Name: התחדשות סולם דגי זברה בתרבות הקשקשים של טוטו ואקס ויוו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 49 s
Description: חקור התחדשות קשקשי Danio rerio בתרבית אקס ויוו לחקירת אינטראקציות בין אוסטובלסטים ואוסטוקלסטים במטריצה השלדית. שיטה זו מאפשרת לבחון תגובות תאים להזדקנות ולשינויים במקצב היומיומי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות למתיו גרין מיחידת השירות לבעלי חיים על גידול דגים ולקייטי ג'פסון ממרכז וולפסון לדימות ביולוגי. CLH, DB ו-QT מומנו על ידי Versus Arthritis (CLH Senior Fellowship 21937, DB and QT Intermediate Fellowship 22044), RR מומן על ידי (NHMRC APP1158758). עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק BBSRC (BB/T001984/1).

קציר והדמיה של קשקשים אלסמואידים של דגי זברה במהלך התחדשות In Vivo

<ol><li>Tobias, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+functional+genomics+research+in+osteoporosis%3A+report+from+a+workshop+held+by+the+causes+working+group+of+the+osteoporosis+and+bone+research+academy+of+the+Royal+Osteoporosis+Society+on+October+5th+2020%2C%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in functional genomics research in osteoporosis: report from a workshop held by the causes working group of the osteoporosis and bone research academy of the Royal Osteoporosis Society on October 5th 2020,&#34;.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, (2021).</li>
<li>Busse, B., Galloway, J. L., Gray, R. S., Harris, M. P., Kwon, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+emerging+model+for+orthopedic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An emerging model for orthopedic research.</a> Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 925-936 (2020).</li>
<li>Dietrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+biology+and+disease+modeling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal biology and disease modeling in zebrafish.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 36 (3), 436-458 (2021).</li>
<li>McGowan, L. M., Kague, E., Vorster, A., Newham, E., Cross, S., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt16+elicits+a+protective+effect+against+fractures+and+supports+bone+repair+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22JBMR+Plus%22%5BJournal%5D)">Wnt16 elicits a protective effect against fractures and supports bone repair in zebrafish.</a> JBMR Plus. 5 (3), 10461(2021).</li>
<li>Sehring, I., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+fin%3A+Complex+molecular+interactions+and+cellular+mechanisms+guiding+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish fin: Complex molecular interactions and cellular mechanisms guiding regeneration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 14 (7), 040758(2022).</li>
<li>Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+osteoporosis%3A+a+primary+testing+platform+for+screening+new+osteo-active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds.</a> Frontiers in Endocrinology. 10 (6), (2019).</li>
<li>Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%CE%B2-catenin+regulates+an+ancient+signaling+network+during+zebrafish+scale+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development.</a> Elife. 7, 37001(2018).</li>
<li>Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+regulation+of+bone+morphogenesis+through+the+development+and+regeneration+of+osteoblasts+in+the+zebrafish+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale.</a> Developmental Biology. 437 (2), 105-119 (2018).</li>
<li>Metz, J. R., de Vrieze, E., Lock, E. J., Schulten, I. E., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elasmoid+scales+of+fishes+as+model+in+biomedical+bone+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Ichthyology%22%5BJournal%5D)">Elasmoid scales of fishes as model in biomedical bone research.</a> Journal of Applied Ichthyology. 28 (3), 382-387 (2012).</li>
