ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר ג'יי ורגרה (אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס) על שיתוף פלסמיד הבר מסוג EGFP-CaV1.1 (ארנב). אנו מודים למעבדת האלקטרוניקה של המחלקה לפיזיולוגיה של ייל ובמיוחד להנריק אבילגארד על התכנון והבנייה של הפוטודיודה עם מעגל מסילה והחזקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01-AR075726 ו- R01-NS103777

פלואורומטריה תפקודית מכוונת אתר בתאי שריר שלד מקומיים

המחברים אינם מדווחים על ניגוד עניינים.

כאן מתואר פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע FSDF בסיבי שריר לחקר תנועות חיישן מתח בודדות מערוץ CaV1.1. למרות שמספר השלבים ומגוון הגישות המשולבות בטכניקה זו עשויים להיראות מורכבים, רוב הטכניקות הללו משמשות לעתים קרובות באופן שגרתי במעבדות ביופיזיקאיות / ביולוגיות של התא. לפיכך, המורכבות לכאורה שוכנת בעיקר בשילוב של כל הגישות השונות בטכניקה משולבת אחת. לעתים קרובות בעת ביצוע שיטה מרובת שלבים, ההשפעה של שינויים קטנים שבוצעו בהתחלה ניתנים לזיהוי רק מאוחר יותר בשלבים הבאים. עם הקפדה בפיתוח של כל שלב, וקריטריונים מדויקים ...

