Name: העשרת ספריית mRNA וביסולפיט-mRNA הכנה לריצוף הדור הבא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: למדו את תפקיד מתילציטוזין ב-RNA בסרטן הלבלב באמצעות ריצוף ביסולפיט-RNA ברזולוציית בסיס יחיד. השיטה מאפשרת זיהוי RNA שונים במתילציה הקשורים להתקדמות הגידול והבדלי דיפרנציאציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה של טייוואן. [NSTC 111-2314-B-006-003]

יצירת ספריות Bisulfite-mRNA חזקות למיפוי רחב תמלול

<ol><li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODOMICS%3A+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2021+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).</li>
<li>Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+5-methylcytosine+%28m5C%29+RNA+Methyltransferases%3A+Mechanisms%2C+Cellular+Functions%2C+and+Links+to+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease.</a> Genes. 10 (2), 102(2019).</li>
<li>Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+methylation+in+plants%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">RNA methylation in plants: An overview.</a> Frontiers in Plant Science. 14, 1132959(2023).</li>
<li>Courtney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitranscriptomic+addition+of+m5C+to+HIV-1+transcripts+regulates+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression.</a> Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).</li>
<li>Jonkhout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+modification+landscape+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The RNA modification landscape in human disease.</a> RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).</li>
<li>Legrand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistically+robust+methylation+calling+for+whole-transcriptome+bisulfite+sequencing+reveals+distinct+methylation+patterns+for+mouse+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs.</a> Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).</li>
<li>Schaefer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+5-methylcytosine+analysis+by+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing.</a> Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).</li>
<li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly%28A%29+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1(2017).</li>
<li>Schumann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+links+between+5-methylcytosine+content+of+mRNA+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation.</a> BMC Biology. 18 (1), 40(2020).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methylcytosine+promotes+mRNA+export+-+NSUN2+as+the+methyltransferase+and+ALYREF+as+an+m5C+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader.</a> Cell Research. 27, 606(2017).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methylcytosine+promotes+pathogenesis+of+bladder+cancer+through+stabilizing+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+activity-associated+alteration+of+mRNA+m%285%29+C+methylation+in+CD4%28%2B%29+T+cells+of+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430(2020).</li>
<li>Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+roles+of+RNA+m5C+modification+and+its+implications+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy.</a> Biomarker Research. 10 (1), 15(2022).</li>
<li>Xue, C., Zhao, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+RNA+cytosine-5+methylation%3A+detection%2C+regulatory+mechanisms%2C+biological+functions+and+links+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer.</a> Biomarker Research. 8 (1), 43(2020).</li>
<li>Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+RNA+modifications+in+the+epitranscriptome%3A+predict+and+validate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+mRNA+5-methylcytosine+modifications%3A+Detection%2C+effectors%2C+biological+functions%2C+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).</li>
<li>Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+RNA+Immunoprecipitation+Assay+to+Study+m5C+Modification+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231(2020).</li>
<li>Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protocols+for+the+illumina+genome+analyzer+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system.</a> Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 18, Unit 18.12 (2009).</li>
<li>Chen, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+bisulfite+sequencing+reveals+NSUN2-mediated+suppression+of+epithelial+differentiation+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer.</a> Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).</li>
<li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+5-hydroxylmethylcytosine+and+RNA+5-methycytosine+reprogramming+during+early+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%2C+Proteomics+%26+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development.</a> Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).</li>
<li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNAs+as+targets+for+cytosine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation.</a> RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+NSUN2+deficiency+on+the+mRNA+5-methylcytosine+modification+and+gene+expression+profile+in+HEK293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells.</a> Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).</li>
<li>Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+mRNA+5-methylcytosine+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).</li>
<li>Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((meRanTK%3A+methylated+RNA+analysis+ToolKit%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit.</a> Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).</li>
<li>Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+oligo-based+depletion+of+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12281(2019).</li>
<li>Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+of+5-methylcytidine+RNA+modifications+in+bacteria%2C+archaea%2C+and+yeast+reveals+m%285%29C+within+archaeal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs.</a> PLoS Genetics. 9 (5), e1003602(2013).</li>
<li>Furlan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+RNA+modification+detection+from+nanopore+direct+RNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data.</a> RNA Biology. 18, 31-40 (2021).</li>
<li>Leger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+modifications+detection+by+comparative+Nanopore+direct+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing.</a> Nature Communications. 12 (1), 7198(2021).</li>
<li>Mateos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+m6A+and+m5C+RNA+modifications+at+single-molecule+resolution+from+Nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+parameters+in+RNA+bisulfite+sequencing+data+generation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22NAR+Genomics+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis.</a> NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045(2022).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+calibration+of+epitranscriptomic+maps+using+a+synthetic+modification-free+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library.</a> Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).</li>
<li>Chao, H. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

