Name: יצירת פודוציטים שמקורם במטופל מביופסיות עור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: חקור שיטה ליצירת פודוציטים ספציפיים למטופל מתאי פיברובלסט עור באמצעות תכנות מחדש אפיזומלי לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. מודל זה מאפשר מחקר מדויק של מחלות כליה ופיתוח טיפולים מותאמים אישית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) של אוניברסיטת פרידריך אלכסנדר ארלנגן-נירנברג עם מספר המענק M4-IZKF-F009 שניתן ליאנינה מולר-דייל, ועל ידי Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) תחת שם הפרויקט STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, מענק מספר 01GM2202D שניתן ליאנינה מילר-דיל. אנו מודים לאנאלנה קראוס על התמיכה בצילום תמונות SEM.

שימוש בביופסיות עור ליצירת פודוציטים שמקורם במטופל

<ol><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li>
<li>Grgic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+podocyte+foot+processes+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).</li>
<li>Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+podocyte+slit+diaphragm-from+a+thin+grey+line+to+a+complex+signalling+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub.</a> Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).</li>
<li>Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+glomerular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of glomerular permeability.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).</li>
<li>Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+complexity+of+the+podocyte+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).</li>
<li>Muller-Deile, J., Schiffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+directed+therapy+of+nephrotic+syndrome-can+we+bring+the+inside+out%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out.</a> Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).</li>
<li>Boehlke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hantavirus+infection+with+severe+proteinuria+and+podocyte+foot-process+effacement%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Diseases%22%5BJournal%5D)">Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement.</a> American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).</li>
<li>Schiffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+actin-dependent+dynamin+oligomerization+ameliorates+chronic+kidney+disease+in+diverse+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models.</a> Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).</li>
<li>Kopp, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Podocytopathies.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68(2020).</li>
<li>Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+podocytopathies%3A+a+unifying+view+of+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases.</a> Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).</li>
<li>Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+differentiation+in+cultured+rat+and+human+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+line+demonstrating+nephrin+and+podocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).</li>
<li>Eto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+protection+by+darbepoetin%3A+preservation+of+the+cytoskeleton+and+nephrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression.</a> Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).</li>
<li>Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+methods+of+glomerular+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+%26+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Culture methods of glomerular podocytes.</a> Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).</li>
<li>Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+expression%2C+behaviors%2C+and+responses+vary+in+different+lines+of+conditionally+immortalized+cultured+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).</li>
<li>Shih, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD2AP+localizes+to+the+slit+diaphragm+and+binds+to+nephrin+via+a+novel+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain.</a> The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).</li>
<li>Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+is+critical+for+the+plasma+membrane+localization+of+nephrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipping+your+feet+in+the+water%3A+podocytes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Dipping your feet in the water: podocytes in urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).</li>
<li>Camici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+detection+of+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Urinary detection of podocyte injury.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).</li>
<li>Muller-Deile, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+preeclampsia+induced+microRNA-26a-5p+leads+to+proteinuria+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3621(2018).</li>
<li>Schenk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+focal+segmental+glomerulosclerosis+%28FSGS%29+factor+suPAR+using+CytoSorb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb.</a> Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).</li>
<li>Petermann, A., Floege, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+damage+resulting+in+podocyturia%3A+a+potential+diagnostic+marker+to+assess+glomerular+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron.+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity.</a> Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).</li>
<li>Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+excretion+of+viable+podocytes+in+health+and+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).</li>