היכולת לעקוב אחר סידורים קונפורמטיביים של תעלות יונים בתגובה לגירוי חשמלי ידוע בתא חי היא מקור למידע רב ערך עבור פיזיולוגיה מולקולרית1. תעלות יונים מגודרות מתח הן חלבוני ממברנה החשים שינויים במתח הטרנסממברנלי, ותפקידם מושפע גם משינויי מתח2. התפתחות טכניקות מהדק מתח במאה הקודמת אפשרה לפיזיולוגים לחקור, בזמן אמת, זרמים יוניים הנישאים על ידי תעלות יונים מגודרות מתח בתגובה לדפולריזציה של הממברנה3. השימוש בטכנולוגיית מהדק מתח היה חיוני להבנת התכונות החשמליות של תאים מעוררים כגון נוירונים ושרירים. בשנות ה-70 של המאה ה-20, עידון מהדק המתח איפשר זיהוי זרמי גאטינג (או תנועת מטען) בתעלות סידן מגודרות מתח (Ca V) ונתרן (NaV) 4,5. זרמי גאטינג הם זרמים קיבוליים לא ליניאריים הנובעים מתנועת חיישני מתח בתגובה לשינויים בשדה החשמלי על פני קרום התא6. זרמי גאטינג נחשבים לביטוי חשמלי של סידורים מולקולריים המקדימים או מלווים את פתיחת תעלת היונים7. בעוד מדידות זרם אלה מספקות מידע רב ערך לגבי תפקוד הערוץ, הן זרמים יוניים והן זרמי גטינג הם קריאות עקיפות של סידורים קונפורמטיביים בין-מולקולריים ותוך-מולקולריים של תעלות מגודרות מתח7.
פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר (FSDF; מכונה גם פלואורומטריית מהדק מתח, VCF) פותחה בתחילת שנות התשעים8 וסיפקה לראשונה את היכולת לצפות ישירות בשינויים קונפורמטיביים מקומיים ואת תפקודו של חלבון ערוץ בזמן אמת. באמצעות שילוב של מוטגנזה של תעלות, אלקטרופיזיולוגיה ומערכות ביטוי הטרולוגיות, ניתן לתייג ולעקוב באופן פלואורסצנטי אחר החלקים הנעים של ערוצים או קולטנים ספציפיים בתגובה לגירוי המפעיל 9,10. גישה זו שימשה באופן נרחב לחקר מנגנוני חישת המתח בתעלות יונים מגודרות מתח 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. לקבלת סקירות סמכותיות, ראה 10,20,21,22,23.
תעלות Ca V ו-NaV, הקריטיות להפעלה והתפשטות של אותות חשמליים, מורכבות מתת-יחידה ראשית α1, בעלת נקבובית מרכזית וארבעה תחומי חישת מתח לא זהים2. בנוסף למבנה הראשוני הייחודי שלהם, ערוצי Ca V ו- NaV מבוטאים כקומפלקסים מרובי יחידות עם יחידות משנה עזר24. תעלות אשלגן תלויות מתח (K V) מורכבות מארבע תת-יחידות שנראות כמו תחום אחד של Na V או CaV25. תת-היחידה α1 יוצרת נקבוביות וחישת מתח של תעלות Ca V ו-NaV נוצרת על ידי קידוד פוליפפטיד יחיד עבור ארבעה תחומים נפרדים של שישה מקטעים טרנסממברנליים ייחודיים (S1-S6; איור 1A) 24,26. האזור המורכב ממקטעי טרנסממברנה S1 עד S4 יוצרים את תחום חישת המתח (VSD) ומקטעי טרנסממברנה S5 ו-S6 יוצרים את תחום הנקבוביות26. בכל VSD, סליל α S4 מכיל ארגינין או ליזין בעלי מטען חיובי (איור 1A,B) שנעים בתגובה לדפולריזציה של הממברנה7. כמה עשורים של מחקר ותוצאות מגישות ניסיוניות מגוונות ביותר תומכות בהנחה שמקטעי S4 נעים החוצה ויוצרים זרמי גטינג, בתגובה לדפולריזציה של הממברנה6.
FSDF מודד את השינויים הפלואורסצנטיים של צבע תגובתי תיול המצומד לשאריות ציסטאין ספציפיות (כלומר, סליל α S4) על תעלת יונים או חלבון אחר, שהונדסו באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר, כאשר התעלה מתפקדת בתגובה לדפולריזציה של הממברנה או גירויים אחרים10. למעשה, FSDF פותח במקור כדי לחקור אם מקטע S4 בערוצי KV, שהוצע להיות חיישן המתח העיקרי של הערוץ, נע כאשר מטעני הגאטינג נעים בתגובה לשינויים בפוטנציאל הממברנה 8,10. במקרה של תעלות יונים מגודרות מתח, FSDF יכול לפתור סידורים קונפורמטיביים עצמאיים של ארבעת ה-VSD (מעקב אחר VSD אחד בכל זמן נתון), במקביל למדידות של פונקציית הערוץ. ואכן, באמצעות גישה זו, הוכח כי VSDs בודדים נראים מעורבים באופן דיפרנציאלי בהיבטים ספציפיים של הפעלת ערוץ והשבתה 12,27,28,29,30. זיהוי התרומה של כל VSD לתפקוד הערוצים הוא בעל רלוונטיות גבוהה וניתן להשתמש בו כדי להבהיר עוד יותר את פעולת הערוץ ואולי לזהות מטרות חדשות לפיתוח תרופות.
השימוש ב-FSDF במערכות ביטוי הטרולוגיות סייע רבות בקידום הבנתנו את תפקוד הערוץ מנקודת מבט רדוקציוניסטית10,23. כמו גישות רדוקציוניסטיות רבות, היא מציגה יתרונות אך יש לה גם מגבלות. לדוגמה, מגבלה עיקרית אחת היא בנייה מחדש חלקית של סביבת ננו התעלה במערכת ההטרולוגית. לעתים קרובות, תעלות יונים מתקשרות עם תת-יחידות עזר רבות וחלבונים רבים אחרים המשנים את תפקידם31. באופן עקרוני, תעלות שונות ותת-היחידות הנלוות שלהן יכולות לבוא לידי ביטוי במערכות הטרולוגיות תוך שימוש במבני קידוד חלבונים מרובים או פלסמידים פוליציסטרוניים, אך לא ניתן לשחזר את סביבתם הטבעית במלואה30,32.
הקבוצה שלנו פרסמה לאחרונה גרסה של FSDF בסיבי שריר שלד מנותקים טבעיים לחקר השלבים המוקדמים של צימוד עירור-כיווץ (ECC)33,34, התהליך שבו דפולריזציה חשמלית של סיבי שריר קשורה להפעלת כיווץ שריר 35,36. בפעם הראשונה, גישה זו אפשרה מעקב תנועה של חיישני מתח S4 בודדים מערוץ Ca2+ מגודר מתח מסוג L (CaV1.1, הידוע גם בשם DHPR) בסביבה הטבעית של סיב שריר מובחןבוגר 37. מטרה זו הושגה על ידי התחשבות במאפיינים רבים של סוג תא זה, כולל הפעילות החשמלית של התא המאפשרת דפולריזציה מהירה המושרה על ידי גירוי עצמי, היכולת לבטא פלסמיד cDNA באמצעות אלקטרופורציה in vivo, הביטוי הגבוה הטבעי והארגון המידור של התעלות בתוך התא, והתאמתו למכשירי הדמיה והקלטה אלקטרופיזיולוגית במהירות גבוהה. בעבר, השתמשנו במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת קווים במהירות גבוהה כמכשיר גילוי37. כעת, וריאציה של הטכניקה מוצגת באמצעות פוטודיודה לקליטת אותות. מערכת זיהוי מבוססת פוטודיודות זו יכולה להקל על יישום טכניקה זו במעבדות אחרות.
כאן מתואר פרוטוקול שלב אחר שלב לניצול FSDF בתאים מקוריים לחקר תנועת חיישן מתח בודד מ- CaV1.1. בעוד ערוץ CaV1.1 שימש כדוגמה לאורך כל כתב היד הזה, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על תחומים נגישים מחוץ לתא של תעלות יונים אחרות, קולטנים, או חלבונים פני השטח.