בפרוטוקול זה, צנרת מפורטת של העשרת פולי(A), המרת ביסולפיט והכנת ספרייה הושגה על ידי שימוש ברכיבים סטנדרטיים. ניתוח ריצוף נוסף סיפק זיהוי של mRNA 5-methylcytosine בדגימות מעניינות.
השלב הקריטי הוא איכות החומר ההתחלתי - סך כל הרנ"א - שכן פירוק הרנ"א ישפיע על קצב ההתאוששות של טיהור RNA פולי(A). יש לטפל בזהירות בדגימה ולהימנע מזיהום RNase לפני ביצוע שלב טיהור ה- RNA poly(A). חלק מכריע נוסף בהליך הוא מספר מחזורי ה-PCR בהכנת הספרייה. ההחלטה על מספר המחזור תלויה בכמות ה-mRNA המטופל בביסולפיט המשמש לה...

בין למעלה מ-150 סוגים של שינויים שלאחר שעתוק1, זוהה שינוי 5-מתיל-ציטוזין (m5C) בסוגים שונים של RNA, כולל RNA ריבוזומלי, RNA העברה, רנ"א שליח, מיקרו-רנ"א, רנ"א ארוך שאינו מקודד, רנ"א קמרון, רנ"א משפר, ורנ"א קחאל קטן ספציפי לגוף2. הרנ"א m 5 C קשור למגוון מנגנונים ביולוגיים ופתולוגיים כגון ויסות התפתחות שורשי צמחים3, ביטוי גנים נגיפיים4 והתקדמות סרטן5. מטרת פרוטוקול זה היא לספק צינורות יעילים לאפיון פרופיל השינוי רחב התמלול mRNA m5C של דגימות ביולוגיות בשלבי התפתחות שונים או במסגרת המחלה. ריצוף ביסולפיט רחב שעתוק פותח כדי לאפיין את המיקומים ואת רמות המתילציה הכמותית של ציטוזין ב-RNA המומר על ידי ביסולפיט ברזולוציית זוג בסיס 6,7,8,9. זה שימושי במיוחד כאשר חוקרים את הקשר של m5C עם ביטוי גנים וגורל RNA המעורב במנגנוני הבקרה הביולוגיים בתאים. בתא היונקים ידועים שני קוראי m 5 C: ALYREF יכול לזהות m 5 C בגרעין ומשמש כטרנספורטר mRNA גרעין לציטוזול10, בעוד YBX1 יכול לזהות m5C בציטופלסמה ולהגביר את ייצובmRNA11. mRNA חריג m5C הקשור למסלולים חיסוניים דווח בתאי T אדמנתית אדמנתית CD4+12. מחקרים גילו קשר בין mRNA m5C שינוי ומודולציה של חסינות לסרטן והתקדמות סרטן13,14. לפיכך, מיפוי פרופיל השינוי m5C על mRNA יכול לספק מידע חיוני כדי להבהיר את מנגנון הרגולציה הפוטנציאלי.
כדי לחקור את התפקידים הפונקציונליים של שינויRNA m 5 C בתנאים ביולוגיים מסוימים, ניתן לשלב גישות מבוססות המרה ביסולפיט (bsRNA-seq) והעשרת זיקה לנוגדנים כגון m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq ו- 5-Aza-seq עם פלטפורמת הריצוף בתפוקה גבוהה כדי לספק זיהוי יעיל של אזורים ורצפים ממוקדים עם שינויי m5C בקנה מידה רחב של תעתיק15, 16. היתרון של פרוטוקול זה מספק את הנוף המקיף של RNAm 5 C ברזולוציה של בסיס יחיד, שכן הגישה מבוססת העשרת זיקה לנוגדנים מסתמכת על זמינותם של נוגדנים באיכות גבוהה ויכולה להשיג את הרזולוציה של מקטע יחיד של m5C methylation landscape17.