<li>Cox, B. D., De Simone, A., Tornini, V. A., Singh, S. P., Di Talia, S., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+of+dynamic+osteoblast+behaviors+in+regenerating+skeletal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">In toto imaging of dynamic osteoblast behaviors in regenerating skeletal bone.</a> Current Biology. 28 (24), 3937-3947 (2018).</li>
<li>Tonelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+resourceful+vertebrate+model+to+investigate+skeletal+disorders%2C%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders,&#34;.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, (2020).</li>
<li>de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+osteogenic+compounds+by+an+ex-vivo+sp7%3A+Luciferase+zebrafish+scale+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Identification of novel osteogenic compounds by an ex-vivo sp7: Luciferase zebrafish scale assay.</a> Bone. 74, 106-113 (2015).</li>
<li>De Vrieze, E., Moren, M., Metz, J. R., Flik, G., Lie, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arachidonic+acid+enhances+turnover+of+the+dermal+skeleton%3A+Studies+on+zebrafish+scales%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Arachidonic acid enhances turnover of the dermal skeleton: Studies on zebrafish scales.</a> PLoS One. 9 (2), 89347(2014).</li>
<li>Bergen, D. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+zebrafish+scales+express+a+subset+of+evolutionary+conserved+genes+involved+in+human+skeletal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease.</a> BMC Biology. 20 (1), 21(2022).</li>
<li>Bergen, D. J. M., et al. High bone mass disorders: New insights from connecting the clinic and the bench. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergen%2C+DJM+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22">Journal of Bone and Mineral Research</a>. , John Wiley and Sons Inc. (2022).</li>
<li>Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast+and+osteoclast+behavior+in+zebrafish+cultured+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales.</a> Cell and Tissue Research. 350 (1), 69-75 (2012).</li>
<li>Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+amputated+zebrafish+fin+rays+from+de+novo+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts.</a> Developmental Cell. 22 (4), 879-886 (2012).</li>
<li>Ethiraj, L. P., Fong, E. L. S., Liu, R., Chan, M., Winkler, C., Carney, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+and+fluorescent+TRAP+assays+for+visualising+and+quantifying+fish+osteoclast+activity%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Colorimetric and fluorescent TRAP assays for visualising and quantifying fish osteoclast activity.</a> European Journal of Histochemistry. 66 (2), 3369(2022).</li>
<li>DeLaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+sp7%3AEGFP%3A+a+transgenic+for+studying+otic+vesicle+formation%2C+skeletogenesis%2C+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration.</a> Genesis. 48 (8), 505(2010).</li>
<li>Carnovali, M., Banfi, G., Mariotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+modulation+of+bone+metabolism+in+zebrafish+scales+as+new+model+of+male+osteoporosis+in+lower+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Geroscience%22%5BJournal%5D)">Age-dependent modulation of bone metabolism in zebrafish scales as new model of male osteoporosis in lower vertebrates.</a> Geroscience. 43 (2), 927-940 (2021).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

