Name: אופטימיזציה של הליך הגידול של צרעות נטולות חיידקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: למדו אופטימיזציה של הליך גידול צרעות Nasonia נטולות חיידקים לחקר אינטראקציות חרקים-מיקרוביוטה. השיטה משפרת שיעורי הישרדות ומייעלת מחקר יחסי מארח-מיקרוב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון: עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע של סין (32270538), תוכנית המו"פ הלאומית של סין (2022YFF0710603), הקרן למדעי הטבע של בייג'ינג (6222046), והמימון האסטרטגי של CAS באמצעות תוכנית המימון CAS-CSIRO (152111KYSB20210011) שהוענק ל- G.H.W. תרומות מחברים: כל המחברים פיתחו את היקף ומיקוד הסקירה ותרמו לכתיבת כתב היד.

1. הכנתמדיום גידולנסוניה ללא חיידקים 
<ol><li>הניחו את הגלמים L. sericata הזמינים מסחרית (ראו טבלת חומרים) על משטח שיכול להכיל את כל הגלמים כגון מגש או גיליון נייר. השליכו זחלים לא מפותחים, גלמים ישנים כהים, קליפות גולם ריקות, נסורת או זיהומים אחרים. החזיקו רק גלמים צעירים שצבעם חום-אדום והעבירו אותם לכד (כ-3,000-4,000 גלמים). הערה: לאחר ביצוע ניסויים רבים, נמצא כי התווך העשוי מהגלמים הישנים והכהים הפך בקלות לכהה ועצר את התפתחותן של צרעות נטולות חיידקים. תופעה זו לא התרחשה כאשר השתמשו בגלמים החומים-אדומים הצעירים לייצור מדיום. הסיבה לכך עדיין אינה ברורה ודורשת חקירה נוספת כדי לאמת אותה.</li>
	<li>הוסיפו מספיק מים נטולי יונים, כדי לכסות את כל פני השטח של הגלמים. לעטוף את הפה של הכד עם tinfoil או גזה, לנער את הכד כדי לנקות את הזיהומים על פני השטח של הגלמים, ולאחר מכן לשפוך את המים. חזור על הפעולה שלוש עד חמש פעמים.</li>
	<li>הניחו את הגלמים הנקיים של L. sericata במיכל הסינון של מכבש שום, סחטו חזק ואספו את נוזל הרקמה של הגלמים L. sericata בצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מ"ל. לאחר מכן, יוצקים את שאריות הגלמים ומכניסים גלמים חדשים למיכל הסינון של מכבש השום עד שכולם נסחטים. הערה: בהשוואה למכשיר שחול המחט המשמש את וואנג ואחרים 14, מכבש השום נוח יותר ויכול להפריד את נוזל האינטרסטיציאל בצורה יסודית יותר. התקדמות זו מניחה את היסודות לייצור בקנה מידה גדול ואחסון לטווח ארוך של NRM.</li>
	<li>צנטריפוגה את התערובת בטמפרטורה של 4°C (25,000 x גרם) למשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, התערובת תופרד לשלוש שכבות מלמטה למעלה: שכבת משקעים, שכבת חלבון ושכבת שומן (איור 1).</li>
	<li>כדי למנוע סתימה במהלך הסינון, שאפו את שכבת החלבון באמצעות מחט סטרילית 18 גרם והעבירו אותה לצינור צנטריפוגה סטרילי חרוטי חדש של 50 מ"ל.</li>
	<li>הוסיפו מדיום דרוזופילה נוזלי מסחרי (ראו טבלת חומרים) לתמצית החלבון ביחס של 1:1. הערה: L. sericata ממוסחר נוח יותר שימש כחומר גלם מארח ו-NRM, בהשוואה ל-NRMv3. לכן, היחס התזונתי הותאם מ-1:2 ל-1:1 בהתבסס על NRMv3, שהיה מתאים יותר לגדילה ולהתפתחות של נסוניה סטרילית (איור 2).</li>
	<li>סנן את התווך המעורב (מדיום דרוזופילה ותמצית חלבון של L. sericata pupa) באמצעות מערכת סינון ואקום עם גדלי נקבוביות שונים (8, 1.2, 0.8 ו- 0.45 מיקרומטר; ראה טבלת חומרים) כדי להסיר חלקיקים בגדלים שונים. כדי למנוע סתימה, החלף את נייר הסינון כאשר הזרימה מאטה. הערה: השימוש בצינור צנטריפוגה סטרילי חדש של 50 מ"ל נדרש עבור כל סינון.</li>
	<li>צנטריפוגו את הנוזל שוב בטמפרטורה של 4°C (15,000 x g) למשך 10 דקות ועיקרו את התווך הסופרנאטנטי דרך מסנן מזרקים של 0.22 מיקרומטר. חזור על השלבים לעיל פעם אחת.</li>