<li>Petermann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+that+detach+in+experimental+membranous+nephropathy+are+viable%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable.</a> Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).</li>
<li>Sakairi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+lines+established+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).</li>
<li>Rauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+iPSCs+into+functional+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human iPSCs into functional podocytes.</a> PLoS One. 13 (9), e0203869(2018).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+human+somatic+reprogramming+to+iPS+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell.</a> Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).</li>
<li>Bang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+episomal+reprogramming+for+generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts.</a> Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li>
<li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).</li>
<li>Hoffding, M. K., Hyttel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+visualization+of+the+Mesenchymal-to-Epithelial+Transition+during+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Bharathan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+markers+used+for+the+identification+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells.</a> Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+more+than+a+proliferation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li>
<li>Vaz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+after+induced+pluripotent+stem+cells+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming.</a> Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147(2021).</li>
<li>Reiser, J., Altintas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Podocytes.</a> F1000Research. 5, 114(2016).</li>
<li>Ohmori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+NEPHRIN+localization+in+kidney+organoids+derived+from+nephrotic+patient+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 3982(2021).</li>
<li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול מבוסס תרבית תאים זה משלב תכנות אפיזומלי מחדש של פיברובלסטים עוריים אנושיים לתוך hiPSCs ספציפיים למטופל ולאחר מכן התמיינות לפודוציטים שמקורם ב- hiPSC. זה מאפשר לנו לחקור שינויים הקשורים למוטציות של פודוציטים מחולים עם מחלה גלומרולרית גנטית בנוגע לפגיעה בפודוציטים. הפרוטוקול לתכנות מחדש של פיברובלסטים עוריים בשיטה נטולת אינטגרציה על ידי אלקטרופורציה מעובד מעבודתם של Bang et al.32 ו- Okita et al.33. הפרוטוקול להבדיל פודוציטים מ-hiPSCs מותאם מהפרוטוקול שפורסם על ידי Musah et al.28,34,35. ישנם כבר פרסומים זמינים המתארים את הדור של פודוציטים מ hiPSCs 27,34,35. עם זאת, הפרוטוקול המסופק כאן הוא אופטימלי וזול יותר לגבי ההבחנה של hiPSCs לתוך פודוציטים. בהשוואה לפרוטוקול שפורסם על ידי Musah et al., בדקנו פרוטוקול זה על ריאגנטים ציפוי שונים, כמו ויטרונקטין, משי למינין-511, ומטריצת קרום מרתף מסיס. ניתן להוריד את ריכוזי ויטרונקטין ולמינין משי-511 ל-2.5 מיקרוגרם/מ"ל במקום 5 מק"ג/מ"ל 28,34,35. יתר על כן, ניתן היה להפחית את ריכוזי BMP7 והפעלת A - שני גורמי גדילה יקרים מאוד - ב -50%, מ -100 ננוגרם/מ"ל ל -50 ננוגרם/מ"ל.
זה מאפשר בידול זול יותר. תאי אב של נפרון מהיום השביעי עדיין התרבו, והאפשרות לקפוא הודגמה בעבר. הרחבנו תאים אלה לאחר ההפשרה ולפני התמיינות סופית בתווך בסיסי המכיל את מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) ו-B27 למשך מספר ימים, והפחתנו את העלויות עוד יותר. בנוסף לשלבי ההתמיינות, פרוטוקול זה מתאר את הצמיחה של פיברובלסטים מביופסיות עור עם הדור הבא של hiPSCs ספציפיים למטופל באמצעות תכנות מחדש אפיזומלי. השילוב של שתי שיטות אלה מאפשר יצירת פודוציטים ספציפיים למטופל. לכן, פרוטוקול מלא שלב אחר שלב ליצירת פודוציטים ספציפיים למטופל הנגזרים מ- hiPSC מסופק כאן שלא תואר קודם לכן בפירוט כזה.
מכיוון שהפרוטוקול הכולל כולל מספר סוגי תאים שונים, חיוני לאפיין את סוגי התאים שנוצרו בשלבים שונים. התאים נמצאים בתרבית במשך תקופה ממושכת של זמן, ולכן בקרת איכות צריכה להתבצע במעברים שונים. כאשר עובדים עם hiPSCs, הזנה יומית, כמו גם התנהגות התא ניטור מורפולוגיה הוא הכרחי. יש להבטיח סטריליות של אמצעי הבידול על ידי עיקור מסנן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר. הפרוטוקול כולו, מביופסיה של העור ועד פודוציטים שמקורם ב-hiPSC, אורך מספר חודשים, אך ניתן להקפיא את התאים בשלבים שונים של התהליך. ניתן להקפיא פיברובלסטים, שיבוטים נבחרים של hiPSC ותאי אב נפרון שגשוגיים לאחר 7 ימים במדיום התמיינות האב של נפרון, וליצור בנק תאים פעיל.
אף על פי שפודוציטים בריאים שמקורם ב-hiPSC מפתחים רשת נפרדת של תהליכים ראשוניים ומשניים ברגל (איור 5A,B) ומבטאים סמן ספציפי טיפוסי לפודוציטים (איור 6A-C), קשה לחקות דיאפרגמות חריץ אופייניות, כפי שניתן לראות in vivo, במודלים קלאסיים של תרביות תאים דו-ממדיות. יתר על כן, תקשורת בין-תאית עם סוגי תאים גלומרולריים אחרים אינה אפשרית בסביבה מונו-תרבותית זו.
בשל מצבם המובחן הסופי וחוסר יכולת ההתפשטות, קשה לחקור פודוציטים ex vivo. בעזרת הנצחת פודוציטים ראשוניים מותנים, ניתן להתגבר על מגבלה זו על ידי החדרת מתג רגיש לחום, וכתוצאה מכך מודל תרבית תאים שבו תאים מתרבים ב 33 ° C ו להתמיין ב 37 ° C13,14. למרות שלציפודוציטים אלה יש פוטנציאל גבוה לחקר פודוציטים, ישנן מגבלות, כמו חוסר ביטוי סמן, מורפולוגיה לא מובחנת, וכישלון ביצירת תהליכי כף רגל15,16.
ההתמיינות של פודוציטים מתאים סומטיים שמקורם בחולה מאפשרת יצירה והשוואה של פודוציטים חולים עם תאי ביקורת בריאים ex vivo. זה מאפשר לנו לחקור נזק לפודוציטים עקב מוטציות בגנים ספציפיים לפודוציטים. יתר על כן, לעבודה עם hiPSCs יש פוטנציאל ליצירת מודלים תלת מימדיים של מחלות תרבית תאים, או ליתר דיוק אורגנואידים43,44. תרבית משותפת של פודוציטים שמקורם ב-hiPSC עם תאים גלומרולריים אחרים, כמו תאי אנדותל גלומרולריים או תאים מזנגיאליים, עשויה להוביל לתובנות חדשות בנוגע לתקשורת בין-תאית בבריאות ובמחלות גלומרולריות.
יתר על כן, ניתן לבצע אפיון וטיפול בפודוציטים הספציפיים למטופל ex vivo בניתוח תפוקה גבוהה. הגישה האינדיבידואלית פותחת הזדמנות לחקור מטרות טיפוליות חדשות למוטציות ספציפיות ולבצע רפואה מותאמת אישית בעתיד.