הקשקשים האלסמואידים של דגי הזברה, כמודל חדשני לחקר השלד, טומנים בחובם פוטנציאל רב לסייע להבנתנו את תחזוקת העצם, התחדשות ותיקון פציעות. שפע הקשקשים על דגים מאפשר סינון תרכובות בתפוקה בינונית עד גבוהה תוך הפחתת מספר בעלי החיים בשימוש והגבלת השונות התוך-אישית. כאן, פרוטוקולים להתחדשות בקנה מידה ותרבות בקנה מידה ex vivo מוצגים כדי ללמוד התחדשות ותיקון.
יש לקחת בחשבון כמה שלבים קריטיים בעת ביצוע פרוטוקול זה. הסרה זהירה של הקשקשים היא חיונית, במיוחד כאשר משתמשים בקו כתב מהונדס כדי להגביל את ההפרעה לאוכלוסיית התאים הנגרמת על ידי הקציר. אם רוצים לערוך השוואות לקשקשים אונטוגנטיים, יש לוודא שהאזור אינו מכיל קשקשים המתחדשים באופן ספונטני (דבר שיכול להתרחש באופן טבעי לאורך חיי הדגים). ודא שהסביבה והציוד סטריליים לתרבית ex vivo כדי להשיג הישרדות תאים אופטימלית וזיהום מינימלי בתרבית.
בהתאם לשאלת המחקר הספציפית, ניתן לבצע התאמות לפרוטוקול, כגון שילוב קווי כתב טרנסגניים שונים כדי לדמיין סוגי תאים אחרים של פרופילי ביטוי גנים במהלך התחדשות ותיקון11,14.
הטווח הרחב של הכתמים שניתן לבצע על המאזניים פירושו שעבור כל תרכובת או מצב נבדק ניתן להסתכל על השפעותיו על העצם מזוויות שונות; בעוד שכתבי SP7/OSX יכולים להראות מספרי אוסטאובלסטים, צביעת ALP יכולה לדמיין פעילות אוסטאובלסט, צביעת TRAP יכולה לדמיין פעילות אוסטאוקלסט, צביעה חיה בצבע ירוק קלצין יכולה לתייג עצם חדשה שנוצרה וצביעת אליזרין אדומה או פון קוסה יכולה להראות מינרליזציה בקנה מידה. פעילות לוציפראז לכימות אוסטאובלסטים יכולה לשמש גם12. בשילוב עם טכניקות צביעה אלה, ניתן ללמוד את התרומה היחסית של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים לאפקט עצם נתון. קשקשים חסרים אוסטיאוציטים, הנפוצים בעצמות יונקים והם הגורמים העיקריים לתגובה מכנו-חושית בעצמות; תיקון קנה מידה והתחדשות במודל זה מונעים בעיקר על ידי אוסטאובלסטים עם עיצוב מחדש לאחר מכן על ידי אוסטאוקלסטים 8,9. חשוב לציין כי השונות מתרחשת בין אנשים וקבוצות גיל20. כדי למזער זאת, שטח הקציר בקנה מידה חייב להיות קבוע, מכיוון שמיקומים שונים יכולים ליצור מורפולוגיות קנה מידה שונות, ודגים מאותן קבוצות אחים משמשים כך שהגיל והגודל יהיו עקביים. עם זאת, מכיוון שניתן לקצור קשקשים מרובים לכל דג, ניתן לבצע יותר ניסויים באמצעות פחות דגים, מה שמפחית את השונות התוך-אישית.
לסיכום, פרוטוקולים אלה מראים טכניקות ניסיוניות שניתן ליישםעל סולמות אונטוגנטיים ומתחדשים. לסיכום, קשקשים אלסמואידים מראים פוטנציאל גדול כמודל שלד לסייע בהבנת היווצרות העצם ותיקונה; ויסייע להפחית את השימוש בבעלי חיים לבדיקת תרכובת אוסטאואנאבולית בתפוקה גבוהה.