	<li>אחסנו את מדיום התרבית בטמפרטורה של -20°C לאחר הציטוט (איור 3A) לאחסון לטווח ארוך. הערה: כדי למנוע זיהום והקפאה והפשרה חוזרות ונשנות, מומלץ לפתוח כל צינורית של NRM פעם אחת בלבד בעת שימוש במדיום התרבית לאחר האריזה (איור 3A).</li>
</ol>2. איסוף ביצים ללא חיידקים
<ol><li>כדי להבטיח יחס יציב בין זכר לנקבה בצאצאים, הניחו את הגלמים בבקבוקון דרוזופילה בשלב הגלמים ביחס של 50 נקבות ל-15 זכרים בגלל המאפיינים הגנטיים ההפלואידים שלהם (זכרים מתפתחים מתאים הפלואידים, בעוד שהנקבות מתפתחות מתאים דיפלואידיים הנובעים מביציות מופרות)4,15.<ol><li>לאחר הגיחה לבוגרים, אפשרו לזכרים ולנקבות להזדווג במשך יום וחצי, ולאחר מכן הכניסו כ -40 גלמים L. sericata לתוך הבקבוקון. בתוך 12-24 שעות לאחר הטפילות, השתמשו במחט ניתוח סטרילית כדי לפתוח בזהירות קצה אחד של קליפת הגולם תחת סטריאומיקרוסקופ (איור 4).</li>
		<li>החזיקו את הקצה השני ביד ומצאו את עוברי הצרעה. השתמש במחט ניתוח כדי להעביר עוברים מפני השטח של רקמת הגלמים L. sericata למסננת תאים סטרילית עם מלח חוצץ פוספט (PBS)14. הערה: יש להשתמש בגלמים ישנים יותר של L. sericata לטיפול בטפילות, מכיוון שרקמת L. sericata pupa היבשה קלה יותר להעברת עוברים. על מנת להבטיח העברה חלקה של ביצים משטח רקמת הגלמים L. sericata, נסו להיזהר שלא לנקב את הרקמה כאשר המחט המנותחת פותחת את מארז הגולם, כך שהנוזל הבין-תאי לא יזרום החוצה.</li>
	</ol></li>
	<li>הניחו 20-30 עוברים על מסננת תאים ושטפו אותם באופן שווה עם 1,000 μL של 10% תמיסת נתרן היפוכלוריט מסחרית (ראו טבלת חומרים), ולאחר מכן שטיפה נוספת עם 1,000 μL של PBS סטרילי אחד. לאחר מכן, יש לשטוף פעם אחת עם 1,000 μL של תמיסת אתנול 70% ולשטוף שלוש פעמים עם 1,000 μL של PBS סטרילי אחד.</li>
	<li>ראשית, הניחו יריעת רשת פוליפרופילן בקוטר 5 מ"מ (ראו טבלת חומרים) שהורטבה מראש עם PBS 1x לתוך צלחת בעלת 24 בארות. לאחר מכן, באמצעות מברשת קטנה מעוקרת, הברישו בעדינות את עוברי הצרעה על מסננת התאים על יריעת רשת הפוליפרופילן. ניתן לעשות זאת עבור כל ארבע הבארות בטור אנכי של צלחת 24 בארות.</li>
</ol>3. גידול צרעות ללא חיידקים
<ol><li>הוסף 50 μL של NRM לכל באר במכסה מנוע זרימה למינרית. כדי לשמור על סביבה לחה לצמיחה, הוסף 1 מ"ל מים סטריליים בין כל באר בצלחת 24 בארות. קטנה המכילה 30 מ"ל מים סטריליים יכולה להיות ממוקמת גם בקופסת הפלסטיק הסטרילית 5 L עם צלחת 24 בארות.<ol><li>לאורך כל הניסוי, שמרו את קופסת הפלסטיק הסטרילית ואת צלחת 24 הבארות בתא אקלים בטמפרטורה קבועה של 25 ± 2 מעלות צלזיוס ותחת אור קבוע.</li>
	</ol></li>
	<li>לפני העברה והוספה של NRM מדי יום, הפשירו את ה-NRM הקפוא על ספסל זרימה למינרי. בסביבה סטרילית, השתמש בפינצטה מחוטאת אלכוהול כדי להעביר את רשת הפוליפרופילן עם הזחלים עליה מבאר אחת לאחרת. לבסוף, הוסיפו 50 מיקרוליטר של NRM ששוקל לטמפרטורת החדר (איור 3B). חזור על הפעולות הנ"ל כל יום עד שגלמים נצפים. הערה: עם התפתחות הצרעות, יש להגדיל את כמות ה-NRM כראוי כדי להבטיח שלצרעות נטולות חיידקים יש תזונה מספקת. לדוגמה, הזחלים הכוכבים הרביעי סופקו עם 60 עד 70 μL של NRM. מכיוון ששלבי התפתחות שונים עשויים להתקיים יחד באותה באר, השתמשו במברשת מעוקרת כדי להעביר את הגלמים החוצה. הוסיפו כמות קטנה של NRM לזחלים הנותרים. השתמש בטכניקות אספטיות כדי למנוע פלישה מיקרוביאלית וזיהום.</li>
	<li>לאחר האכלה במשך 9 עד 11 ימים, יותר מ -80% מהזחלים מתפתחים לגלמים לבנים או צהובים. בשלב זה, העבירו את הפילטר לצלחת באר נקייה והפסיקו להוסיף מדיום תרבית כדי להמתין לאקלוזיה.</li>
</ol>

