Name: זילוח דם מהיר יעיל בקסנופוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: למד פרוטוקול זילוח דם מהיר לדגי Xenopus laevis ו-Xenopus tropicalis. שיטה זו משפרת איכות דגימות רקמות לחקר טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה תוך הקטנת סטרס תחבורתי ובעיות ביוביטחון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענק OD R24 של NIH OD031956 ומענק NICHD R01 HD073104. אנו מודים לדארסי קלי על דיונים מועילים וקלט ראשוני על פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לסמנתה ג'לברט, ג'יל רלסטון וויל רצן על עזרתם ותמיכתם, כמו גם לשלושת הסוקרים העמיתים האנונימיים שלנו על המשוב שלהם.

כל הניסויים בוצעו בהתאם לכללים ולתקנות של בית הספר לרפואה של הרווארד IACUC (הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים) (IS 00001365_3).
הערה: למרות שהשיטה העיקרית של המתת חסד המתוארת נחשבת לטכניקה מקובלת להמתת חסד על ידי האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית12, היא לא נמצאה כמובילה להפסקת פעימות לב13. גם השיטה המשנית הנפוצה של פיטום כפול אינה מונעת זאת, וגם לא הוצאת הלב מהחיה. גירוש בעלי חיים מורדמים נחשב לשיטה הומנית ויעילה להמתת חסד מוצלחת12. מכיוון ששמירה על רקמות טריות באמצעות המתת חסד היא המטרה של פרוטוקול זה, מועיל שהלב ימשיך לפעום באמצעות המתת חסד ראשונית עם MS-222, וכי זילוח הוא עצמו שיטת המתת חסד משנית באמצעות המתת חסד.
1. הכנה
<ol><li>ודא שמוסד המחקר אישר את טכניקת המתת החסד והזילוח המתוארת בפרוטוקול זה.</li>
	<li>הכינו תמיסה של 5 גרם/ליטר MS-222 (טריקאין מתאן-סולפונט) ו-5 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט. הנפח צריך להיות גדול יותר מהנפח הדרוש כדי לכסות לחלוטין את בעלי החיים המורדמים. בדוק את ה- pH כדי לוודא שהוא ≥7.</li>
	<li>הכינו 500 μL של 180 U/mL הפרין במי מלח חוצצי פוספט (PBS) לכל X. laevis, או 200 μL לכל X. tropicalis.</li>
	<li>לבצע המתת חסד ראשונית על ידי הצבת Xenopus בתמיסה זו (משלב 1.2); החיה תישאר שקועה במשך שעה אחת בסך הכל.</li>
	<li>אשר כי Xenopus איבד את תגובת הכאב שלו על ידי צביטת כף הרגל 15 דקות לתוך המתת חסד. אם בעל החיים מגיב, להחזיר אותו לפתרון המתת חסד עד תגובה זו אובדת.</li>
	<li>לשקול את Xenopus ולקחת את כל המדידות הנוספות הנדרשות לפני הדגימה.</li>
	<li>באמצעות מחט 31 G, להזריק X. laevis עם 250 μL ו X. tropicalis עם 100 μL של 180 U/mL הפרין ב PBS (משלב 1.3) לתוך השרירים של כל גפה קדמית.</li>
	<li>הכינו תמיסה של 1 מ"ל/גרם ממשקל בעלי החיים של 54 U/mL הפרין ב-PBS perfusate. אנשים מנוסים יותר עם פרוטוקול זה עשויים לגלות כי פחות מדיה נדרשת כדי להשלים זילוח.</li>
	<li>השתמש במחט היפודרמית 22 G כדי לחורר X. laevis, ומחט היפודרמית 25 G עבור X. tropicali s. הקהו את מחט הזילוח על-ידי חיתוך הקצה באמצעות חותכי חוטים (איור 1)14. הערה: פעולה זו מפחיתה את הסבירות שהמחט תנקב דרך החדר אם היא מוזזת. בנוסף לקהות, המחט עשויה להיות טחונה מעט עם אבן השחזה או קובץ, אך עדיין להישאר חדה מספיק כדי לחדור את החדר.</li>
	<li>הכינו את המשאבה על ידי חיבור המחט החתוכה ומחזור 54 U/mL פרפוזט PBS (משלב 1.8). הקפד לנקות את כל בועות האוויר מהצינור כדי למנוע את האפשרות של תסחיף אוויר, המוביל לירידה ביעילות הזילוח או לכשל (ראה טבלה 1). שמור את אמצעי הזלוף על קרח למשך ההליך.</li>