עצם היא רקמת חיבור קשה המהווה חלק עיקרי מהשלד, מאפשרת תנועה ומשמשת כמאגר מינרלים בגוף. על מנת לשמור על עצם בריאה, איזון מעולה בין היווצרות עצם והתפרקות חיוני באמצעות פעילות מצומדת של אוסטאובלסטים (שהם אנבוליים) ואוסטאוקלסטים (אשר סופחים את העצם). איזון זה מופר על ידי הזדקנות או חוסר איזון הורמונלי, המוביל לעתים קרובות למחלות שבריריות עצם כגון אוסטאופורוזיס1. למרות שהתרופות הקיימות אושרו לטיפול במחלות שבריריות עצם, לרבות מהן יש תופעות לוואי; לכן, יש צורך בטיפולים חדשים1. לפיכך, נותר צורך בשפע מקורות של רקמת עצם רלוונטית ביולוגית שניתן להשתמש בהם כדי לבחון תרכובות טיפוליות פוטנציאליות.
באופן מסורתי, מודלים של מכרסמים ומערכות תרביות תאים שימשו לחקר ביולוגיה של העצם. עם זאת, דגי זברה הופכים יותר ויותר למודל בחירה נוסף. למרות שאינם מערכת יונקים, דגי זברה מציעים יתרונות מסוימים לחקר העצם על פני מכרסמים; אלה כוללים את פריותם ואת שקיפותם של הזחלים; אפילו בבגרות, חלק מרקמות השלד, כולל הקשקשים והסנפירים, נשארות שקופות, מה שמאפשר דימות in vivo ברזולוציה גבוהה וזמינות מוגברת של מוטציות שלד 2,3. הן הסנפירים והן הקשקשים של דגי הזברה מסוגלים להתחדשות מלאה לאחר הסרתם. התחדשות השלד ותיקון פציעות של סנפירי דגי זברה נחקרו בהרחבה 4,5, בעוד שקשקשי דגי זברה הם מודל עצם חדש יותר בתחום, אך מציעים יתרונות לתרבית ex vivo 6.
הקשקשים נפוצים מאוד, עם לפחות 300 קשקשים על כל דג המשמשים ככיסוי מגן לדגים. כל סולם הוא צלחת מינרלית קטנה המורכבת מאוסטאובלסטים יוצרי עצם ואוסטאוקלסטים סופחי עצם של מטריצת שלד עשירה בקולגן7. תהליך האוסיפיקציה של קשקשי דגי הזברה ועצמות האדם דורש התמיינות של תאי גזע מזנכימליים לאוסטאובלסטים כדי ליצור את המטריצה המינרלית. קשקשי דגי זברה מציעים יתרון גדול לחקר השלד עם יכולת ההתחדשות החזקה שלהם שניתן להשתמש בה כדי לחקור התחדשות ותיקון עצם. עם זאת, למרות נוכחותם של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים, קשקשי דגי זברה חסרים אוסטיאוציטים החשובים לעיצוב מחדש של העצם האנושית ולמכנוסנסציה; המיקום השטחי של הקשקשים אומר שניתן להסיר אותם בקלות עם זוג מלקחיים. עם הסרת הסולם, מתרחשת שרשרת של אירועים, והתחדשות קנה המידה מתחילה 8,9. קיימות אפשרויות צביעה והדמיה שונות כדי להמחיש את הפעילות של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים ואת המינרליזציה של הקשקשים, כפי שמוצג באיור 1. בנוסף, הזמינות של שורות כתבים טרנסגניות פלואורסצנטיות רלוונטיות רבות של דגי זברה פירושה שניתן לדמיין דינמיקה של תאים במהלך התחדשות 7,10,11. תהליך זה מאפשר להבין טוב יותר את היווצרות העצם דה נובו על ידי התבוננות בדפוסים המוקדמים של התחדשות אבנית על צלע הדג כדי לחקור מורפולוגיה, פעילות תאית ופרופילים גנטיים של קשקשים מתחדשים אלה. הביולוגיה של היווצרות אבנית והתחדשות אופיינה היטב. חשוב לציין, קשקשים יכולים להראות יכולת ניבוי טובה עבור תרכובות רלוונטיות מבחינה טיפולית12 וטיפול בדגים עם גלוקוקורטיקואידים מוביל לסולם שמתחדש כדי להראות פנוטיפים אוסטיאופורוטיים13. התעתיק של סולמות ההתחדשות מראה כי גנים המופעלים בהתחדשות אבנית מועשרים עבור אלה הקשורים למחלות שלד אנושיות, מה שמדגים עוד יותר את הרלוונטיות שלהם כמערכת מודל 6,14.
לבסוף, קשקשים אלה יכולים להיות בתרבית ex vivo עד 7 ימים. בהשוואה לתרביות קו תאים המורכבות בדרך כלל מסוג תא יחיד, תרבית בקנה מידה Ex vivo מספקת הזדמנויות מחקר עצם במבחנה בסביבתה הטבעית המכילה הן אוסטאובלסטים והן אוסטאוקלסטים עם המטריצה החוץ תאית הטבעית שלה 8,12,15,16.
תרבית קנה המידה גם מאפשרת לנו לבצע בדיקות סמים עבור מטרות אוסטאואנאבוליות חדשות. שפע הקשקשים על הדג פירושו שניתן למלא לפחות שתי צלחות של צלחת 96 בארות מדג אחד בלבד, מה שמאפשר סינון מורכב בפורמט רב בארות שבו כל באר מכילה קנה מידה אחד יחד עם נישה טבעית של תאים. בנוסף, מכיוון שהמאזניים דקים, ספיגת התרופות צפויה12. לסיכום, לקשקשים האלסמואידים של דגי הזברה יש פוטנציאל גדול במחקר השלד והם יכולים לעזור לנו לקבל תובנה נוספת לגבי האירועים התאיים במהלך היווצרות ותיקון העצם. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לקציר קשקשים כדי לעקוב אחר התחדשות in vivo ותרבות את המאזניים ex vivo.