גידול צרעות נסוניה , נטולות חיידקים

<ol><li>Diviccaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+impact+of+the+microbiome+on+neuroactive+steroid+levels+in+germ-free+animals%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551(2021).</li>
<li>Pang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-species+transplantation+of+gut+microbiota+from+human+to+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs.</a> The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).</li>
<li>Uzbay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-free+animal+experiments+in+the+gut+microbiota+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies.</a> Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).</li>
<li>Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasonia-microbiome+associations%3A+a+model+for+evolutionary+hologenomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research.</a> Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).</li>
<li>Li, J., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+efficient+germ-free+animal+system+to+support+functional+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research.</a> Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).</li>
<li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microbiome+confer+multigenerational+host+resistance+after+sub-toxic+pesticide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure.</a> Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).</li>
<li>Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coadaptation+between+host+genome+and+microbiome+under+long-term+xenobiotic-induced+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li>
<li>Dittmer, J., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+your+host+shuts+down%3A+larval+diapause+impacts+host-microbiome+interactions+in+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis.</a> Microbiome. 9 (1), 85(2021).</li>
<li>Dittmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disentangling+a+holobiont-recent+advances+and+perspectives+in+Nasonia+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1478(2016).</li>
<li>Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylosymbiosis%3A+relationships+and+functional+effects+of+microbial+communities+across+host+evolutionary+history%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history.</a> PLoS Biology. 14 (11), e2000225(2016).</li>
<li>Heavner, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+venom+gland+transcriptome+of+a+Drosophila+parasitoid+wasp%2C+Leptopilina+heterotoma%2C+reveals+novel+and+shared+bioactive+profiles+with+stinging+Hymenoptera%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera.</a> Gene. 526 (2), 195-204 (2013).</li>
<li>Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+the+hymenoptera+genetic+model%2C+Nasonia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia.</a> PLoS One. 7 (12), e51269(2012).</li>
<li>Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+approach+to+germ-free+rearing+in+the+jewel+wasp+Nasonia%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia.</a> PeerJ. 4, e2316(2016).</li>
<li>Wang, G. H., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+Nasonia+germ-free+rearing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized method for Nasonia germ-free rearing.</a> Scientific Reports. 12 (1), 219(2022).</li>
<li>Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hologenomic+basis+of+speciation%3A+gut+bacteria+cause+hybrid+lethality+in+the+genus+Nasonia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia.</a> Science. 341 (6146), 667-669 (2013).</li>
<li>Fontaine, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+free+of+germs+is+germ-free%3F+Detection+of+bacterial+contamination+in+a+germ+free+mouse+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit.</a> Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).</li>
<li>Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunomodulatory+molecule+of+symbiotic+bacteria+directs+maturation+of+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system.</a> Cell. 122 (1), 107-118 (2005).</li>
<li>Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+drugs+and+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Interaction between drugs and the gut microbiome.</a> Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עם היישום של טכנולוגיות זיהוי תפוקה גבוהה כגון גנומיקה ומטבולומיקה, חוקרים הבינו בהדרגה שיש מגוון גנטי עצום ומורכבות מטבולית במיקרוביוטה של המעי16. חיידקים סימביוטיים אלה קשורים קשר הדוק למצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים שונים, כגון מטבוליזם תזונתי של המאכסן, גידולים, חסינות והזדקנות באמצעות אינטראקציות מורכבות עם המאכסן17. עם זאת, המחקר הקשור לרשת ההרכב והתפקוד של אוכלוסיית החיידקים בפונדקאי קשה מאוד מכיוון שהרכב המיקרואורגניזמים בכל פרט טבעי אינו זההבדיוק ...