	<li>אם המשאבה אינה ניתנת לתכנות, כאשר המחט במקומה, מדוד את נפח המדיה השאובה תחת ההגדרות השונות כדי לקבוע אילו הגדרות קרובות ביותר ל- 5 מ"ל לדקה ול- 10 מ"ל לדקה. קצבי זרימה אלה ישמשו ללא קשר למין. אם משאבת הזילוח ניתנת לתכנות, כייל אותה עם המחט במקומה, בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>הניחו את משטח הדיסקציה (מגש או יריעת קצף) בשיפוע בתוך מיכל משני, או סדרו אותו כדי להקל על ניקוז הדם.</li>
	<li>לאחר שהצפרדע הייתה בתמיסה במשך שעה אחת, המתת חסד ראשונית הושלמה. הסר את הצפרדע ובדוק מחדש את תגובת אובדן הכאב על ידי ביצוע צביטה ברגל.</li>
	<li>הניחו את הצפרדע על גבה ונעצו כל איבר (איור 2). אם נדרש שימור רקמת הגפיים, ניתן להניח סיכות דקות דרך הספרות או סיכות בצורת U סביב הגפיים.</li>
	<li>בעזרת מספריים דיסקציה, לחתוך דרך העור, במעלה קו האמצע, ולאחר מכן לרוחב, עושה שני דשים. (איור 2)</li>
	<li>השתמשו במלקחיים כדי לתפוס את הלינאה אלבה ולמשוך אותה הרחק מהחלל הקואלומי (איור 3). בזהירות להשתמש מספריים לחתוך דרך השרירים. עשו שני דשים מקיר החלל וחתכו או נעצו את כל הדשים מהדרך.</li>
	<li>השתמשו במספריים לדיסקציה כדי לחתוך דרך עצמות הקוראקואיד ולחתוך רקמה עודפת כדי לקבל גישה טובה יותר ללב (איור 3).</li>
	<li>הלב עדיין צריך לפעום. אם הלב הפסיק לפעום לפני הזילוח, שימו לב שטריות הדגימה נפגעה.</li>
</ol>2. זילוח
<ol><li>זהה את הבטן והזז אותה בעדינות כך שהיא נמצאת על גבי האונה השמאלית של הכבד (מימין לצופה), כאשר כלי הדם שלה גלויים למשך ההליך. זהה ריאה ואחז אותה בקצה שלה באמצעות מלקחיים רקמות. משכו את הריאה אל מחוץ לחלל הקואלומי ונעצו אותה דרך הקצה (איור 4). עשו זאת בעדינות, שכן כלי דם שבורים אינם מחוררים היטב. שים לב אם הדם גלוי בתוך האונה, שכן זה ישפיע על היכולת לקבוע את השלמת ההליך.</li>
	<li>צלם תמונה של החלל הקואלומי כדי להעריך טוב יותר את יעילות הזילוח ואולי לזהות רקמות חריגות במועד מאוחר יותר.</li>
	<li>זהו את קרום הלב הדק ומשכו אותו בעזרת מלקחיים רקמתיים (איור 5). בעדינות לנקב את קרום הלב באמצעות קצה מספריים iridectomy, נזהר לא לחתוך את הרקמות הבסיסיות. מקלפים את קרום הלב הרחק משלושת חדרי הלב.</li>
	<li>השתמש במלקחיים כדי לתפוס בעדינות את החדר על ידי קודקודו. הפעילו לחץ מוגבל כך שיהיה מספיק מקום בין משטחי המתיחה של המלקחיים כדי שמחט הזילוח תעבור (איור 6).</li>
	<li>הכניסו את המחט דרך סגירת המלקחיים לחדר החדר, תוך זהירות שלא לנקב דרך החדר (איור 7). מהדקים את מלקחיים הרקמה למקומם באמצעות מחזיק מחט באמצעות המוסטט. הערה: טכניקה זו מייצבת את מיקום המחט, שהוא עדיין חד. הצמדת המחט ישירות לחדר תגרום גם היא לנזק מיותר, מה שיקשה על הידוק במקרה הצורך (ראה טבלה 1).</li>
	<li>התחל את זרימת המשאבה במהירות של כ- 5 מ"ל/דקה. שלושת חדרי הלב ותא המטען העורקי יתחרתו (איור 8; ראו טבלה 1).</li>
	<li>עם מספריים, בזהירות lance את auricle ימין (בצד שמאל של הצופה); דם יישפך החוצה. הגדר את קצב הזרימה ל- 5 מ"ל לדקה או הגדל אותו ל- 10 מ"ל לדקה.</li>
	<li>המשיכו עד שכלי הדם של הקיבה מתכווצים (ראו טבלה 1), ואז השוו את הפיתול השמאלי של הלב (מימין לצופה). אם קצב הזרימה הוא עדיין 5 מ"ל/דקה, הגדל אותו לכ-10 מ"ל/דקה.</li>
	<li>השתמש פיפטה העברה כדי לשטוף את החלל coelomic במדיה זילוח, כדי לעזור לשמור על הראות כדי להעריך טוב יותר את הצבע של perfusate זורם מן auricles.</li>
	<li>שמור את המחט במקומה עד שהשקע הזורם מהאוריקלס ברור (ראה טבלה 1) והריאה איבדה את גוונה האדום (ראה טבלה 1; איור 9).</li>
</ol>