פודוציטים הם תאי אפיתל כליות מיוחדים, פוסט-מיטוטיים, היוצרים את מחסום הסינון הגלומרולרי של הכליה יחד עם קרום המרתף הגלומרולרי (GBM), תאי אנדותל גלומרולריים וגליקוקליקס. באופן פנוטיפי, פודוציטים מורכבים מגוף תא ושלוחות קרום ראשוניות מונעות מיקרוטובול, כמו גם שלוחות משניות הנקראות תהליכי כף רגל 1,2. מחסום הסינון הגלומרולרי המסנן שתן מהדם בנוי מאנדותל פנסטרציה, GBM, וסוג מיוחד של צומת בין-תאי המחבר בין תהליכים רגליים פודוציטים שכנים, הנקרא דיאפרגמת החריץ של פודוקטיאס3. בתנאים בריאים, חלבונים גדולים יותר מאלבומין נשמרים ממחסום הסינון בשל גודלם ומטענם4.
מוטציות בגנים ספציפיים לשלד או פודוציטים, כמו גם גורמים במחזור הדם המשפיעים על מסלולי איתות פודוציטים, ידועים כגורמים להתפוגגות פודוציטים, ניתוק או אפופטוזיס, וכתוצאה מכך פרוטאינוריה וטרשת גלומרולרית. בפרט, סידור מחדש של שלד ציטוס, שינויים בקוטביות פודוציטים או נזק של תהליכים ברגל עם אובדן הקשור של צמתים חריצים הם מרכזיים5. בשל מעמדם המובחן הסופני, פודוציטים בקושי ניתן להחליף לאחר ניתוק של GBM. עם זאת, אם פודוציטים מחוברים לגליובלסטומה, הם עדיין יכולים להתאושש מהתפוגגות ולתקן תהליכי רגל בין-ספרתיים 6,7,8. הבנה נוספת של האירועים המובילים לנזקי פודוציטים בהפרעות גלומרולריות שונות עשויה לספק מטרות טיפוליות חדשות שיסייעו בפיתוח טיפולים למחלות אלה. נזק לפודוציטים הוא סימן היכר של מחלות גלומרולריות שונות, כולל גלומרולוסקלרוזיס סגמנטאלי מוקדי (FSGS), נפרופתיה סוכרתית, מחלת שינוי מינימלי וגלומרולונפרופתיה קרומית, הדורשת מודלים אמינים של פודוציטים ex vivo כדי לחקור את המנגנונים הפתולוגיים וגישות הטיפול האפשריות במחלות אלה 9,10. פודוציטים ניתן לחקור ex vivo על ידי תרבית תאים ראשונית קלאסית המבוססת על בידוד של glomeruli על ידי מסננת דיפרנציאלית11. עם זאת, בשל המצב הממוין הסופני עם יכולת התפשטות מוגבלת, רוב החוקרים משתמשים בקווי תאי ציפודוציטים עכבריים או אנושיים המבטאים גרסאות רגישות לטמפרטורה של אנטיגן T גדול SV40. לחלופין, ciPodocytes מבודדים מעכברים טרנסגניים הנושאים את הגן SV40 Tag immortalizing gene 1,12.
CiPodocytes להתרבות ב 33 ° C, אבל להיכנס לעצור צמיחה ולהתחיל להתמיין ב 37 ° C13,14. יש לזכור כי נתונים ניסיוניים המתקבלים עם תאים אלה יש לפרש בזהירות מסוימת, כמו התאים נוצרים באמצעות החדרת גן לא טבעי15. מכיוון שלתאים אלה יש גן בן אלמוות, הפיזיולוגיה התאית משתנה בגלל התרבות מתמשכת12. קווי תאי פודוציטים שנוצרו על ידי גישה זו נחקרו לאחרונה, שכן ציפודוציטים של עכברים, בני אדם וחולדות מבטאים פחות מ-5% מהסינפטודין והנפרין ברמת החלבון, כמו גם NPHS1 ו-NPHS2 ברמת ה-mRNA בהשוואה לביטוי גלומרולרי16. יתר על כן, רוב קווי תאי פודוציטים אינם מבטאים נפרין17,18. Chittiprol et al. תיארו גם הבדל משמעותי בתנועתיות התאים ובתגובות לפורומיצין ודוקסורוביצין בציפודוציטים16. פודוציטים ניתן למצוא בשתן לאחר ניתוק מהגליובלסטומה במחלות גלומרולריות שונות 19,20,21,22. פודוציטים ברי קיימא בשתן ניתן לטפח ex vivo עד 2-3 שבועות, אבל רוב התאים עוברים אפופטוזיס23,24. באופן מעניין, פודוציטים נמצאים לא רק בשתן של חולים עם מחלה גלומרולרית אלא גם בשתן של נבדקים בריאים, ככל הנראה כאשר הם מזדקנים שוב עם פוטנציאל מוגבל של שכפול בתרבית24. יתר על כן, מספר הפודוציטים שמקורם בשתן מוגבל, והתאים מתמיינים בתרבית, מראים פחות תהליכים ברגל, משנים מורפולוגיה, והכי חשוב יש להם יכולת התפשטות מוגבלת. הביטוי של גנים ספציפיים לפודוציטים נעדר, נעלם תוך מספר שבועות, או משתנה בין שיבוטים אלה של תאים. חלק מהתאים החיוביים לסמן הספציפי לפודוציטים ביטאו יחד את הסמן של תאי אפיתל צינוריים או מיופיברובלסטים ותאים מזנגיאליים, מה שמרמז על דה-דיפרנציאציה ו/או התמיינות של פודוציטים בתרבית בשתן24,25.
לאחרונה, הדור של שורות תאי ciPodocyte שמקורם בשתן של חולים ומתנדבים בריאים על ידי התמרה עם אנטיגן SV40 גדול T רגיש לחום ו- hTERT תואר26. זוהה ביטוי mRNA עבור סינפטודין, נסטין וחלבון הקשור ל-CD2, אך פודוצין mRNA נעדר בכל השיבוטים. בנוסף לבעיות עם פודוציטים בשתן, תאים אלה מכילים גם את הגן אימורטליזציה החדר, וכתוצאה מכך את החסרונות שנדונו לעיל.
לעומת זאת, לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) יש יכולת עצומה לחדש את עצמם ולהתמיין למספר סוגי תאים בתנאים מתאימים. הוכח בעבר כי hiPSCs יכולים לשמש כמקור כמעט בלתי מוגבל של פודוציטים27,28.
כאן, מתואר פרוטוקול דו-שלבי ליצירת פודוציטים ספציפיים למטופל מפיברובלסטים עוריים של ביופסיות ניקוב עור, עם תכנות אפיזומלי מחדש לאחר מכן ל-hiPSCs והתמיינות סופית לפודוציטים שמקורם ב-hiPSC (איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig01.jpg"> איור 1: פרוטוקול ליצירת פודוציטים שמקורם ב-hiPSC ספציפיים למטופל. סקירה גרפית של הפרוטוקול ליצירת פודוציטים ספציפיים למטופל מפיברובלסטים עוריים של ביופסיית עור על ידי תכנות מחדש ל- hiPSCs והתמיינות לפודוציטים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כצעד ראשון, פיברובלסטים עוריים סומטיים גדלו מביופסיה של ניקוב העור ותוכנתו מחדש ל-hiPSCs בשיטה נטולת אינטגרציה על ידי אלקטרופורציה עם פלסמידים המבטאים את גורמי השעתוק OCT3/4, KLF4, SOX2 ו-c-MYC 29,30,31. מושבות hiPSC שקמו נבחרו לאחר מכן והורחבו. ההתמיינות החלה עם השראת השושלת המזודרמלית על ידי הפעלת מסלול האיתות WNT, ואחריה יצירת תאי אב של נפרון שעדיין היו מסוגלים להתרבות. לבסוף, התאים התמינו לפודוציטים. בהליך זה, שינינו ושילבנו פרוטוקולים שפורסמו בעבר לתכנות מחדש אפיזומלי ליצירת hiPSCs על ידי Bang et al.32 ו- Okita et al.33, כמו גם פרוטוקול להבחנה של hiPSCs לפודוציטים על ידי Musah et al.28,34,35.
ואכן, לפודוציטים שנוצרו על ידי הפרוטוקול שלנו היה פנוטיפ קרוב יותר לפודוציטים in vivo, לגבי התפתחות רשת מובחנת של תהליכים ראשוניים ומשניים ברגל וביטוי של סמנים ספציפיים לפודוציטים, כמו סינפטודין, פודוצין ונפרין. עם השימוש בפודוציטים שמקורם ב- hiPSC, הרקע הגנטי של המטופל נשמר במהלך תכנות מחדש והתמיינות. זה מאפשר מידול מחלת פודוציטים ספציפית למטופל וגילוי של חומרים טיפוליים פוטנציאליים ex vivo במספר תאים כמעט בלתי מוגבל. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא זעיר פולשני, חסכוני, מקובל מבחינה אתית ועשוי להקל על אפיקים חדשים לפיתוח תרופות.