<table><tbody><tr><td>Hyaluronidase</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>H3884-50mg</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ"ל צינור אפנדורף</td><td>Millipore Sigma</td><td>EP022363719-500EA</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z683531-100EA</td><td>tuberculine slip tip</td></tr><tr><td>1/2 אינץ' ארוך 29 מד מחט ומזרק אינסולין סטרילי</td><td>Becton Dikinson</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחת פלסטיק לא מצופה</td><td>פלקון, קורנינג</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פלסטיק לא מצופה 60 מ"מ</td><td>פלקון, קורנינג</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>שוט אלכוהולי</td><td>PDI</td><td>B60307</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-533 קוביית LP</td><td>Chroma</td><td>49907</td><td>Ex: 530/30x; BS: 532; Em: מנורת קשת 550lp</td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrumets</td><td>LB-LS 672</td><td></td></tr><tr><td>קרם דמעות מלאכותי</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית בורוסיליקט פסטר פיפט 5 3/4 אינץ'</td> <td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)</td> <td>SIGMA ALDRICH</td><td>203895</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מסוג I</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>C0130-1g</td><td></td></tr><tr><td>קצה כותנה</td><td>VWR</td><td>VWR-76048-960-BG</td><td></td></tr><tr><td>מערך אלקטרודות כפול&nbsp; (לאלקטרופורציה)</td><td>BTX הרווארד מנגנון</td><td>45-0120</td><td>10 מ"מ 2 קצות מערך מחט</td></tr><tr><td>EGFP קוביית</td><td>Chroma</td><td>39002AT</td><td>Ex: 480/30x; BS 505; EM: מכשיר מכשיר אלקטרופורציה 535/40 מ'</td></tr><tr><td></td><td>BTX מכשיר הרווארד</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>EPC10</td><td>HEKA Elektronik GmbH&nbsp; (הרווארד)</td><td>895000</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ביוטכנולוגיה,&nbsp; מו"פ D Systems</td><td>RND-S11150H</td><td>סרום בקר עוברי - פרימיום, כיסוי זכוכית מושבתת בחום</td></tr><tr><td>צלחת 35 מ"מ</td><td>MatTek Life Science</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr>נוזל<td>איזופלורן</td><td>פלוריסו (איזופלורן) לשאיפה</td><td>502017-250 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום איזותרמית</td><td>Braintree scientific inc</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>תרמו פישר</td><td>INV-23017015</td><td>חלבון עכבר למינין,</td></tr><tr><td>נורת לטקס</td> טבעית <td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>LED 530 ננומטר</td><td>Sutter Instrumets</td><td>5A-530</td><td></td></tr><tr><td>חלבון קושר נמוך 0.2 &mu; מסנן סטרילי m</td><td>Pall</td><td>FG4579</td><td>acrodisk&nbsp; מסנן מזרק 0.2um supor ממברנה נמוכה מחייב חלבון לא פירוגני</td></tr><tr><td></td><td>MEM Invitrogen</td><td>INV-11380037</td><td></td></tr><tr><td>MTS-5-TAMRA</td><td>Biotium</td><td>89410-784</td><td>MTS-5-TAMRA</td></tr><tr><td>OriginPro Analysis Software</td><td>OriginLab Corporation</td><td>OriginPro 2022 (64 סיביות) SR1</td><td></td></tr><tr><td>Photodiode</td><td>בהתאמה אישית</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>PlanApo 60x שמן&nbsp; 1.4 N.A/&infin;/0.17</td><td>Olympus</td><td>BFPC2</td><td></td></tr><tr><td>חוט פלטינה 0.5 מ"מ, 99.9% מתכות בסיס</td><td>SIGMA</td><td>267228-1G</td><td>לייצור אלקטרודה לגירוי שדה</td></tr><tr><td>מחולל דופק</td><td>WPI</td><td>Pulsemaster A300</td><td></td></tr><tr><td>בקר כונן תריס</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>Shuttter</td><td>Uniblitz</td><td>VS2582T0-100</td><td></td></tr><tr><td>S-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>INV-11380037</td><td></td></tr><tr><td>כרית ספסל סטרילית</td><td>VWR</td><td>DSI-B1623</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח סטריליים</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Dow Corning</td><td>1419447-1198</td><td></td></tr><tr><td>וופורייזר להרדמה</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PK</td><td></td></tr><tr><td>כרךtagמחולל</td><td>NA</td><td></td> <td>בהתאמה אישית</td></tr></tbody></table>