זילוח דם בצפרדעים אפריקאיות בעלות טפרים לתמלול ופרוטאומיקה

<ol><li>Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+perfusion+as+a+method+for+vascular+visualization+in+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+brain+of+the+adult+pipid+frog%2C+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+corrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts.</a> Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+urinary+bladder+in+the+adult+African+clawed+toad%2C+Xenopus+laevis%3A+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts.</a> Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).</li>
<li>Lametschwandtner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+gallbladder+of+the+adult+South+African+clawed+toad%2C+Xenopus+laevis+Daudin%3A+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+corrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts.</a> Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+non-lobulated+liver+of+adult+Xenopus+laevis%3A+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts.</a> Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).</li>
<li>Miodoński, A. J., Bär, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+supply+of+the+choriocapillaris+of+anuran+amphibians+%28Rana+temporaria%2C+Rana+esculenta%29.+Scanning+electron-microscopic+%28SEM%29+study+of+microcorrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts.</a> Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).</li>
<li>Nenni, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%3A+Facilitating+the+use+of+Xenopus+to+model+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease.</a> Frontiers in Physiology. 10, 154(2019).</li>
<li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus%3A+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li>
<li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+repertoire+in+early+vertebrate+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Briggs, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+gene+expression+in+vertebrate+embryogenesis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 360 (6392), (2018).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+landscape+of+larval+and+adult+Xenopus+laevis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 13 (1), 4306(2022).</li>
<li>AVMA (American Veterinary Medical Association). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals%2C+2020+edition%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA%22%5BJournal%5D)">AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition.</a> AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37(2020).</li>
<li>Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bupivacaine+as+a+euthanasia+agent+for+African+Clawed+Frogs+%28Xenopus+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis).</a> PLoS One. 17 (12), e0279331(2022).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Heinz-Taheny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+physiology+and+diseases+of+amphibians.+Veterinary+clinics+of+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Clinics+of+North+America.+Exotic+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America.</a> The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).</li>
<li>Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vertebrate+heart%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The vertebrate heart: an evolutionary perspective.</a> Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).</li>
<li>Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+protocol+for+lizards%2C+including+a+method+for+brain+removal%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal.</a> MethodsX. 2, 165-173 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

פרוטוקול זה מתאר טכניקות דיסקציה מסורתיות לגישה לחלל הקואלומי. טכניקות אחרות מקובלות גם כן, בתנאי שהן גורמות נזק מינימלי לרקמות, הלב נגיש, והריאה והקיבה גלויים. באופן דומה, ניתן להחליף בקלות את רוב כלי הדיסקציה המפורטים בפריטים דומים.
בעוד שנעשו ניסיונות לייעל את היעילות של הליך זה, התוצאות עשויות להשתנות בהתאם לניסיון ולשונות בין צפרדעים בודדות. היבט מעניין אחד של זילוח דם שנותר מחוץ לתחום מאמר זה הוא כיצד הליך זה בהשוואה לדרכים חלופיות של זילוח עבור בעלי חיים שעוברים ניתוח. משתנה נוסף שלא נח...