בעלי חיים נטולי חיידקים הם בעלי חיים שאין להם מיקרואורגניזמים חיים וטפילים הניתנים לזיהוי1. ניתן להשיג עוברים נטולי חיידקים על ידי ניתוח האם בתנאים אספטיים ולאחר מכן לגדלם במערכות מחסום2. בעלי חיים כאלה יכולים לשמש לחקר ההשפעות של מיקרואורגניזמים על בעלי חיים, כגון על המיקרוביוטה של המעי, מערכת החיסון וחילוף החומרים1. באמצעים טכניים מסוימים, חרקים רבים ואפילו יונקים יכולים להפוך לסטריליים 3,4. לבעלי חיים נטולי חיידקים יש תפקיד ייחודי והם נמצאים בשימוש נרחב בהיבטים שונים של מחקר מיקרוביולוגי5. לדוגמה, השימוש בצרעות Nasonia נטולות חיידקים גילה כי מיקרואורגניזמים יכולים לעזור למארחים להסתגל לסביבות חדשות תחת לחץ סביבתי אקסוגני ארוך טווח 6,7.
טפילי נסוניה הם צרעות טפיליות קטנות המזריקות את ביציהן לגלמים של זבובים4. ישנם ארבעה מינים ידועים של נסוניה, כולל Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti ו- Nasonia oneida8. ניתן למצוא N. vitripennis ברחבי העולם, בעוד שלשלושת המינים האחרים יש טווח מוגבל בצפון אמריקה4. צרעות טפיליות נסוניה נחשבות לחרקים מודל אידיאליים בגלל המאפיינים שלהן, כגון גידול קל, מחזור רבייה קצר, רצף גנום ודיאפאוזה 8,9 לטווח ארוך. ניתן להשתמש בהם כדי לחקור היבטים שונים של אבולוציה של חרקים, גנטיקה, התפתחות, התנהגות וסימביוזה10. יתר על כן, צרעות טפיליות נסוניה יכולות גם לסייע בהדברת זבובים מזיקים בחקלאות ובמחלות11. הקמתה המוצלחת של מערכת חרקים סטרילית כרוכה בשני שלבים עיקריים: (1) עיקור העוברים ו-(2) אספקת מזון סטרילי לזחלים במבחנה. על מנת להשיג מזון סטרילי, ברוקר ובורדנשטיין 12 פיתחו מדיום גידול נסוניה (NRMv1) בשנת 2012 על ידי שימוש בכימיקלים כגון אנטיביוטיקה, אקונומיקה וסרום בקר עוברי כדי להרוג חיידקים12. עם זאת, שיטת העיקור הכימי הביאה לשיעורי הישרדות ואקלוסיה נמוכים של N. vitripennis13. לאחר מכן, בשנת 2016, Shropshire et al. פיתחו את NRMv2 באמצעות שיטת עיקור מסנן במקום שיטת עיקור כימי כדי לחסל את הסיכונים של אנטיביוטיקה וחומרים אחרים, וייעלו את תהליך הרבייה13. למרבה הצער, לשיטה זו יש עדיין כמה חסרונות, כגון האתגרים הקשורים להכנת המדיום והשימוש בו, כמו גם הסיכונים לטביעה, תת-האכלה או התייבשות עבור העוברים, הזחלים והגלמים הסגורים14. וואנג וברוקר14 שיפרו לאחרונה את גרסת המדיה לגידול Nasonia גרסה 3 (NRMv3) ואת פרוטוקולי הגרסה 2 (GFRv2) לגידול ללא חיידקים. שיפורים אלה הפחיתו את העלות ואת צריכת המדיה. עם זאת, ל-NRMv3 יש זמן אחסון קצר מאוד והוא רגיש מאוד לזיהום.
בהתבסס על NRMv3, שיטת אחסון כלי ההכנה של NRM ויחס החומרים המזינים עברו אופטימיזציה במחקר זה. עידון מתודולוגי זה מאפשר שימוש ב-N. vitripennis כמודל למחקרי מיקרוביום. בהשוואה ל- NRMv3 שפותח על ידי וואנג ואחרים 14, הכלי המשופר לסחיטת סרקופגה בולטה גולם, אחד מחומרי הגלם של NRM, משפר מאוד את יעילות הייצור של נוזל רקמת S. bullata pupa בהשוואה למזרק 60 מ"ל עם חור תחתון המשמש את וואנג ואחרים 14. התאמנו את יחס החומרים המזינים של NRM, מה שהוביל לעלייה מסוימת בשיעור ההישרדות של צרעות נסוניה נטולות חיידקים מבלי להשפיע על זמן ההתפתחות שלהן. בנוסף, ה-NRM נארז בצינורות צנטריפוגות בעלי קיבולת קטנה (1.5 מ"ל) והוקפא במקרר בטמפרטורה של -20°C כדי להאריך את זמן האחסון. ראוי לציין כי בעוד שהשתמשנו בזבוב הבית Lucilia sericata כמארח וכמקור להכנת NRM, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם ככל הנראה למארחי Nasonia אחרים הזמינים במעבדה.