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר בתאים מקומיים לחקר עוררות שרירי השלד

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר הייתה הטכניקה הנבחרת לחקור את יחסי מבנה-פונקציה של חלבוני ממברנה רבים, כולל תעלות יונים מגודרות מתח. גישה זו שימשה בעיקר במערכות ביטוי הטרולוגיות כדי למדוד בו זמנית זרמי ממברנה, את הביטוי החשמלי של פעילות התעלות, ומדידות פלואורסצנטיות, המדווחות על סידורים מחדש של תחומים מקומיים. פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר משלבת אלקטרופיזיולוגיה, ביולוגיה מולקולרית, כימיה ופלואורסצנטיות לטכניקה רחבה אחת המאפשרת לחקור סידורים מבניים בזמן אמת ותפקוד באמצעות פלואורסצנטיות ואלקטרופיזיולוגיה, בהתאמה. בדרך כלל, גישה זו דורשת תעלת ממברנה מגודרת מתח מהונדסת המכילה ציסטאין שניתן לבדוק על ידי צבע פלואורסצנטי תגובתי תיול. עד לאחרונה, הכימיה הריאקטיבית של תיול המשמשת לתיוג פלואורסצנטי מכוון אתר של חלבונים בוצעה אך ורק בביציות ובקווי תאים של קסנופוס , מה שהגביל את היקף הגישה לתאים ראשוניים שאינם מעוררים. דו"ח זה מתאר את היישום של פלואורומטריה תפקודית מכוונת אתר בתאי שרירי שלד בוגרים כדי לחקור את השלבים המוקדמים של צימוד עירור-כיווץ, התהליך שבו דפולריזציה חשמלית של סיבי שריר קשורה להפעלת התכווצות שרירים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המתודולוגיות לתכנון והעברה של תעלות Ca2+ מגודרות מתח מהונדסות ציסטאין (CaV1.1) לסיבי שריר של flexor digitorum brevis של עכברים בוגרים באמצעות אלקטרופורציה in vivo ואת השלבים הבאים הדרושים למדידות פלואורומטריה פונקציונאליות מכוונות אתר. גישה זו יכולה להיות מותאמת לחקר תעלות יונים וחלבונים אחרים. השימוש בפלאורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר של שרירי יונקים רלוונטי במיוחד לחקר מנגנונים בסיסיים של עוררות.