כל דגימות הרנ"א יעובדו בשני סבבים של העשרת mRNA באמצעות חרוזי אוליגו (dT), שלושה מחזורים של תגובת ביסולפיט והכנת ספריית הריצוף. כדי לפקח על איכות הרנ"א, כל דגימת RNA תיבדק על ידי אלקטרופורזה של ג'ל נימי לפני ואחרי הליכי טיהור mRNA ותגובה ביסולפיטית כדי להעריך את התפלגות המקטעים. הספריות המטוהרות ייבדקו על ידי תכונות אמפליקון ה-PCR שלהן, מקטעי פיזור גודל DNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל נימי, והכמויות הכוללות שלהן ייבדקו על ידי בדיקות כמותיות מבוססות צבעים פלואורסצנטיים לפני ריצוף. המערכת יכולה לשמש גם לניתוח ספקטרום רחב של דגימות ביולוגיות כגון תוצרת חקלאית, נגיפים מבודדים, קווי תאים, אורגניזמים לדוגמה ודגימות פתולוגיות.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 אלקטרופורזה מערכת ביואנלייזר</td><td>Agilent, סנטה קלרה, קליפורניה</td><td></td><td>זיהוי איכות RNA</td></tr><tr><td>חרוזי XP טהורים</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63881</td><td>לטהר DNA</td></tr><tr><td>ביואנלייזר DNA ערכת רגישות גבוהה</td><td>Agilent, סנטה קלרה, CA</td><td>5067-4626</td><td>זיהוי איכות DNA</td></tr><tr><td>Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit</td><td>Agilent, סנטה קלרה, CA</td><td>5067-1513</td><td>RNA זיהוי איכות</td></tr><tr><td>DiaMag02 - מתלה מגנטי</td><td>Diagenode, דנוויל, ניו ג'רזי</td><td>הכנת</td><td>ספריית סיוע</td></tr><tr><td>B04000001 DiaMag1.5 - מתלה מגנטי</td><td>Diagenode, דנוויל, ניו ג'רזי</td><td>B04000003</td><td>סיוע לפולי (A) טיהור RNA</td></tr><tr><td>ערכת טיהור Dynabeads mRNA DIRECT Thermo</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>61011</td><td>poly (A) RNA purificaion; מאגר כביסה 1 ומאגר כביסה 2</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>J.T.Baker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מתילציה של RNA EZ</td><td>Zymo, Irvine, CA</td><td>R5002</td><td>טיפול בביסולפיט</td></tr><tr><td>גחלילית לוציפראז mRNA</td><td>Promega, מדיסון, ויסקונסין, ארה"</td>ב <td>L4561</td><td>ספייק בבקרת הבקרה </td></tr><tr><td>ערכות כימות ספריית KAPA</td><td>רוש, שוויץ</td><td>KK4824</td><td>כימות ספרייה</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td>זיהוי כמויות RNA כולל</td></tr><tr><td>NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1)</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>E7335S</td><td>הכנת</td></tr> <tr><td>ספרייהNEBNext Ultra <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/65352/65352eq01.jpg" style="margin: auto; "> ערכת הכנה לספריית RNA כיוונית עבור Illumina</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>E7760S</td><td>הכנת ספריית</td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>P2 פיפטמן</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, MA</td><td>4641010</td><td></td></tr><tr><td>קיוביט 2.0 פלואורומטר </td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td>זיהוי כמויות RNA</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Q32854</td><td>זיהוי כמויות DNA</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Q32852</td><td>זיהוי כמויות RNA</td></tr></tbody></table>