<table><tbody><tr><td>10x פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70013-016</td><td>PBS</td></tr><tr><td>12-Multichanel Pipette</td><td>Sartorius</td><td>728230</td><td>Multichanel Pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 ערוצים, 10-100 &micro;L.&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל</td> צינור צנטריפוגה <td>430791 קורנינג</td><td></td>, <td>מכסה CentriStar, פוליפרופילן, ללא RNAse/DNAse, לא פירוגני</td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>אליזרין אדום</td><td>סיגמא</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15290026</tr><tr><td>Bemis Parafilm M סרט עטיפת מעבדה</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td>סרט איטום</td></tr><tr><td>11772644 אבקת סידן</td><td>סיגמא</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>L13191.30</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג 96 צלחת באר</td><td>קורנינג</td><td>3596</td><td>96 צלחת בארות, שקופה, תחתונה שטוחה פוליסטירן מטופל TC, עטוף בנפרד, עם מכסה,</td></tr><tr><td>כיסוי סטרילי מחליק</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>ציטיבה&nbsp; HyClone סרום עגלים בתוספת ברזל</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SH30072.03</td><td></td></tr><tr><td>Danieau</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31053</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פלקון</td><td>קורנינג</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>מהיר אדום סגול LB פתרון מלאי</td><td>סיגמא</td><td>F3381</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX תוסף</td><td>חיים טכנולוגיות</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>חממת</td><td></td><td></td> Hepes Sigma H3375 <td></td></tr><tr><td>X</td><td></td>, מוגדר עד 28 מעלות;<td></td><td> C ו-5% CO2</td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom</td><td>Sartorious</td><td>X</td><td>מערכת הדמיה חיה, מוגדר עד 28 מעלות; C ו-5% CO2</sub</td></tr><tr><td>>Leica סטריאומיקרוסקופ</td><td>X</td><td></td><td>סטריוסקופ</td></tr><tr><td>L-טרטרט די-הידראט</td><td>סיגמא</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>Mgcl2</td><td>BDH Laboratory Sup.&nbsp;</td><td>261237T</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>Epredia</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>9002-89-5</td><td></td></tr><tr><td>MQ מים</td><td>X</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N, N'-dimethylformamide (Merck: D4451)</td> <td>Merck</td><td>D4451</td><td></td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3120/53</td><td></td></tr><tr><td>נפתול AS-MX פוספט</td><td>Merck</td><td>N4875</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP פתרון</td><td>Sigma</td><td>#000000011681451001</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>קורנינג</td><td>430589</td><td>צלחת פטרי סטרילית 35 מ"מ, לא מטופלת, לא פירוגנית, פוליסטירן.</td></tr><tr><td>מאגר מגיב</td><td>Startub</td><td>E2310-1025</td><td>25 מ"ל מאגר ריאגנט</td></tr><tr><td>כסף חנקתי</td><td>סיגמא</td><td>209139</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא</td><td>52889</td><td></td></tr><tr><td>נתרן בטא-גליצרופוספט פנטהידראט</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>L03425.14</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן פירובט</td><td>סיגמא</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>נתרן טרטרט</td><td>Sigma</td><td>S4797</td><td></td></tr><tr><td>נתרן תיוקולפט</td><td>Sigma</td><td>563188</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methane sulfonate (MS222)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>פינצטה SLS</td><td>CHE3852</td><td></td></tr><tr><td>מספר 5</td><td>Dumont</td><td>500341</td><td>פינצטה, INOX, מיכלי דג זברה בדרגה ביולוגיה</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>טכניפלסט</td><td>&nbsp; ZB30BCP</td><td>3.5 ליטר - 28 ס"מ x 11 ס"מ x 17 ס"מ</td></tr><tr><td>מיכלי דג זברה&nbsp;</td><td>טכניפלסט</td><td>&nbsp; ZB30BCP</td><td>1 ליטר - 28 ס"מ x 7 ס"מ x 11 ס"מ</td></tr></tbody></table>