כאשר פוטנציאלי פעולה מתפשטים מופעלים בתגובה לגירוי שדה חוזר, ניתן לעקוב אחר תנועת חיישן מתח ספציפי בתגובה לתדר מסוים של דפולריזציה. כפי שניתן לראות באיור 6A, ניתן לעקוב אחר התנועה של סלילים מתויגים VSD-II בתגובה לכל אחד משני דה-פולריזמים עוקבים המופעלים ב-10 הרץ (כלומר, ברווח של 100 אלפיות השנייה). ניתן לתקן הלבנת אותות על-ידי חיסור קו הבסיס לעקבה (איור 6B). הגדלת זמן נוספת בתגובות הראשונה והשנייה (איור 6C) מאפשרת התבוננות מדויקת בת...

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר היא שיטה לחקר תנועות תחום החלבונים בזמן אמת. שינוי טכניקה זו ליישומה בתאים מקומיים מאפשר כעת זיהוי ומעקב אחר תנועות חיישן מתח יחיד מתעלות Ca2+ מגודרות מתח בסיבי שריר שלד מבודדים.

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

CaV1.1, חבר בתעלות היונים מגודרות המתח, כולל ארבעה חיישני מתח נפרדים. ראיות מצביעות על כך שחיישני מתח מסוימים תורמים יותר להפעלת קולטן ריאנודין או לזרם סידן. אנו שואפים להיות מסוגלים לזהות את התפקיד המדויק של כל חיישן מתח בצימוד עירור-התכווצות והפעלת תעלת סידן.צימוד עירור-התכווצות נחקר מאז תחילת שנות ה-50, אך הפרטים המולקולריים של האופן שבו תהליך זה מתרחש עדיין אינם ידועים. ההתקדמות האחרונה במבנה המיקרוסקופי של הצירו-אלקטרונים של התעלה, אפיון חלבון העזר CaV1.1 החדש, גילוי גרסת השחבור החלופית של התעלה וזיהוי מוטציות גורמות למחלות הציתו מחדש את העניין בתחום זה. טכניקות רבות משמשות בתחום שלנו, החל מאלקטרופיזיולוגיה קלאסית וביולוגיה מולקולרית ועד טכניקות חדשניות יותר כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים, סימולציה דינמית מולקולרית, פירוק חלבונים ממוקד ופלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר, כמו גם תאים מהונדסים או מודלים של בעלי חיים.נכון לעכשיו, הדלק עומד בפני מספר אתגרים ניסיוניים. בשרירי שלד, תנועה נכונה ותקשורת בין CaV1.1 ו-RyR1, יחד עם חלבונים רגולטוריים רבים, חיוניים לתמיכה בצימוד עירור-כיווץ. השיטות לחקור ישירות אינטראקציות חלבון-חלבון אלה בין CaV1.1 ו- RyR1 חסרות או חלקיות.מעבדתו של ד"ר מרטין שניידר עובדת על צימוד עירור-התכווצות מזה עשרות שנים, ומאפיינת מנגנוני חישת מתח ב- CaV1.1, שחרור סידן ואירועי שחרור סידן מקומיים, המכונים ניצוצות סידן. לאחרונה, המעבדה שלנו מיישמת טכניקות אופטיות חדשות כדי לחקור שלבים שונים של צימוד עירור-כיווץ ותנועת חיישן מתח בתאי שריר בוגרים מתפקדים. בעוד שזה נעשה בעבר במערכת ביטוי הטרולוגית, הפרוטוקול שלנו מאפשר כעת לעקוב אחר שינויים קונפורמטיביים בחיישני מתח CaV1.1 במהלך פוטנציאל פעולה מופץ בסביבה הטבעית שלו.הטכניקה החדשה שלנו תאפשר לנו לחקור את התנועה המדויקת של חיישן המתח הדרוש לצימוד עירור-כיווץ. אנו רוצים לדעת אילו שאריות מטען בכל S4 הן קריטיות לתפקודו, או בדיוק כל טרנסלוקציה של S4, וכל הטרנסלוקציה קשורה לפתיחת CaV1.1 או להפעלת קולטן ריאנודין.