זילוח הגוף כולו של דו-חיים מתבצע באופן שגרתי לצורך שימור וקיבוע 1,2,3,4,5,6. עם זאת, הליכים אלה מתרחשים בקצב המגביל את מספר הדגימות הטריות שניתן לקחת לכל חיה. מטרת עבודה זו היא לפתח פרוטוקול זילוח דם יעיל בקסנופוס, תוך מתן עדיפות למהירות הטכניקה. הפרוטוקול לוקח פחות מ-10 דקות לכל חיה עבור X. tropicalis ופחות מ-15 דקות לכל X. laevis חיה. סדרי העדיפויות המשניים הם קלות השכפול והשימוש בציוד שנרכש בקלות, כך שניתן יהיה לשתף דגימות באיכות גבוהה באופן נרחב בין מעבדות Xenopus.
צפרדעי קסנופוס נמצאות בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי כדי לחקור תהליכים ביולוגיים ופתולוגיים בסיסיים שנשמרו בין מינים. לטטרפוד זה יש קשר אבולוציוני קרוב יותר עם יונקים מאשר מודלים ימיים אחרים, ויש לו ריאות, לב בעל שלושה חדרים וגפיים עם ספרות. הקהילה הבינלאומית משתמשת ביעילות ב- Xenopus כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של מחלות אנושיות באמצעות מודלים מעמיקים של מחלות וניתוח מולקולרי של תפקוד גנים הקשורים למחלות. היתרונות הרבים של קסנופוס כמודל של בעלי חיים הופכים אותם לכלים יקרי ערך לחקר הבסיס המולקולרי של התפתחות אנושית ומחלות; יתרונות אלה כוללים: גודל ביציות ועובר גדול, פריון גבוה, קלות דיור, התפתחות חיצונית מהירה וקלות מניפולציה גנומית. ההערכה היא כי Xenopus חולקים ~80% מהגנים המזוהים של המחלה האנושית7.
בהשוואה למודלים פופולריים של יונקים, Xenopus הוא מודל מהיר וחסכוני, עם קלות של הפלת מורפולינו וזמינות של טרנסגניות יעילות ומוטציות גנטיות ממוקדות באמצעות CRISPR8. ספקטרומטריית מסה כמותית ושעתוק חד-תאי יושמו בהצלחה על עוברי Xenopus9,10, אך אטלס תאים עדכני של Xenopus laevis מראה כי הרכב רוב הרקמות נשלט על ידי סוגי תאי דם 11. על ידי פיתוח טכניקה המשחררת רקמות בקצב מהיר ושימוש במדיה צוננת, טריות הדגימה מושפעת באופן מינימלי מזילוח. זה חשוב במיוחד עבור יישומים שבהם המטרה היא פרופיל mRNA או ביטוי חלבון שאינם מוטרדים פיזיולוגית.

<table><tbody><tr><td>זכוכית מגדלת 5x עם נורת LED ומעמד</td><td>amazon.com</td><td></td><td>אסור לאור B08QJ6J8P1 לייצר חום</td></tr><tr><td>צנרת העברה חד פעמית</td><td>VWR</td><<td>em>414004-036</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מלקחיים מחודדים עדינים</td><td>פישר Scinetific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>חיתוך מספריים פיונט חד, ישר 6.5 אינץ'</td> <td>VWR</td><td>76457-374</td><td></td></tr><tr><td>מגש חיתוך</td><td>Fisher Scinetific</td><td>14-370-284</td><td>יריעות קלקר הן חלופה מקובלת</td></tr><tr><td>מיכל המתת חסד</td> פריט <td>פלסטיק בארה"ב</td><td>&nbsp; 2860</td><td>מיכלים אטומים חלופיים</td></tr><tr><td>מכסה מיכל המתת חסד</td> מקובל פריט <td>פלסטיק ארה"ב</td><td>&nbsp; 3047</td><td></td></tr><tr><td>סיכות דיסקציה עדינות</td><td>מערכות חי מכשור</td><td>PIN-#3</td><td></td></tr><tr><td>שימוש כללי במחטים היפודרמיות, 22 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5A</td><td>עבור X. laevis</td></tr><tr><td>מחטים היפודרמיות לשימוש כללי, 25 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>עבור X. tropicalis</td></tr><tr><td>Heparin, רירית מעי חזירית</td><td>MilliporeSigma</td><td>37-505-410MG</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לכריתת אירית 6 "</td><td>vwr</td><td>470018-938</td><td>מספריים לקשתית הם אלטרנטיבה מקובלת</td></tr><tr><td>מתאם Luer ל-barb זכר Luer עם טבעת נעילה</td><td>amazon.com</td> גודל <td>B09PTX6M2Z</td><td>יהיה תלוי בצינור המשאבה המשמש</td></tr><tr><td>מחזיק מחט Mayo-Hegar</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-966</td><td>מלקחיים נגד יתושים הם אלטרנטיבה מקובלת</td></tr><tr><td>MS-222: סינקאין (לשעבר טריקאין)</td> <td>Pentair AES</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>משאבת נוזל פריסטלטית משאבת מינון 5&ndash; 100 מ"ל לדקה</td><td>amazon.com</td><td>B07PWY4SM6</td><td>כל משאבה פריסטלטית המסוגלת לשאוב 5-10 מ"ל לדקה מקובלת</td></tr><tr><td>אבן השחזה</td><td>VWR</td><td>470150-112</td><td>אופציונלית; למחטים עמומות</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט, אבקה, USP</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-333</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לדגימה, משוננים</td><td>VWR</td><td>82027-442</td><td></td></tr><tr><td>פיני T לניתוח</td><td>פישר Scinetific</td><td>S99385</td><td></td></tr><tr><td>מזרקי אינסולין קצרים עדינים במיוחד, חותכי</td> שטיפה <td>31 G VWR</td><td>BD328438</td><td></td></tr><tr><td>חוטים, קוצץ חותך צד חד וחזק במיוחד בגודל 6 אינץ'</td><td>amazon.com</td><td>B087P191LP</td><td></td></tr></tbody></table>