<table><tbody><tr><td>0.22 מסנן ואקום סטרילי</td><td>NEST</td><td>331011</td><td></td></tr><tr><td>10% נתרןהיפוכלוריט</td><td>LIRCON</td><td>XB-84BS-1</td><td></td></tr><tr><td>1x תמיסת PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>200 רשת ניילון נטו</td><td>BIOBYING</td><td>BY-378Z</td><td></td></tr><tr><td>24 צלחת באר</td><td>NEST</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>8, 1.2, 0.8 ו-0.45 &#181; m מסננים</td><td>שנחאי Xingya חומר טיהור מפעל</td><td>HN-AA-JT-10079</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול אתילי מוחלט</td><td>מקלין</td><td>E809057-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים</td><td>BIOLOGIX</td><td>15-1100</td><td></td></tr><tr><td>מסחרי Drosophila Medium</td><td>Boer</td><td>B645446-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>מחט חיתוך</td><td>Bioroyee</td><td>17-9140</td><td></td></tr><tr><td>מכבש</td> <td>שוםTaobao</td><td>ללא מספרים קטלוגיים</td><td>רכישה ב-Taobao</td></tr><tr><td>Lucillia sericata pupae</td><td>Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.</td><td>ללא מספרים קטלוגיים</td><td>רכישה ב-Taobao</td></tr><tr><td>מברשת כתיבה קטנה</td><td>Cestidur</td><td>BL0508</td><td></td></tr><tr><td>סטריאוסקופ</td><td>SOPTOP</td><td>RX50</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>SALMART</td><td>A109001-56</td><td></td></tr></tbody></table>