functional-site-directed-fluorometry-native-cells-to-study-skeletal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים נהלים מפורטים transfection היעילה של DNA פלסמיד לתוך הסיבים של שרירי כף הרגל של עכברים חיים באמצעות electroporation ואת להדמיה הבאות של ביטוי חלבון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

שתואר כאן היא שיטה למדידה ישירה ניצוצות סידן, היחידות יסודי של Ca 2 + שחרור מreticulum sarcoplasmic בסיבי שריר שלד בשלמותה. בשיטה זו משתמשת האוסמוטי-תיווך מתח מפעילה של Ca 2 + שחרור מקולט ryanodine בסיבי שריר מבודדים. יכולים להיות מועסק הדינמיקה ויכולת homeostatic של Ca 2 + איתות תאית כדי להעריך את תפקוד שרירים בבריאות ובחוליים.

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

פרוטוקול זה משתמש באלקטרופורציה כדי להציג ולבטא חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית בסיבי שריר עכברים. לאחר ההתאוששות לאחר אלקטרופורציה, הסיבים מבודדים. לאחר מכן מדמים סיבים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה כדי להמחיש את מבנה השרירים.

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מן רקמת שריר בוגר. תאים אלה משמשים ללמוד בידול שריר השלד במבחנה , בפרט, ללמוד חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות.

בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

אנו מתארים פרוטוקול לקבלת סיבים מנותקים אנזימטית באורכים וסוגים שונים משישה שרירים של עכברים בוגרים: שלושה מהם כבר תוארו (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) ושלושה מהם נותקו בהצלחה בפעם הראשונה (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Mutagenesis האתר בבימויו של פלסמידים כולה היא דרך פשוטה ליצור וריאציות שונות במקצת של הפלסמיד המקורי. כאן אנו מדגימים דרך יעילה קל עלות להציג החלפות בסיס לתוך ריאגנטים באמצעות פלסמיד רגיל.

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

מיקרו גזור טכניקה explants היא שיטה חזקה ואמינה לבידוד שגשוג התאים שריר השלד מן, השרירים נוער למבוגרים או עובריים כמקור לתאי גזע שרירי השלד. באופן ייחודי, התאים האלה כבר נגזר clonally לייצר גזע שריר השלד שורות תאים המשמשים in vivo השתלה.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

פרוטוקול זה מתאר הליך ללמוד את הנשמה של המיטוכונדריה מבודד שרירי השלד. שיטה זו הותאמה מ...

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

למד פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר לחקירת תנועות חיישני מתח בערוצי סידן Kv1.1 בתאי שריר שלד מבודדים מעכברים. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תנועות דומיין חלבון בסביבתן הטבעית ומספקת תובנות לגבי מנגנוני קשר עוררות-כיווץ.

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר בתאים מקומיים לחקר עוררות שרירי השלד

גלה סרטונים נוספים