העשרת ספריית mrna וביסולפיט-mrna הכנה לריצוף הדור הבא

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

שינויים לאחר שעתוק RNA בסוגים שונים של תעתיקי RNA קשורים לוויסות RNA מגוון בתאים איקריוטים. שינויים חריגים ב-RNA 5-methylcytosine והביטוי הלא מווסת של RNA methyltransferases הוכחו כקשורים למחלות שונות, כולל סרטן. ריצוף ביסולפיט רחב שעתוק פותח כדי לאפיין את המיקומים ואת רמות המתילציה הכמותית של ציטוזין ב-RNA המומר על ידי ביסולפיט ברזולוציית זוג הבסיס. בזאת, פרוטוקול זה מציג את ההליכים של שני סבבים של טיהור RNA פולי(A), שלושה מחזורים של תגובת ביסולפיט, והכנת ספרייה בפירוט כדי לאפשר מיפוי רחב שעתוק של אתרי שינוי mRNA 5-methylcytosine. הערכת כמות ואיכות ה-RNA לאחר התגובה העיקרית חיונית לניטור שלמות ה-RNA והיא צעד קריטי להבטחת ספריות ריצוף באיכות גבוהה. באופן אידיאלי, ניתן להשלים את ההליכים תוך שלושה ימים. באמצעות פרוטוקול זה, שימוש ב-RNA כולל באיכות גבוהה כקלט יכול למעשה לבנות ספריות ביסולפיט-mRNA חזקות לריצוף הדור הבא מהמדגם המעניין.

סדרה של ספריות bsRNA-seq מקווי תאים19 נוצרו על-ידי ביצוע ההליכים בדוח זה (איור 1). לאחר טיהור RNA כולל המלווה בטיפול DNase המבוצע בדגימות קו תאים ובדיקת האיכות על ידי אלקטרופורזה בג'ל וספקטרופוטומטריה UV-Vis (A260/A280), דגימת ה-RNA יכולה להמשיך להעשרת RNA פולי(A). כדי לקבוע אם הטיהור הכפול יכול להסיר את רוב הרנ"א הריבוזומלי, יעילות הטיהור של רנ"א פולי(A) הוערכה על-ידי בדיקת רנ"א כוללת של אלקטרופורזה נימית שיכולה לחשב באופן אוטומטי את אחוז זיהום ה-rRN...

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה קלה למעקב לביצוע טיהור RNA פולי(A), המרת ביסולפיט והכנת ספרייה באמצעות ציוד סטנדרטי לדגימה ביולוגית מעניינת.

העשרת ספריית mRNA וביסולפיט-mRNA הכנה לריצוף הדור הבא

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...

מחקר זה נועד לחקור את התפקיד של מתילציה RNA, במיוחד שינוי 5-methylcytosine, בסרטן הלבלב. השאלות שאנו רוצים לענות עליהן הן כיצד upregulation או downregulation של RNA methyltransferase מסוימים משפיע על פנוטיפים של תאים סרטניים וגם, שדרכו RNA מצע. מחקר זה מספק את הנוף המקיף של RNA m5C ברזולוציה של בסיס יחיד עם ציוד סטנדרטי.ממחקר זה באמצעות bisulfite RNA seq, התוצאות קושרות את הקשר של שינוי RNA m5C עם התמיינות גרועה של תאים סרטניים. זה אמור לסלול את הדרך למחקרים עתידיים בהבחנה בין השפעות של m5C ספציפי על מניעי נוסעים לעומת מחלות בתמלילי הרנ"א. בעזרת טכניקה זו, אנו יכולים לזהות את הקבוצה של RNA מתילציה דיפרנציאלית שעשויים להשתתף בהתקדמות הגידול.יתר על כן, ניסויים בבסיס מולקולה בודדת יכולים לספק תפקיד רגולטורי מפורט יותר של RNA m5C ספציפי.

enrichment-mrna-bisulfite-mrna-library-preparation-for-next

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים שיטה להכנת שני יחיד לקרוא לזווג Illumina סוף mRNA-Seq ספריות לניתוח רצפי גנים הביטוי מבוסס על הגברה T7-RNA ליניארי. פרוטוקול זה דורש רק 10 ננוגרם של רנ"א הכל החל ומייצר ספריות עקבי מאוד המייצגים תמלילי כולו.

