בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות
19 במאי 2023
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד החצי-אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת השומן של מורין כדי להשיג קדם-אדיפוציטים ולהשיג התמיינות אדיפוציט במבחנה. שימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז מפחית את השונות הניסיונית ומגביר את יכולת הרבייה.
אנו מתעניינים בתת-סוגים חומים ובז' של אדיפוציט אשר מפזרים אנרגיה בצורה של חום, בעוד אדיפוציט לבן בדרך כלל מאחסן אנרגיה כמו המטרה שלנו היא לפתח טיפול חדש להשמנת יתר וסוכרת המבוסס על קידום הוצאת אנרגיה, ולא דיכוי צריכת אנרגיה. זיהינו גורם שעתוק, NFI, כמווסת קריטי של התמיינות אדיפוציט חום על ידי ניתוח כרומטין פתוח לרווחת הגנום. NFI ומווסת התמלול הראשי של אדיפוגנזה, PPAR-gamma, לוקליזציה משותפת כמשפרים ספציפיים לשומן חום.
בתהליך של בידוד מקטע כלי דם סטרומה מרקמת השומן של עכבר, טחינה ידנית ועיכול collagenase של רקמת השומן יכולים להוביל לשונות ניסיונית וזיהום. השיטה שלנו משתמשת בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגן, המאפשר בידוד SVF, מפחית שונות וזיהום ניסיוני ומשפר את יכולת השחזור. ניסויים באמצעות אדיפוציט מובחן בנפרד הם הכרחיים למחקר בתחום שלנו.
הפרוטוקול שלנו יציע בידוד SVF קל וניתן לשחזור עבור התמיינות אדיפוציטים לאחר מכן ויאיץ את המחקר בקהילה שלנו. כיום, אנו חוקרים את התפקיד של NFI של חילוף החומרים בכל הגוף, כגון משקל גוף וגלוקוז, באמצעות מודלים של עלייה ואובדן של עכברי תפקוד. אנו גם נחקור הפעלה פרמקולוגית אחרת של NFI עבור כל מסלול במורד הזרם בעתיד הקרוב.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בבידוד חצי-אוטומטי של הפракציה הוואסקולרית הסטרומלית (SVF) מרקמת שומן של עכברים, במטרה להשיג פרי-אדיפוציטים ולעודד דיפרנציאציה של אדיפוציטים in vitro. מוצג פרוטוקול חדש המשתמש במפרק רקמות עבור עיכול בקולגנאז, אשר משפר את השחזוריות ומפחית את השונות הניסויית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- דיפרנציאציה של אדיפוציטים
- הוצאה אנרגטית בטיפולים להשמנה
- מודלים עכבריים למחקר מטבולי
רקע
- תפקודיהם השונים של אדיפוציטים חומים, בז' ולבנים
- הצורך בשיטות ניסוייות הניתנות לשחזור במחקר אדיפוציטים
- זיהוי גורמי שעתוק קריטיים המסדירים את הדיפרנציאציה
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד חצי-אוטומטי באמצעות עיכול בקולגנאז (collagenase)
- רקמת שומן עכברית
- מפרידי רקמות ובדיקות אנזימטיות
תוצאות עיקריות
- שיטות משופרות לבידוד SVF והגבהה של אדיפוציטים
- הדגמה של דיפרנציאציה מוצלחת באמצעות צביעת Oil Red O ואנליזת mRNA
- חקירת ההשפעות של Rosiglitazone על ביטוי גנים ספציפיים לרקמה שומנית חומה
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר בידוד מהימן של SVF לצורך דיפרנציאציה של אדיפוציטים.
- לממצאים יש השלכות משמעותיות על מחקרים בנושאי השמנה וסוכרת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד הדיר בעקביות של הפרקציה הווסקולרית הסטרומלית (SVF) מרקמה שומנית של עכברים הוא קריטי ליצירת פרה-אדיפוציטים ראשוניים ואדיפוציטים מובחנים, ובכך מאפשר מחקרים מכניסטיים של ביולוגיית האדיפוציטים. פרוטוקול חצי-אוטומטי זה מפחית שונות ניסויית וזיהומים, ותומך במודלים עקביים in vitro למחקר מחלות מטבוליות. שיפור השחזוריות בשלב זה מחזק את הביטחון החזוי עבור ניתוחים תפקודיים ומכניסטיים המשכיים הרלוונטיים למסלולי מחקר של השמנה וסוכרת.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולי התמיינות אדיפוציטים ושל רגולטורים תעתוקיים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת תאים ראשוניים למחקרים פונקציונליים.
- מסייע בתיקוף מטרות למחקר מחלות מטבוליות על ידי מאפשר מניפולציה מבוקרת של תתי-סוגים של אדיפוציטים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מערכות תאים ראשוניות סטנדרטיות לפיתוח בדיקות ולסריקת תרכובות.
- משפר את השחזוריות ומפחית את הסיכון לזיהום בבדיקות מבוססות תאים.
- מאפשר הערכה כמותית שלהתמיינות אדיפוגנית ותגובות של ביטוי גנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תומך ברצף תרגומי על ידי מידול ביולוגיה של אדיפוקיטים הרלוונטית למחלה in vitro.
- מאפשר ניתוחים פונקציונליים ומכניסטיים, כגון צריכת חמצן ושיקוע אימונו-פרוטייני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation), כדי לספק בסיס להחלטות פרה-קליניות.
- מתכתב עם מאמצים לגילוי סממנים ביולוגיים (biomarkers) על ידי אפשור פרופיל ביטוי גנים של אדיפוקיטים מובחנים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף הגילוי המוקדם ופיתוח הבדיקות, ומספק מקור הדיר לסימבנס של אדיפוקיטים ראשוניים עבור מחקרים פונקציונליים ומכניסטיים בהמשך.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי התמיינות אדיפוציטים ובקרה תעתוקית.
- סריקה: מספק תאים ראשוניים מוכנים לבדיקה עם שונות מופחתת לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר קריאות כמותיות כגון צביעת Oil Red O וניתוח ביטוי mRNA.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים in vitro למודלים מטבוליים פרה-קליניים על ידי אפשור בדיקות תפקודיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה סטנדרטית וחלקית-אוטומטית הניתנת להתאמה בתוכניות מחקר מטבוליות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי ביולוגיה של אדיפוציטים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בידוד SVF.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go עבור מטרות של מחלות מטבוליות באמצעות אספקת נתונים רבסטים in vitro.
- השפעה על הפורט폴יו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של תוכניות למחלות מטבוליות באמצעות בדיקות פונקציונליות מהימנות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמות עכבר ובתרביית תאים ראשונית.
- נדרשת גישה למפרק רקמות (tissue dissociator) ותשתיות סטנדרטיות לתרביות תאים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח הדירות (reproducibility) בין מחקרים שונים.
- ניתן להתאמה למאגרי רקמה שומנית שונים וייתכן שגם למערכות מודל אחרות.
- תלוי בעיכול אנזימטי מדויק ובבקרת זיהומים, כפי שמתואר בפרוטוקול.
