Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

Hugo Bibollet; Daniel F. Bennett; Martin F. Schneider; Erick O. Hern&#225;ndez-Ochoa

doi:10.3791/65311

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר בתאים מקומיים לחקר עוררות שרירי השלד

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר בתאים מקומיים לחקר עוררות שרירי השלד

Full Text

1,246 Views

12:26 min

June 2, 2023

DOI: 10.3791/65311-v

Hugo Bibollet¹, Daniel F. Bennett¹, Martin F. Schneider¹, Erick O. Hernández-Ochoa¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology,University of Maryland School of Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר היא שיטה לחקר תנועות תחום החלבונים בזמן אמת. שינוי טכניקה זו ליישומה בתאים מקומיים מאפשר כעת זיהוי ומעקב אחר תנועות חיישן מתח יחיד מתעלות Ca²⁺ מגודרות מתח בסיבי שריר שלד מבודדים.

Transcript

CaV1.1, חבר בתעלות היונים מגודרות המתח, כולל ארבעה חיישני מתח נפרדים. ראיות מצביעות על כך שחיישני מתח מסוימים תורמים יותר להפעלת קולטן ריאנודין או לזרם סידן. אנו שואפים להיות מסוגלים לזהות את התפקיד המדויק של כל חיישן מתח בצימוד עירור-התכווצות והפעלת תעלת סידן.

צימוד עירור-התכווצות נחקר מאז תחילת שנות ה-50, אך הפרטים המולקולריים של האופן שבו תהליך זה מתרחש עדיין אינם ידועים. ההתקדמות האחרונה במבנה המיקרוסקופי של הצירו-אלקטרונים של התעלה, אפיון חלבון העזר CaV1.1 החדש, גילוי גרסת השחבור החלופית של התעלה וזיהוי מוטציות גורמות למחלות הציתו מחדש את העניין בתחום זה. טכניקות רבות משמשות בתחום שלנו, החל מאלקטרופיזיולוגיה קלאסית וביולוגיה מולקולרית ועד טכניקות חדשניות יותר כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים, סימולציה דינמית מולקולרית, פירוק חלבונים ממוקד ופלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר, כמו גם תאים מהונדסים או מודלים של בעלי חיים.

נכון לעכשיו, הדלק עומד בפני מספר אתגרים ניסיוניים. בשרירי שלד, תנועה נכונה ותקשורת בין CaV1.1 ו-RyR1, יחד עם חלבונים רגולטוריים רבים, חיוניים לתמיכה בצימוד עירור-כיווץ. השיטות לחקור ישירות אינטראקציות חלבון-חלבון אלה בין CaV1.1 ו- RyR1 חסרות או חלקיות.

מעבדתו של ד"ר מרטין שניידר עובדת על צימוד עירור-התכווצות מזה עשרות שנים, ומאפיינת מנגנוני חישת מתח ב- CaV1.1, שחרור סידן ואירועי שחרור סידן מקומיים, המכונים ניצוצות סידן. לאחרונה, המעבדה שלנו מיישמת טכניקות אופטיות חדשות כדי לחקור שלבים שונים של צימוד עירור-כיווץ ותנועת חיישן מתח בתאי שריר בוגרים מתפקדים. בעוד שזה נעשה בעבר במערכת ביטוי הטרולוגית, הפרוטוקול שלנו מאפשר כעת לעקוב אחר שינויים קונפורמטיביים בחיישני מתח CaV1.1 במהלך פוטנציאל פעולה מופץ בסביבה הטבעית שלו.

הטכניקה החדשה שלנו תאפשר לנו לחקור את התנועה המדויקת של חיישן המתח הדרוש לצימוד עירור-כיווץ. אנו רוצים לדעת אילו שאריות מטען בכל S4 הן קריטיות לתפקודו, או בדיוק כל טרנסלוקציה של S4, וכל הטרנסלוקציה קשורה לפתיחת CaV1.1 או להפעלת קולטן ריאנודין.