התחדשות סולם דגי זברה בתרבות הקשקשים של טוטו ואקס ויוו

Zebrafish Scale Regeneration In Toto and Ex Vivo Culture of Scales

מחלות שלד הן לעתים קרובות מורכבות באטיולוגיה שלהן ומשפיעות על מיליוני אנשים ברחבי העולם. בשל הזדקנות האוכלוסייה, יש צורך בטיפולים חדשים שיוכלו להקל על העומס על מערכות הבריאות. מכיוון שמחלות אלה מורכבות, קשה ויקר למדל במדויק את הפתופיזיולוגיה של העצם בתנאי מעבדה. האתגר של התחום הוא להקים פלטפורמה חסכונית ורלוונטית ביולוגית למידול מחלות עצם שניתן להשתמש בה כדי לבחון תרכובות טיפוליות פוטנציאליות. פלטפורמה כזו צריכה לאפשר באופן אידיאלי הדמיה דינמית של התנהגויות תאים של אוסטאובלסטים בוני עצם ואוסטאוקלסטים משפילי עצם הפועלים בסביבת המטריצה המינרלית שלהם. דגי זברה משמשים יותר ויותר כמודלים בשל זמינותם של כלים גנטיים, כולל קווי כתב טרנסגניים, והעובדה שחלק מרקמות השלד (כולל הקשקשים) נשארות שקופות לבגרות, מה שמאפשר אפשרויות הדמיה דינמיות. מכיוון שלקשקשים של דגי זברה יש גם אוסטאובלסטים וגם אוסטאוקלסטים והם נפוצים מאוד, הם מספקים משאב נגיש וזמין בשפע של יחידות עצם עצמאיות. יתר על כן, לאחר הסרתם, קשקשי דגי הזברה הבוגרים מתחדשים במלואם, ולכן מציעים דרך לחקור את הצמיחה המרחבית-זמנית של רקמה מינרלית in vivo. כאן, אנו מפרטים פרוטוקולים לקציר ומעקב אחר התחדשות הקשקשים. לבסוף, מוצג גם פרוטוקול לתרבית יציבה של קשקשים ex vivo למשך שבוע ולאחר תגובת הריפוי לאחר נזק מבוקר למטריצה המינרלית של הסולם לאורך זמן.