אופטימיזציה של הליך הגידול של צרעות נטולות חיידקים

Optimizing the Rearing Procedure of Germ-Free Wasps

טכנולוגיית גידול אספטי היא שיטה לגידול חרקים בתנאים סטריליים או כמעט סטריליים, אשר יכולה לחסל ביעילות את ההשפעה של מיקרואורגניזמים חיצוניים על מיקרוביוטה של חרקים ובכך לקדם את ההתפתחות המהירה של מחקר מיקרוביוטה חרקים. נסוניה (סוג צרעה) הוא חרק צרעה טפילי בעל יתרונות רבים, כגון תוחלת חיים קצרה, שונות גנטית גבוהה, תפעול קל ועוד, ונמצא בשימוש נרחב כמערכת מודל חרקים. שלא כמו טיפול אנטיביוטי, אשר יכול רק להפחית את מספר המיקרואורגניזמים בבעלי חיים, טכניקות גידול אספטיות יכולות לשלוט הן על הרכב וכמות מיקרואורגניזמים בבעלי חיים, מה שמקל עוד יותר על המחקר של אינטראקציות מיקרואורגניזם מארח. עם זאת, גרסאות קודמות של מדיום גידול Nasonia (NRM) יש כמה פגמים ובעיות, כגון תהליך הכנה מורכב וגוזל זמן, זיהום קל על ידי חיידקים או פטריות, וזמן אחסון קצר. לכן, מחקר זה פותר בעיות אלה על ידי אופטימיזציה של הכלים המשמשים בתהליך הכנת NRM, תנאי אחסון ויחסי רכיבים. התווך הממוטב יכול לאפשר אחסון בטמפרטורה של -20°C למשך 3 חודשים לפחות ולמנוע את האפשרות של זיהום NRM במהלך האכלת צרעות סטריליות. זה משפר עוד יותר את שיעור ההישרדות ואת רמת הבריאות של Nasonia אספטית, אשר חשוב לשימוש Nasonia כמודל למחקר מיקרוביאלי.

יעילות ההכנה של NRM שופרה מאוד על ידי שיפור כלי ההכנה. בנוסף, בעיית זיהום NRM בתהליך ההזנה בוטלה על ידי אופטימיזציה של האסטרטגיה ושיטת השימור. יחד עם זאת, ל-NRM המותאם היה יחס תזונתי מתאים יותר לגדילה והתפתחות של צרעות נטולות חיידקים עם L. sericata כפונדקאים. שיעור ההישרדות של צרעות נטולות חיידקים מזחלים לגלמים השתפר משמעותית בהשוואה לצרעות נטולות חיידקים שגודלו עם NRMv3 באמצעות GFRv2 (איור 2). יתר על כן, תקופת הייצור לא הייתה שונה בין הצרעות האספטיות לבין הצרעות המגודלות באופן קונב...

עוברי צרעת נסוניה נותחו מגלמי Lucillia sericata לאחר טפילים במשך 12-24 שעות ונשטפו בתמיסת אלכוהול ונתרן היפוכלוריט 10% כדי להשיג עוברים נטולי חיידקים. לאחר גידול העוברים נטולי הנבט ואספקת מצע גידול נסוניה, כדי לגדול ולהתפתח במבחנה, התקבלו בוגרים נטולי חיידקים של נסוניה.

Aseptic rearing technology is a method of culturing insects under sterile or almost sterile conditions, which can effectively eliminate the influence of ...

המחקר שלנו מתמקד בחקר אינטראקציות בין חרקים למיקרוביוטה, ובמיוחד חוקר את ההשפעה של חיידקים סימביוטיים אלה וחוקר את הדינמיקה של יחסי מיקרוב מארח. נסוניה נטולת חיידקים היא כלי חיוני לביצוע מחקר זה. המחקר הנוכחי משתמש בטכנולוגיות כגון ריצוף בתפוקה גבוהה, גידול חרקים ללא חיידקים, שעתוק, פרוטאומיקה ומיקרוסקופ מתקדם.כלי זה מאפשר ניתוח מקיף ווירטואליזציה של אינטראקציה בין חרקים לפונדקאים לקידום הבנתנו בתחום. ההליך האופטימלי להכנת מדיום הגידול של נסוניה, מספק יתרונות כלכליים וחוסך זמן ומאמץ. בנוסף, זה מפחית ביעילות את הסיכון של זיהום NRM במהלך תהליך ההאכלה, שיפור משמעותי את היעילות של ייצור Nasonia אספטית

optimizing-the-rearing-procedure-of-germ-free-wasps

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טפיל (טפילים) צרעות מהווים שיעור גדול של אויבים טבעיים של חרקים רבים,...