<table><tbody><tr><td>0.2 ומיקרו; m מסנן סטרילי</td><td>Rotilab</td><td>P668.1</td><td>לעיקור של מדיום התמיינות</td></tr><tr><td>חומצה רטינואית טראנס</td> תוסף <td>תאי גזע</td><td>72262</td><td>להתמיינות</td></tr><tr><td>תוסף B27 (50 x),</td> תוסף <td>Gibco</td><td>17504044</td> ללא סרום <td>להתמיינות ללא סרום בינוני</td></tr><tr><td>BG iMatrix-511 Silk</td><td>biogems</td><td>RL511S</td><td>אפשרות נוספת של מגיב מטריצה חוץ-תאית המשמש בתמיסת ציפוי לציפוי פלסטיק תרבית תאים המתאים לתרבית hiPSC</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)&nbsp;</td><td>Roth</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR כובע מסנן צלוחיות תרבית תאים, T75, 250 מ"ל</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>82050-856</td><td>פלסטיק תרבית תאים מתאים לתרבית פיברובלסטים</td></tr><tr><td>CHIR99021 (5 מ"ג)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>252917-06-9&nbsp;</td><td>תוספת לבידול</td></tr><tr><td>קורנינג מטריגל מטריצה מוסמכת hESC&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>354277</td><td>אפשרות נוספת של מגיב מטריצה חוץ-תאית המשמש בתמיסת ציפוי לציפוי פלסטיק תרבית תאים המתאים לתרבית hiPSC (מטריצת קרום מרתף מסיסה)</td></tr> <tr><td>שקופיות תא ספירת תאים</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>לספירת תאים</td></tr><tr><td>רוזנת II FL&nbsp; מונה תאים אוטומטי</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>לספירת תאים</td></tr><tr><td>צינורות cryoPure, 2 מ"ל, מכסה בורג QuickSeal,</td> קריוביאלים <td>לבנים Sarstedt</td><td>72380</td><td>להקפאת תאים</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)&nbsp;</td><td>Roth</td><td>A994.1</td><td>למדיום הקפאה פיברובלסטים</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1 x)</td> <td>Gibco</td><td>11320074</td><td>מדיום בסיסי להתמיינות</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>מדיום בסיסי למדיום פיברובלסטים</td></tr><tr><td>EVOS M5000 מערכת הדמיה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td>מיקרוסקופ ניגודיות</td></tr><tr><td>פאזה סרום בקר עוברי פרימיום, מושבת (FCS)</td><td>סרום PAN Biotech</td><td>P301902</td><td>למדיום פיברובלסטים, מדיום הקפאת פיברובלסטים ומדיום תחזוקת פודוציטים</td></tr><tr><td>Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, מרווח 4 מ"מ, 800 ומיקרו; קיבולת L, קובטה סטרילית</td><td>של Fisherbrand</td><td>FB104</td><td>המשמשת לאלקטרופורציה/תכנות מחדש אפיזומלי של פיברובלסטים (פער של 4 מ"מ)</td></tr><tr><td>fluoromount-G מדיום הרכבה, עם מדיום הרכבה DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td>המכיל</td></tr><tr><td>מחט מד dapi (0.6 x 30 מ"מ)</td> <td>BD Microlance3</td><td>300700</td><td>להפרדת מושבות hiPSC לחתיכות קטנות</td></tr><tr><td>חלבון רקומביננטי אנושי Activin A</td><td>78001.1</td> תוסף <td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>להתמיינות</td></tr><tr><td>חלבון מורפוגנטי עצם רקומביננטי אנושי 7 (BMP7)</td> <td>Peprotech</td><td>120-03P</td><td>תוסף להתמיינות</td></tr><tr><td>אנושית VEGF-165 חלבון רקומביננטי</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td></td><td>PHC9394 תוסף להתמיינות</td></tr><tr><td>אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS -G) (100 x)</td> <td>תוסף Gibco</td><td>41400045</td><td>עבור מדיום תחזוקת פודוציטים</td></tr><tr><td>LB בינוני</td><td>Roth</td><td>X964.1</td><td>לבדיקת סטריליות של תרבית hiPSC</td></tr><tr><td>תצפית Mycoplasma PCR ערכת זיהוי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>MP0035-1KT</td><td>ערכת זיהוי מיקופלזמה מסחרית</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>Diagonal GmbH & Co.KG</td><td>21,102</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-שפופרת 1.5 מ"ל&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 ערכה מלאה</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>85850</td><td>מדיום בסיסי לתרבית hiPSC ללא סרום</td></tr><tr><td>מדיום הקפאת נלג'ן מיכל הקפאה מר פרוסטי</td><td>רוט</td><td>AC96.1&nbsp;</td><td>כדי להבטיח תנאי הקפאה אופטימליים</td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>ABCAM</td><td>AB 7481</td><td>לתמיסת קדם דגירה ונוגדנים מדלל</td></tr><tr><td>nunc 24 צלחות באר</td><td>Thermo Scientific</td><td>142485</td><td>פלסטיק תרבית תאים מתאים לתרבית hiPSC</td></tr><tr><td>nunc 48 צלחות באר&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>152640</td><td>פלסטיק תרבית תאים מתאים לתרבית hiPSC</td></tr><tr><td>nunc 6 צלחות באר&nbsp;</td>פלסטיק תרבית