התחדשות בקנה מידה ניתן לעקוב אחר התחדשות אבנית באמצעות סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי על ידי הדמיה של צלע דג הזברה. איור 3A מראה שינויים בביטוי sp7/osx של הקשקשים במהלך התחדשות קנה המידה בדג זברה בן 4 חודשים. נקודות הזמן לדימות האגפים שמוצגות באיור 3A הן אונטוגנטיות (קשקשים מקוריים, לפני הקציר), יום 2, יום 4 ויום 10 לאחר הקציר. בדרך כלל אנו משתמשים בקווים טרנסגניים מסוג osx (הידוע גם בשם osterix או sp7) (כ-GFP (Tg(Ola.sp7:NLS-eGFP)19 או mCherry Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46)17 כדי לעקוב אחר שינויים במערכת השלד כפי שהוא מסמן אוסטאובלסטים המייצרים עצמות. דפוסים מוקדמים של קשקשים חדשים שנוצרו ניתן לראות על 2 ימים של התחדשות. דפוס מוקדם זה של התחדשות אבנית משתבש במקרים מסוימים, במיוחד במוטציות שלד. על ידי מעקב אחר התקדמות ההתחדשות, ניתן לנתח את היכולת ואת קצב ההתחדשות. ביום קציר האבנית, הדמיה פרטנית של קשקשים שנקטפו יכולה להתבצע לאחר הדמיה מאגף באמצעות אותו סטריאומיקרוסקופ, כפי שמוצג באיור 3B. לקשקשים מחודשים יש ביטוי OSX גבוה בהרבה בהשוואה לקשקשים אונטוגנטיים של יום 0 מכיוון שאוסטאובלסטים נדרשים ליצירת העצם החדשה.
תרבות בקנה מידה Ex vivo למרות שניתן לחקור את תהליך היווצרות העצם דה נובו על ידי מעקב אחר תהליך ההתחדשות על צלע הדג, אנו יכולים גם להשתמש במודל זה כדי לחקור תיקון וריפוי של פציעות שלד עם תרבית בקנה מידה ex vivo על ידי ביצוע פציעה על המאזניים עם אזמל. באמצעות מערכת הדמיה חיה, ניתן לעקוב אחר התיקון בזמן אמת. איור 4 מראה תוצאה מייצגת של תגובת ריפוי פציעות בקנה מידה אונטוגנטי תוך 3 ימים לתוך תרבית שבה האוסטאובלסטים מסומנים ב-osx: mCherry. אתר הפציעה שמוצג על-ידי הכניסות בתחילת התרבית מראה פער ברור בין אוסטאובלסטים ל-scale circuli (איור 4A). ניתן לעקוב אחר נדידת האוסטאובלסטים לעבר אתר הפציעה באמצעות הדמיה בהילוך מהיר. לאחר 3 ימים בתרבית, רוחב הפער מצטמצם, וניתן לראות את הביטוי שלה-osx בין הפער לבין הסקאלה החדשה שנוצרה (איור 4B). בנוסף, המורפולוגיה מבחינת צורת האוסטאובלסטים, היא מעגלית יותר בתחילת התרבית ולאחר 3 ימים, מוארכת יותר. שינוי זה במראה האוסטאובלסטים נובע ככל הנראה מהיותו בתרבית ולא בסביבתו הטבעית (הקשורה לדגים).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65396/65396fig01.jpg"> איור 1: דוגמאות לאפשרויות הדמיה עבור קני מידה. ניתן להמחיש אוסטאובלסטים באמצעות קווי כתב טרנסגניים osx/sp7 (ב-GFP או ב-mCherry). ניתן להשתמש בצביעת ALP כדי להראות את פעילות האוסטאובלסט. צביעת TRAP יכולה להראות את הפעילות של אוסטאוקלסטים. אדום אליזרין (AR) וירוק קלצין הם שני צבעים שניתן להשתמש בהם בדגים חיים; AR מתייג מינרליזציה ו Calcein תוויות עצם חדשה שנוצרה. ניתן להראות את מידת המינרליזציה גם עם צביעת פון קוסה. פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65396/65396fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65396/65396fig02.jpg"> איור 2: המחשה סכמטית של ניסוי רגנרציה בקנה מידה. סכמה גנרית של ניסוי התחדשות קנה מידה המראה כי דגים מופרדים למכלים בודדים לפני הניסוי. אורך, מין ובריאות נרשמים. הסכימה מראה גם את האזור המוצע בצלע הדגים כדי לקצור קשקשים ונקודות זמן מוצעות להדמיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65396/65396fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65396/65396fig03.jpg"> איור 3: תמונות מייצגות של ביטוי אוסטריקס (כדי להמחיש אוסטאובלסטים) במהלך התחדשות קנה מידה שנלקחו מדג זברה בן 4 חודשים. (A) תמונות האגפים שצולמו ביום 0 (לפני הקציר, קשקשים אונטוגנטיים), 2 dph (ימים לאחר הקציר) יום 2, 4 dph ו-10 dph למעקב אחר שינויים בביטוי OSX . פסי קנה מידה: 1 מ"מ. (B) תמונות מייצגות של סולם אונטוגנטי וסולם של 10 dph שנלקחו מאותו דג כמו בלוח (A). שים לב לרמות המוגברות של ביטוי osx כפי שמוצג במגנטה במרכז סולמות ההתחדשות. פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65396/65396fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65396/65396fig04.jpg"> איור 4: תוצאות מייצגות של תגובה לתיקון פגיעות שלד בקנה מידה אונטוגנטי שנלכד מדגי זברה בני 4 חודשים באמצעות מערכת הדמיה חיה. (A) קשקשים אונטוגנטיים עם פגיעה שנעשתה על ידי אזמל באותו יום של הקציר (נקודת זמן 0/יום0) של התרבית. (B) אותו סולם מוצג 3 ימים לאחר הפציעה. הכניסה מציגה את אזור הפציעה. פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65396/65396fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר את הקציר וההדמיה של קשקשים אלסמואידים של דגי זברה במהלך התחדשות in vivo . בנוסף, תרבות ex vivo של קשקשים אלה עד 7 ימים לאחר הקציר מוצג.

Skeletal diseases are often complex in their etiology and affect millions of people worldwide. Due to the aging population, there is a need for new ...