מבוא של צרעות טפיליות<em&gt; תסיסנית</em&gt; ואת התגובה החיסונית Antiparasite

Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia שוחררו לאוכלוסיות טבעי לדכא את השידור של arboviruses. אנו מתארים שיטות האחורי Ae. aegypti עם זיהומים Wolbachia במעבדה ניסויים ולשחרר שדה, נקיטת אמצעי זהירות כדי למזער את עיבוד מעבדה ובחירה.

שמירה על Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

המטרה הכוללת של הליכים אלה היא ליצור, לשמור ולרענן אוכלוסיה בשבי של רקבן הבוץ באווירה מחקר.

לגידול ואחזקה ארוך טווח של רקבן הבוץ Hoverflies למטרות מחקר

תרסיסים פטריות על צמחים פורחים עשויה לחשוף הדבורים בודד כדי ריכוזים גבוהים של שאריות אבקה בעקיצות פטריות. באמצעות מבוסס מעבדה בניסויים המערבים במבחנה-דבורה גדלו הזחלים, מחקר זה בוחן את ההשפעות אינטראקטיבי של צריכת פטריות שטופלו אבקה נגזר צמחים המחשב המארח ופונדקאי.

במבחנה גידול דבורים בודד: כלי להערכת גורמי סיכון זחל

כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים: ראשית להפצה, חילוץ, טיהור וכימות כמויות גדולות של חלקיקי נגיף שאינם עטופים בדבורי דבש, כולל שיטה להסרת גלמי דבורת הדבש ושנית לבדיקת ההשפעות של זיהום נגיפי באמצעות בדיקה ביולוגית של כלובים בתפוקה גבוהה הניתנת לחזרה גבוהה.

הכנת אינוקולום מועשר בנגיף לזיהום אוראלי של דבורי דבש (Apis mellifera)

כאן, אנו מתארים שיטות להזרקות יעילות של פופלים ומבוגרים בנסוניה ויטריפניס כחלופות נגישות למיקרו-אינטרנציקציה של עוברים, המאפשרות ניתוח פונקציונלי של גנים בעלי עניין באמצעות השתקת RNA באמצעות הפרעת RNA (RNAi) או נוקאאוט גנים באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

Ganaspis brasiliensis - טפיל זחל של Drosophila suzukii (מזיק גידולי פירות פולש עולמי) - אושר או נחשב להכנסתו לאירופה ולארצות הברית להדברה ביולוגית של מזיק זה. מאמר זה מספק פרוטוקולים הן לגידול בקנה מידה קטן והן בקנה מידה גדול של טפיל זה.

שיטות לגידול ה-Ganaspis brasiliensis הטפילי, חומר הדברה ביולוגי מבטיח לסוזוקי דרוזופילה הפולשני

מטרת הפרוטוקול היא להקל על ניתוח פונקציונלי של אינטראקציות בין פרזיטואידים למארח ב-Asobara japonica וב-Drosophila melanogaster. באמצעות שיטות גידול אופטימליות, בדיקת זיהום בביצת ביצים יחידה, והפלת גנים בתיווך RNAi.

פרוטוקולים לגידול יעיל וניתוח תפקודי של הצרעה האנדופרזיטואידית Asobara japonica והמארח שלה Drosophila melanogaster

למדו אופטימיזציה של הליך גידול צרעות Nasonia נטולות חיידקים לחקר אינטראקציות חרקים-מיקרוביוטה. השיטה משפרת שיעורי הישרדות ומייעלת מחקר יחסי מארח-מיקרוב.

אופטימיזציה של הליך הגידול של צרעות נטולות חיידקים

גלה סרטונים נוספים