תאים <td>140685</td> <td>Thermo Scientific</td><td>מתאים לתרבית hiPSC</td></tr><tr><td>nunc EasYDish כלים 100 מ"מ</td><td>פלסטיק תרבית תאים Thermo Scientific 150466 מתאים לתרבית hiPSC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Careated, Flat-Bottom Microplate</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>פלסטיק תרבית תאים מתאים לתרבית hiPSC</td></tr><tr><td>nutriFreez D10 Cryoconservation Medium</td><td>סרטוריוס</td><td>05-713-1E&nbsp;</td><td>מדיום שימור בהקפאה ללא סרום לשימור בהקפאה של תאי אב hiPSC ונפרון</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>מדיום אלקטרופורציה&nbsp;</td></tr><tr><td>pCXLE-hMLN</td><td>Addgene</td> <td># 27079</td><td>פלסמיד לתכנות מחדש אפיזומלי</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3 / 4 פלסמיד</td><td>Addgene</td> <td># 27077</td><td>פלסמיד לתכנות מחדש אפיזומלי</td></tr><tr><td>pCXLE-hSK פלסמיד</td><td>Addgene</td> <td># 27078</td><td>פלסמיד לתכנות מחדש אפיזומלי</td>פניצילין-סטרפטומיצין</tr><tr><td></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4333-100ML</td><td>למניעת זיהום חיידקי</td></tr><tr><td>פלסטיק כיסויים</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp; 83.1840.002</td><td>לצביעה אימונופלורסנט של hiPSCs ופודוציטים שמקורם ב-hiPSC</td></tr><tr><td>ROTI Histofix</td><td>Roth</td><td>P087.3</td><td>פרפורמלדהיד מסחרי (4%) לקיבוע תאים</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td>מדיום בסיסי לתחזוקת פודוציטים</td></tr><tr><td>תא צביעה בינוני StainTray מכסה שחור</td><td>Roth</td><td>HA51.1</td><td></td></tr><tr><td>stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>תמיסת ניתוק תאים אנזימטית המשמשת לדיסוציאציה של hiPSCs</td></tr><tr><td>פוספט סטרילי חוצץ מלח (PBS) (1 x)</td> <td>Gibco</td><td>14190094</td><td>המשמש לשטיפה וציפוי</td></tr><tr><td>מים סטריליים</td> מזרק <td>Roth</td><td>T1432</td><td></td></tr><tr><td>ללא מחט 20 מ"ל</td><td>BD Plastipak</td><td>300629</td><td>לסינון עיקור התמיינות</td></tr><tr><td>בינונית TC צלחת 100 מ"מ</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td>פלסטיק תרבית תאים סטרילית המשמשת לחיתוך ביופסיית העור ותרבית פיברובלסטים</td></tr><tr><td>צלחת TC 35 מ"מ</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,900</td><td>פלסטיק תרבית תאים סטריליים המשמש לצמיחת פיברובלסטים מביופסיית העור</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td>לתמיסת קדם דגירה&nbsp;</td></tr><tr><td>trypan Blue Stain (0.4%) לשימוש עם Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>לספירת תאים</td></tr><tr><td>trypsin-EDTA (10 x)&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>X0930-100</td><td>מגיב דיסוציאציה המשמש לפיברובלסטים ותאי אב נפרון</td></tr><tr><td>צינור 15 מ"ל</td><td>גריינר ביו-אחד</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>צינור 50 מ"ל</td><td>גריינר ביו-אחד</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>ויטרונקטין ACF</td><td>Sartorius</td><td>05-754-0002</td><td>מגיב מטריצה חוץ-תאית המשמש בתמיסת ציפוי לציפוי פלסטיק תרבית תאים המתאים לתרבית</td></tr> <tr><td>hiPSCY-27632 דיהידרוכלוריד (10 מ"ג)</td><td>טוקריס</td><td>1254</td><td>למניעת אפופטוזיס של hiPSCs במהלך פיצול</td></tr> <tr><td><חזק>נוגדנים ראשוניים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60093.1</td><td>סמן פלוריפוטנטיות, דילול 1:200</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60062FI.1</td><td>סמן פלוריפוטנטיות, דילול 1:100</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>סמן התפשטות, דילול 1:300</td></tr><tr><td>סינפטופודין</td><td>Proteintech</td><td>21064-1-AP</td><td>סמן ספציפי לפודוציטים, דילול 1:200</td></tr><tr><td>נפרין</td><td>פרוגן</td><td>סמן ספציפי לפודוציטים GP-N2</td><td>, דילול 1:25</td></tr><tr><td>פודוצין</td><td>פרוטאינטק</td><td>20384-1-AP</td><td>סמן ספציפי לפודוציטים, דילול 1:100</td></tr><tr><td>><נוגדנים משניים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עזים נגד חזיר ניסיונות IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21435</td><td>משני וגוף, דילול 1:1000</td></tr><tr><td>ערכת alexa Fluor 647 עז נגד ארנב SFX,</td><td>Invitrogen</td><td>A31634</td> משני נספג מאוד<td>, דילול 1:1000</td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>משני וגוף, דילול 1:1000</td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>משני וגוף, דילול 1:1000</td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>משני וגוף, דילול 1:1000</td></tr></tbody></table>