יחיד קרא מותאמים mRNA-Seq סוף Illumina ספריות מ -10 ננוגרם RNA סך הכל

זרימת עבודה יעילה ללמוד מתילציה דנ"א ביטוי שינויים גנטיים על הלחץ מוקדם בחיים מוצג. החל מ הפרידה מן האם של עכברים בני יומם ובידוד של רקמות מוח נפרדים, אנחנו מייצגים את הפרוטוקול בו זמנית לבודד DNA ו-RNA של אגרופים רקמות המוח רצף bisulfite עתידיים RT-PCR ניתוח.

ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ&quot;א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

MicroRNAs (miRNAs) הם סוג של מולקולות רגולטוריות שנשמרו באופן נרחב. כאן אנו מתארים שיטת שיבוט miRNA המסתמכת על שני שלבי קשירה חזקים ואחריהם ריצוף תפוקה גבוהה. השיטה שלנו מאפשרת כימות מדויק בכל הגנום של miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

ייצוג מופחת משופר ריצוף ביסולפיט הוא שיטה להכנת ספריות ריצוף לניתוח מתילציה של DNA המבוססת על עיכול אנזימי הגבלה בשילוב עם המרת ציטוזין ביסולפיט. פרוטוקול זה דורש 50 ננוגרם של חומר התחלתי ומניב נתוני רזולוציית זוגות בסיסים באזורים גנומיים עשירים ב-GC.

משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) היא שיטה לכימות מתילציה של ציטוזין באזורים גנומיים ממוקדים של עניין. שיטה זו משתמשת בהמרת ביסולפיט בשילוב עם הגברת PCR של אזורי יעד לפני ריצוף הדור הבא כדי לייצר כימות מוחלט של מתילציה של DNA ברמה ספציפית לבסיס.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

פרוטוקול זה מתאר שיטת ה-pre-mRNA מיפוי 3' עיבוד אתרי קצה.

3' סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול ואת יישומו של מתיל-Seq, פלטפורמה epigenomic, באמצעות מודל עכברוש לזיהוי שינויים epigenetic הקשורים בחשיפה מתח כרוני. תוצאות מדגימים כי פלטפורמת מתיל-Seq עכברוש הוא מסוגל זיהוי הבדלים מתילציה הנובעים מחשיפה ללחץ אצל חולדות.

פלטפורמה מתיל-Seq חולדה כדי לזהות שינויים Epigenetic הקשורים בחשיפה מתח

אנו מציגים פרוטוקול RNA קטן מפורט של הספרייה רנ א עם פחות הטיה מאשר שיטות סטנדרטיות רגישות מוגברת עבור 2 '-O-מתיל RNAs. פרוטוקול זה יכול להיות בעקבות שימוש ריאגנטים תוצרת בית כדי לחסוך עלות או באמצעות ערכות לנוחות.

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

כאן אנו מתארים את שלבי איסוף המדגם והכנת RIBO-seq בחיידקים. רצף הספריות שהוכנו על פי הנחיות אלה מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים הוא פשוט, משתמש בציוד מעבדה סטנדרטי ולוקח שבעה ימים מן התזה להשגת ספריות.

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבחירה חוץ גופית של מדכאי שעתוק מהונדסים (ETR) עם יעילות השתקה גבוהה, ארוכת טווח, יציבה, על המטרה ופעילות נמוכה מחוץ למטרה. תהליך עבודה זה מאפשר לצמצם רפרטואר ראשוני ומורכב של תעודות סל מועמדות לרשימה קצרה, המתאימה להערכה נוספת במסגרות רלוונטיות מבחינה טיפולית.

במבחנה בחירת מדכאי שעתוק מהונדסים להשתקה אפיגנטית ממוקדת

למדו את תפקיד מתילציטוזין ב-RNA בסרטן הלבלב באמצעות ריצוף ביסולפיט-RNA ברזולוציית בסיס יחיד. השיטה מאפשרת זיהוי RNA שונים במתילציה הקשורים להתקדמות הגידול והבדלי דיפרנציאציה.

העשרת ספריית mRNA וביסולפיט-mRNA הכנה לריצוף הדור הבא

גלה סרטונים נוספים