זילוח דם מהיר יעיל בקסנופוס

Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus

קסנופוס הם יצורי מודל רבי עוצמה להבנת התפתחות ומחלות של בעלי חוליות כבר למעלה מ-100 שנה. כאן מוגדר פרוטוקול זילוח דם מהיר בקסנופוס, שמטרתו הפחתה עקבית ודרסטית של הדם בכל הרקמות. הזלוף מתבצע על ידי החדרת מחט ישירות לחדר הלב ושאיבת מלח חוצץ פוספט (PBS) דרך מערכת כלי הדם. ניתן להשלים את ההליך תוך כ -10 דקות לכל חיה. הדם נשלט על ידי כמה חלבונים וסוגי תאים נפוצים מאוד, מה שיוצר בעיות רבות מכיוון שחלבונים אלה מסווים את רוב המולקולות וסוגי התאים האחרים המעניינים. האפיון הניתן לשחזור של רקמות קסנופוס בוגרות עם פרוטאומיקה כמותית ושעתוק חד-תאי יפיק תועלת מיישום פרוטוקול זה לפני דגימת האיברים. הפרוטוקולים לדגימת רקמות מוגדרים בניירות נלווים. נהלים אלה מכוונים לסטנדרטיזציה של פרקטיקות ברחבי Xenopus של מין, גיל ומצב בריאותי שונים, במיוחד X. laevis ו- X. tropicalis.

לאחר זילוח מוצלח, כל הרקמות (למעט הכבד בקסנופוס פיגמנטי) יהיו קלות יותר באופן מובהק ורוויות פחות בדם. כלי דם עיקריים יהיו פחות בולטים (איור 10), ורקמות (למעט הכבד) יישטפו בצורה נקייה במאגר לאחר הדגימה. בעוד שביצוע מוצלח של הפרוטוקול יכול בסופו של דבר להיות מאושר רק על ידי איכות הנתונים מדגימות רקמה שהוצאו, מספר בעיות אופייניות, הגורמים האפשריים שלהן ופעולות מתקנות מוצעות מסופקים בטבלת פתרון הבעיות (טבלה 1 ואיור 11)....

מוצג כאן פרוטוקול יעיל של זילוח דם מהיר להכנת דגימות רקמה מצפרדעים אפריקאיות בעלות טפרים למחקרי שעתוק ופרוטאומיקה.