אחד היתרונות של שימוש בקשקשי דגים למחקר הוא שהם מכילים גם אוסטאובלסט וגם אוסטאוקלסט, החיוניים לעיצוב מחדש של העצם. כאשר הקשקשים הם תרבית ex vivo, אנו יכולים לחקור את האינטראקציות של שתי אוכלוסיות תאים אלה יחד עם מטריצת השלד, בניגוד לתרבית תאים מסורתית שבה יש בדרך כלל רק סוג אחד של תאים. יתרון בשימוש בקשקשים של דגים למחקר הוא שהם נמצאים בשפע על הדגים, נקטפים בקלות, והם שקופים, מה שמאפשר הדמיה טובה יותר של ex vivo.מכיוון שהקשקשים יכולים להתחדש לחלוטין, הם מאפשרים לנו לחקור את התחדשות העצם אשר מתרחשת לעתים רחוקות במודלים של יונקים. הפרוטוקולים שאנו מציגים כאן מאפשרים לנו לנתח אינטראקציות בין תאים טוב יותר. זה יאפשר לנו לבחון כיצד סוגי התאים השונים מגיבים להזדקנות ולשינויים בשעון הביולוגי.

zebrafish-scale-regeneration-in-toto-and-ex-vivo-culture-of-scales

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא את העובר / זחלים, פיתחנו assay כמותיים לרוחב שורת משובי שניתן ליישם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. Assay מעורב רזולוציה בneuromast 1) ו 2) רמות תא שיער בודד.

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

keratocytes דג הזברה להעביר בגיליונות תא מexplants ולספק מודל במבחנה לחקר המנגנונים של נדידת תאים קולקטיבית בהקשר של ריפוי פצע אפיתל. פרטים אלה פרוטוקולי דרך יעילה להקמת תרבויות explant עיקריות לשימוש במבחני נדידת תאים קולקטיביים.

Explants Keratocyte דג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית סלולארי וReepithelialization בריפוי פצע עורית

התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

פרוטוקול זה מציע שיטה לחקר דינמיקה תאית באמצעות טכניקה פשוטה של תרבית חוץ גופית . הוא מספק הזדמנות לחוקרי דגי זברה ולמחנכים לחקור תהליכים תאיים, כגון אלה הקשורים להומאוסטזיס עצם ולביולוגיה בסיסית של התא, על ידי הדמיה של גרעינים פלואורסצנטיים ותאים אפופטוטיים בתוך הקשקשים.

טכניקת תרבית חוץ גופית לחקר דינמיקה תאית בסקאלות דגי זברה

פורסים תרבות Organotypic של E18 מוח החולדה

וידאו זה מדגים תרבות חדש, שיטה שבאמצעותה הם עוברים חומוס בתרבית מחוץ הביצה עד 24 שעות. שיטה זו מאפשרת ללמוד פיתוח מוקדם (פס פרימיטיביים עד 14 סום.), תקופה המקבילה E7-9 בעכבר. יישומים של טכניקה זו כוללים electroporation, ב הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

החצוצרה (FT) מתגלה כאתר חלופי ממוצא עבור סרטן השחלות הצפק (SOC). פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה בידוד...

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

אנו מתארים שיטה תנאי מציאה ביטוי של חלבון המטרה במהלך רגנרציה דג הזברה למבוגרים סנפיר. טכניקה זו כוללת מיקרו הזרקה ו electroporating oligonucleotide morpholinos antisense לרקמת סנפיר, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של חלבון בשלבים שונים של התחדשות סנפיר, כולל ריפוי פצעים, יצירת blastema, ואת תוצאה רגנרטיבית.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

חקור התחדשות קשקשי Danio rerio בתרבית אקס ויוו לחקירת אינטראקציות בין אוסטובלסטים ואוסטוקלסטים במטריצה השלדית. שיטה זו מאפשרת לבחון תגובות תאים להזדקנות ולשינויים במקצב היומיומי.

התחדשות סולם דגי זברה בתרבות הקשקשים של טוטו ואקס ויוו

גלה סרטונים נוספים