יצירת פודוציטים שמקורם במטופל מביופסיות עור

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

פודוציטים הם תאי אפיתל היושבים באתר השתן של מחסום הסינון הגלומרולרי התורמים לתפקוד המסנן הסלקטיבי של הגלומרולוס. מוטציות בגנים ספציפיים לפודוציטים יכולות לגרום לגלומרולוסקלרוזיס סגמנטאלי מוקדי (FSGS), ופודוציטים מושפעים גם בנפרופתיות ראשוניות ומשניות רבות אחרות. בשל אופיים המובחן, מודלים ראשוניים של תרביות תאים מוגבלים עבור פודוציטים. לכן, בדרך כלל תאים אימורטליים מותנה משמשים. עם זאת, לפודוציטים מותנים מותנים אלה (ciPodocytes) יש מספר מגבלות: התאים יכולים להתמיין בתרבית, במיוחד כאשר הם מגיעים למפגש, וכמה סמנים ספציפיים לפודוציטים מתבטאים רק מעט או לא באים לידי ביטוי כלל. זה מעמיד בסימן שאלה את השימוש בציפודוציטים ואת יישומם להגעה פיזיולוגית, פתופיזיולוגית וקלינית. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת פודוציטים אנושיים - כולל פודוציטים ספציפיים למטופל - מביופסיה של ניקוב העור על ידי תכנות אפיזומלי מחדש של פיברובלסטים עוריים ל- hiPSCs ולאחר מכן התמיינות לפודוציטים. פודוציטים אלה דומים לפודוציטים in vivo הרבה יותר טוב מבחינת מאפיינים מורפולוגיים, כמו התפתחות תהליכים ברגל וביטוי הסמן הספציפי לפודוציטים. לבסוף, אך חשוב, תאים אלה שומרים על המוטציות של החולים, וכתוצאה מכך מודל אקס ויו משופר לחקר מחלות פודוציטים וחומרים טיפוליים פוטנציאליים בגישה אישית.