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

הליך זה מתמקד בניצול הומני של מודלים של דו-חיים באופן שממקסם את היעילות. ניתן ליישם נוהלי תקינה על דגימות שנלקחו ונשמרו במושבה המקורית, ובכך להפחית את סיכוני האבטחה הביולוגית ולבטל את הלחץ על הובלת בעלי חיים. ניתן להשלים את השפע במהירות, ולמקסם את הזמן הזמין לדגום רקמות בעודן טריות.רעננות זו חשובה במיוחד לפרופיל פרוטאומי ושעתוק (proteomic and transcriptomic profiling). פרוטוקול זה מפורט ומפורש, מה שהופך אותו שמיש עבור אנשים עם מגוון רחב של רקעים. זה מאפשר שיתוף של דגימות באיכות גבוהה בין מעבדות Xenopus.יחד עם טכניקת שפע זו, פרוטוקול מקיף דומה עובד על דגימה סטנדרטית של כל האיברים העיקריים.

effective-rapid-blood-perfusion-in-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי...

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

באמצעות lipophilic 1,1-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) מכתים טכניקה, Ambystoma mexicanum יכול לעבור זלוף כלי הדם כדי לאפשר ויזואליזציה קלה של כלי הדם.

DiI זלוף כשיטת ויזואליזציה של כלי הדם<em&gt; Ambystoma מקסיקניום</em

כאן נציג של assay חדירות כלי דם במוח העכבר באמצעות הזרקה בקרום הבטן של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף הרלוונטיים מודלים חייתיים של תפקוד לקוי של מחסום הדם - מוח. חמי-המוח משמש עבור הערכת חדירות באופן כמותי, והשני עבור מעקב חזותי/immunostaining. התהליך לוקח ב' 5-6-10 עכברים.

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

זלוף הלב באתרו לשעבר normothermic (ESHP), שומר על הלב במצב הכאה, הפיזיולוגיות למחצה. כאשר מבוצעת במצב עבודה, ESHP מספק ההזדמנות כדי לבצע הערכות מתוחכמות של התורם הכדאיות איברים ותפקוד הלב. כאן, אנו מתארים את השיטה שלנו עבור הערכת ביצועים שריר הלב במהלך ESHP.

Normothermic לשעבר זלוף באתרו הלב בעבודה מצב: הערכה של תפקוד הלב ואת חילוף החומרים

הנה הציג פרוטוקול של לשעבר vivo אימהי-העוברי וסקולזיה העובר כדי לאפשר את הניהול של מאמר מבחן לתוך ואסילטורה אימהית וכלה להעריך העברה שלמה של חלקיקים xenoביוטיים או סוכני תרופתי בנוסף שינויים ב פיזיולוגיה של...

לשעבר Vivo Perfusion של השליה מכרסם

פרוטוקול מתואר על הפרזיה באתרו של גוף העכבר התחתון, כולל שלפוחית השתן, הערמונית, איברי מין, עצם, שרירים ועור כף הרגל.

הקמת מעגל באתרו של איברי הבטן התחתונה וגפיים האחוריות בעכברים

מאמר זה מציג מדריך לדגימת שישה איברים משמעותיים ומגוונים בקסנופוס בוגר שניתן לגשת אליהם במהירות ובקלות: חדר הלב, אונת הכבד, הלבלב, גופי השומן, הכליות הזוגיות והעור.

טכניקות לדגימה מהירה של שישה איברים חיוניים בקסנופוס בוגר

זהו חלק ראשון מפרוטוקול דגימת קסנופוס מקיף. הרקמות שנדגמו הן חדר הלב, תא המטען העורקי, אונת הכבד השמאלית, כיס המרה, הריאות, הלבלב, הטחול, הגרון, הוושט, הקיבה, המעיים, האשכים, גופי השומן, צינור הביצית, כליות מזווגות, מקלעת סיאטית, עור, תימוס ועין שלמה.

טכניקות יעילות לדגימה מקיפה של רקמות נגישות בקסנופוס בוגר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למערכת זלוף נורמותרמית ex vivo בקוד פתוח הניתנת לשינוי שנועדה להתגבר על העלות הגבוהה והגמישות המוגבלת של פלטפורמות קיימות, ולאפשר שימוש נגיש יותר, חסכוני ואיטרטיבי במחקר ביו-רפואי פרה-קליני.

מערכת זילוף נורמתרמית בקוד פתוח המיועדת למדעני מחקר

למד פרוטוקול זילוח דם מהיר לדגי Xenopus laevis ו-Xenopus tropicalis. שיטה זו משפרת איכות דגימות רקמות לחקר טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה תוך הקטנת סטרס תחבורתי ובעיות ביוביטחון.

זילוח דם מהיר יעיל בקסנופוס

גלה סרטונים נוספים