BBB מעורב syngeneic חולדה שיתוף תרבות של תאים והאסטרוציטים אנדותל. Monolayer תא אנדותל הציג Teer גבוה וחדירות LY נמוכות. ביטוי של חלבונים ספציפיים TJ, תגובות פונקציונליות לדלקת ופונקציונליות של מובילים וקולטנים הוערכו.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

כאן, אנו מתארים מודל עכברי במבחנה של מחסום הדם-מוח העושה שימוש בספקטרוסקופיה של תאי עכבה, תוך התמקדות בהשלכות על שלמות תאי האנדותל וחדירות באינטראקציה עם תאי T מופעלים.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

המטרה של הפרוטוקול היא להציג את הליך בלתי אופטימליים להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי הראשי (pBECs). המודל מראה הפארמצבטית גבוהה, אטימות גבוהה, מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת גילוי סמים.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

המוח מבודדים נימים מרקמות המוח האנושי יכול לשמש כמודל פרה ללמוד מכשול הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי טריים.

בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר את ההגדרה של cellulo ב BBB (מחסום הדם-מוח)-Minibrain פוליאסטר נקבובי ממברנה תרבות להוסיף מערכת על מנת להעריך את התחבורה של מולקולות או מדבקים BBB האנושית שלהם ההשפעה הפיזיולוגית על תאי המוח שכנות.

מודל ממשק מוח-דם אנושי ללמוד מכשול המעברים על ידי פתוגנים או תרופות והאינטראקציה שלהם עם המוח

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא יחידת נוירונימי-דם הדוקה באופן הדוק הומאוסטזיס מוחי. על ידי שילוב האדם iPSCs והעוגב-על-שבב טכנולוגיות, יצרנו שבב BBB אישי, מתאים למידול מחלות ותחזיות החדירה לתרופות של הפונקציה. פרוטוקול מפורט מתואר לדור ותפעול של שבב BBB.

הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום

פרוטוקול זה מתאר שיטה להקמת מחסום דם-מוח אנושי (BBB) במודל מבחנה . תאי האנדותל והפריציטים נזרעים בכל צד של מסנן הכנסה (תא דם), ואסטרוציטים נזרעים בבאר התחתונה (תא המוח). המודל שאפיין שימש לניסויים בהובלת ננו-חלקיקים.

מערכת תאי תרבית משולשת המדגימה את מחסום הדם-מוח האנושי

למחסום הדם-מוח (BBB) יש תפקיד מכריע בשמירה על סביבת מוח יציבה ובריאה. תפקוד לקוי של BBB קשור למחלות נוירולוגיות רבות. פיתחנו מודל תלת-ממדי, הנגזר מתאי גזע של BBB כדי לחקור פתולוגיה של כלי דם במוח, שלמות BBB, וכיצד BBB משתנה על ידי גנטיקה ומחלות.

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

פרוטוקול זה מתאר פלטפורמת תרבית תאים מבוססת קרום הניתנת להגדרה מחדש המשלבת את פורמט הבאר הפתוחה עם יכולות זרימת נוזלים. פלטפורמה זו תואמת לפרוטוקולים סטנדרטיים ומאפשרת מעברים הפיכים בין מצבי תרבית פתוחה ומיקרופלואידית, תוך מתן מענה לצרכים של מעבדות הנדסה וביו-מדע כאחד.

הפיכת מודלים של רקמת מחסום סטטי למערכות מיקרופיזיולוגיות דינמיות

חקור מודל רקמת מחסום MicroSiM לחקר מחסום הדם-מוח ותפקידו בהשפעת דלקת מערכתית על המוח. השיטה משתמשת בתאי גזע אנושיים ומאפשרת הערכת גורמים גנטיים בחולים.

שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום MicroSiM (μSiM) למידול מחסום הדם-מוח

גלה סרטונים נוספים