בעזרת פרוטוקול שלב אחר שלב זה המשלב תכנות מחדש אפיזומלי והתמיינות, ניתן ליצור פודוציטים הנושאים מוטציה של מטופל בגן רלוונטי לפודוציטים. זה מאפשר ניתוח של שינויים פודוציטים ספציפיים למחלה ex vivo. הרקע הגנטי של המטופל נשמר במהלך הפרוטוקול בכל שלבי התא השונים. בנוסף, ניתן להתגבר על המגבלה של מספר תאים לא מספיק של פודוציטים ממוינים סופניים שאינם מתרבים באמצעות פודוציטים שמקורם ב- hiPSC. אף על פי שלוקח כמה חודשים עד ש-hiPSC-פודוציטים נוצרים מפיברובלסטים עוריים שגדלו באמצעות תכנות מחדש ל-hiPSCs ולאחר מכן התמיינות לפודוציטים, אפשר להקפיא תאים בשלושה שלבים שונים של הפרוטוקול (איור 2). הקפאה אפשרית עבור פיברובלסטים, hiPSCs, ותאי אב נפרון לאחר התמיינות בתווך התמיינות אב נפרון במשך 7 ימים. לכן, הדור של בנק תאים עובדים וניסויים בקנה מידה גדול אפשרי.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig02.jpg"> איור 2: שלבים בודדים של הפרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. (A) פיברובלסטים עוריים שגדלו החוצה. (B) היווצרות מושבת hiPSC לאחר תכנות מחדש. (C) תרבות hiPSC נבחרת. (D) תאי מזודרם לאחר יומיים של התמיינות. (E) תאי אב של נפרון לאחר 14 יום של התמיינות בתווך התמיינות אב נפרון. (F) פודוציטים מובחנים סופיים שמקורם ב-hiPSC. פסי קנה מידה מייצגים 300 מיקרומטר (A,B,D-F) ו- 150 מיקרומטר (C). פתית השלג מדגיש שלבי הקפאה אפשריים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
מכיוון שהפודוציטים שמקורם ב-hiPSC חוצים פרוטוקול ארוך עם שינויים דרסטיים לגבי סוג התא והמורפולוגיה, אפיון התא הוא חובה. מורפולוגיה של התא, כמו גודל וצורת התא, כמו גם התנהגות גדילה, ניתנת לניטור באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. פיברובלסטים מציגים פנוטיפ ארוך דמוי ציר בגודל של 150 מיקרומטר עד 300 מיקרומטר (איור 2A). לאחר תכנות מחדש, מושבות עם hiPSCs קטנים של 50 מיקרומטר מתרחשים. המושבות האלה מציגות גבולות ברורים ו-hiPSCs המובחנים ביחס גבוה בין גרעינים לגוף ובקצב התרבות מוגבר (איור 2C). מאחר שפודוציטים הם תאים ממוינים סופניים, קצב ההתרבות יורד עם התמיינות מתקדמת, והמורפולוגיה של התא משתנה לפודוציטים גדולים בצורת כוכב בגודל 300 מיקרומטר עם תהליכים רגליים בולטים (איור 2F).
מפגש הוא נקודה קריטית בתרבות hiPSC, והתמיינות ספונטנית יכולה להופיע כאשר מושבות גדלות צפופות מדי (איור 3). מושבות אלה יש להסיר לפני המעבר על ידי גירוד החלקים המושפעים של צלחת התרבות.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig04.jpg"> איור 3: דוגמאות ל-hiPSCs באיכות שונה. תמונות ניגודיות פאזה של (A) מושבות hiPSC שתוכנתו מחדש בהצלחה ו-(B) hiPSC נבחרות, כמו גם (C) התמיינות ספונטנית, (D,E) מושבות שאינן hiPSC, ו-(F) תרבות hiPSC צפופה מדי. פסי קנה מידה מייצגים 300 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
יש לאמת את סוגי התאים השונים של פרוטוקול זה בנוגע לביטוי של סמן מסוים. לאחר תכנות מחדש, hiPSCs מחזירים לעצמם יכולת פלוריפוטנציה ומבטאים סמני ריבוי ופלוריפוטנציה כמו SSEA4, OCT3/4 ו-Ki67 (איור 4)38,39,40. ידוע כי תכנות מחדש, כמו גם התרבות הארוכה של hiPSCs והבחנה, יכולים להוביל לקריוטיפ לא תקין, או ליתר דיוק לגרום למוטציות41. לכן, יש לעקוב אחר הרקע הגנטי של התאים בתרבית לאורך זמן ובמעברים שונים על ידי g-banding וריצוף אקסומי שלם.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig03.jpg"> איור 4: אפיון של hiPSCs שנוצרו על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית. אפיון hiPSCs שנוצרו על ידי צביעה עבור (A) סמן ההתרבות Ki67, כמו גם את סמני פלוריפוטנציה (B) OCT3/4 ו- (C) SSEA4. פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
מבחינה מורפולוגית, פודוציטים שמקורם ב-hiPSC מופיעים בצורת כוכב ומבטאים רשת מובחנת של תהליכים ארוכים ראשוניים ומשניים ברגל בהשוואה לציפודוציטים (איור 5). פודוציטים שמקורם ב-HiPSC מבטאים חלבוני סמן ספציפיים לפודוציטים כמו סינפטודין, נפרין ופודוצין (איור 6A-C)42.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig05.jpg"> איור 5: מורפולוגיה של פודוציטים שמקורם ב-hiPSC בהשוואה לציפודוציטים. השוואה של פודוציטים (A,B) שמקורם ב-hiPSC מתורם בריא ל-(C,D) ciPodocytes לגבי מורפולוגיה של תאים ופילופודיה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (A,C) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (B,D). פסי קנה מידה מייצגים 150 מיקרומטר (A,C) ו- 20 מיקרומטר (B,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
לכן, ההשוואה של פודוציטים שמקורם ב-hiPSC לא רק מתורמים בריאים, אלא גם מחולים עם מוטציות בגנים ספציפיים לפודוציטים, מאפשרת אפיון פרטני של המוטציה ex vivo של החולה.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig06.jpg"> איור 6: אפיון סמן ספציפי לפודוציטים בפודוציטים וציפודוציטים שמקורם ב-hiPSC. השוואה של פודוציטים (A-C) שמקורם ב-hiPSC מתורם בריא ל-(D-F) ciPodocytes לגבי חלבוני סמן ספציפיים לפודוציטים סינפטודין (A,D), נפרין (B,E) ופודוצין (C,F). פסי קנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1. הרכב כל המדיה והפתרונות של תרביות תאים ששימשו במחקר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/Table%201_REv2.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

כתב יד זה מתאר פרוטוקול דו-שלבי ליצירת פודוציטים ספציפיים למטופל מפיברובלסטים עוריים באמצעות תכנות מחדש אפיזומלי לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) ולאחר מכן התמיינות לפודוציטים.

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...

אנו מתארים פרוטוקול ליצירת פודוציטים אנושיים על ידי תכנות מחדש אפיזומלי של פיברובלסטים עוריים לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. תאים אלה דומים לפודוציטים in vivo הרבה יותר טוב מאשר פודוציטים אימורטליים במונחים של תהליכי מזון פודוציטים וביטוי של סמן ספציפי לפודוציטים. פודוציטים הם תאים ממוינים סופניים.לכן, תאים אלה אינם מתרבים עוד וניתוח פודוציטים ראשוני בתרבית תאים מוגבל. אף על פי שהבעיה של מספר תאים מוגבל התגברה על ידי שימוש בפודוציטים אימורטליים מותנים, פודוציטים אלה מציגים פנוטיפ והתנהגות לא ממוינים, המטילים ספק בשימוש בהם במחקר בסיסי. בעזרת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, פודוציטים יכולים להיווצר במבחנה במספר תאים כמעט בלתי מוגבל עם מורפולוגיה טיפוסית של פודוציטים הכוללת תהליכי מזון מובחנים וביטוי של סמן ספציפי לפודוציטים.כאשר משתמשים בתאי גזע ספציפיים למטופל כדי להתמיין לפודוציטים, ניתן ללמוד את השינויים הספציפיים למחלה של התא ex vivo. במקרה שהביופסיה הראשונית של העור נלקחה מחולה עם מחלת פודוציטים גנטית. פודוציטים הנוצרים באמצעות הפרוטוקול שלנו הם תאים חולים מותאמים אישית הנושאים את המוטציה של החולה.לפיכך, תאים אלה מייצגים מודל אקס ויו משופר לחקר מחלות פודוציטים וחומרים טיפוליים פוטנציאליים בגישה אישית.

generation-of-patient-derived-podocytes-from-skin-biopsies

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה, אנו מתארים את הפרוטוקול להפקת פודוציטים בכליות אנושיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים באמצעות התמיינות תאים בתנאים כימיים מוגדרים. הפודוציטים שנוצרו יכולים לשמש לבדיקת נפרוטוקסיות ומידול מחלות.

הפקת פודוציטים בכליות אנושיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים: הליך להבחנה מכוונת של פודוציטים בוגרים בכליות מתאי גזע

מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מקיף ומפורט כיצד ליצור עור אורגנוטיפי אנושי מהונדס גנטית מקרטינוציטים אפידרמליים ודרמיס אנושי נטול חיוניות.

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

אנו מציעים פרוטוקול זה מראה כיצד להבדיל keratinocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה ו fibroblasts וליצור תא צורב של העור תלת-ממד באמצעות אלה keratinocytes ו fibroblasts. פרוטוקול זה מכיל צעד נוסף של יצירת מודל humanized עכברים. הטכניקה המובאת כאן תשפר את המחקר דרמטולוגית.

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

מוצג כאן פרוטוקול מוגדר כימית להפקת פופוטים כליות אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים ביעילות גבוהה (&gt;90%) ותלויים במניפולציות גנטיות או בבחירת תת-אכלוס. פרוטוקול זה מייצר את סוג התא הרצוי בתוך 26 ימים והוא יכול להיות שימושי לבדיקות nephrotoxicity ומידול מחלות.

הבחנה מודרכת של פודוקיטים בוגרים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם בתנאים מוגדרים כימית

מוצג כאן פרוטוקול להנדס מערכת איבר-על-שבב מותאמת אישית המשחזרת את המבנה והתפקוד של מחסום הסינון הגלומרולרי בכליות על ידי שילוב תאי אפיתל וכלי דם מותאמים גנטית המובחנים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. מערכת מהונדסת ביולוגית זו יכולה לקדם את רפואת דיוק הכליות ואת היישומים הקשורים אליה.

שבב גלומרולוס כליות איזוגני מהונדס מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים aggitation רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi Dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת nerual הוא הסביר.

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

הדרך המהירה, החזקה של בידוד קיימא גזע בוגרים לתאי האפיתל של העור האנושי הוא תיאר. השיטה משתמשת עיכול אנזימטי של מטריקס הקולגן בעור, ואחריו מריטת זקיקי השיער ובידוד של המתלים תא בודד או שברי רקמה תרבית תאים.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

תאי גזע pluripotent מושרה קווים מניבים (iPSC) מייצרים שורות של פוטנציאל ההתפתחותי שונים גם כאשר הם עוברים בדיקות תקן לpluripotency. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצר עכברים נגזרים לחלוטין מiPSCs, המגדיר את קווי iPSC כבעל pluripotency...

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

חלבונים יכולים לאמץ מבנה מקורי או להתקפל בצורה לא נכונה לעמילואיד בלתי מסיס. תנאים המעדיפים את מסלול הקיפול הלא נכון מובילים להיווצרות סוגים שונים של סיבי עמילואיד. השיטות המתוארות כאן מאפשרות המרה מהירה של חלבונים מקומיים לעמילואיד במבחנה.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

כאן אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על תכנות מחדש אפיגנטיים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לכיוון יצירת אוכלוסייה הומוגנית של אבות שלד שריר כי בתנאי תרבות המתירנית יצירת צבירים תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres), אשר מסכמים תכונות ביולוגיות של אדם שרירי שלד.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

חקור שיטה ליצירת פודוציטים ספציפיים למטופל מתאי פיברובלסט עור באמצעות תכנות מחדש אפיזומלי לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. מודל זה מאפשר מחקר מדויק של מחלות כליה ופיתוח טיפולים מותאמים אישית.

יצירת פודוציטים שמקורם במטופל מביופסיות עור

גלה סרטונים נוספים