Name: תחזוקה והערכה של סוגי רקמות ותאים שונים של העין באמצעות מערכת חדשנית של Pumpless Fluidics (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: למדו שיטה חדשנית לניתוח מטבולי בזמן אמת של רקמות עין באמצעות מערכת פלואידיקס רב-ערוצית ללא משאבה. השיטה מאפשרת מדידה מדויקת של צריכת חמצן ותוצרי לקטט בתאי רשתית ואפיתלית פיגמנט רטינלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, קרן BrightFocus, מחקר למניעת עיוורון (J.R.C.) ו- R01 EY006641, R01 EY017863 ו- R21 EY032597 (J.B.H).

תרבית זרימה רב-ערוצית ללא משאבה לשמירה והערכה של רקמות ותאים

<ol><li>Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perifusion+of+isolated+rat+islets+in+vitro%3A+Participation+of+the+microtubular+system+in+the+biphasic+release+of+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin.</a> Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).</li>
<li>Doliba, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+ionic+coupling+factors+in+amino+acid-stimulated+insulin+release+in+pancreatic+beta-HC9+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).</li>
<li>Sweet, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ATP%2FADP+in+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Regulation of ATP/ADP in pancreatic islets.</a> Diabetes. 53 (2), 401-409 (2004).</li>
<li>Chertov, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+glucose+in+photoreceptor+survival%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Roles of glucose in photoreceptor survival.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34700-34711 (2011).</li>
<li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li>
<li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+Can+Shuttle+Reducing+Power+from+the+Hypoxic+Retina+to+the+O2-Rich+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate Can Shuttle Reducing Power from the Hypoxic Retina to the O2-Rich Pigment Epithelium.</a> Cell Reports. 31 (5), 107606(2020).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+pyruvate+transport+by+zaprinast+causes+massive+accumulation+of+aspartate+at+the+expense+of+glutamate+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial pyruvate transport by zaprinast causes massive accumulation of aspartate at the expense of glutamate in the retina.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (50), 36129-36140 (2013).</li>
<li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+metabolism+in+the+retinal+pigment+epithelium+uncouples+respiration+from+ATP+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate metabolism in the retinal pigment epithelium uncouples respiration from ATP synthesis.</a> Cell Reports. 39 (10), 110917(2022).</li>
<li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluidics+system+for+resolving+concentration-dependent+effects+of+dissolved+gases+on+tissue+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism.</a> Elife. 10, e66716(2021).</li>
<li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStryer%2C+L+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 4th edn, Freeman and Company, New York. (1995).</li>
<li>Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+respiration+in+adherent+cells+by+Seahorse+XF96+Cell+Mito+Stress+Test%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100245(2021).</li>
<li>Engel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+dysfunction+in+Sorsby+patient-derived+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix dysfunction in Sorsby patient-derived retinal pigment epithelium.</a> Experimental Eye Research. 215, 108899(2022).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Mitochondrial+Respiration+Impairs+Nutrient+Consumption+and+Metabolite+Transport+in+Human+Retinal+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Mitochondrial Respiration Impairs Nutrient Consumption and Metabolite Transport in Human Retinal Pigment Epithelium.</a> Journal of Proteome Research. 20 (1), 909-922 (2021).</li>
<li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+Metabolism+and+Metabolism+in+the+Pigmented+Epithelium%3A+A+Busy+Intersection%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Retina Metabolism and Metabolism in the Pigmented Epithelium: A Busy Intersection.</a> Annual Review of Vision Science. 7, 665-692 (2021).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+and+photoreceptor+survival+in+retinal+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation and photoreceptor survival in retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 205, 108492(2021).</li>
<li>Okawa, H., Sampath, A. P., Laughlin, S. B., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+consumption+by+mammalian+rod+photoreceptors+in+darkness+and+in+light%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ATP consumption by mammalian rod photoreceptors in darkness and in light.</a> Current Biology. 18 (24), 1917-1921 (2008).</li>
<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. , 100846(2020).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+of+engineering+retinal+organoids+and+organoid-on-a-chip+in+modeling+intraocular+drug+delivery%3A+Current+progress+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies of engineering retinal organoids and organoid-on-a-chip in modeling intraocular drug delivery: Current progress and future perspectives.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 197, 114842(2023).</li>
<li>Arjamaa, O., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-dependent+diseases+in+the+retina%3A+role+of+hypoxia-inducible+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors.</a> Experimental Eye Research. 83 (3), 473-483 (2006).</li>
<li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Multi-Channel+Fluidics+System+for+the+Maintenance+and+Real-Time+Metabolic+and+Functional+Assessment+of+Tissue+or+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods.+In+Press%22%5BJournal%5D)">A Versatile Multi-Channel Fluidics System for the Maintenance and Real-Time Metabolic and Functional Assessment of Tissue or Cells.</a> Cell Reports Methods. In Press. , (2023).</li>
<li>Neal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Low-Level+Drug+Effects+Using+Real-Time%2C+in+vitro+Measurement+of+Oxygen+Consumption+Rate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantification of Low-Level Drug Effects Using Real-Time, in vitro Measurement of Oxygen Consumption Rate.</a> Toxicological Sciences. 148 (2), 594-602 (2015).</li>
<li>Jung, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+cytochrome+C+is+an+essential+regulator+of+sustained+insulin+secretion+by+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reduced cytochrome C is an essential regulator of sustained insulin secretion by pancreatic islets.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (20), 17422-17434 (2011).</li>
<li>Rountree, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+insulin+secretion+by+cytochrome+C+and+calcium+signaling+in+islets+with+impaired+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Control of insulin secretion by cytochrome C and calcium signaling in islets with impaired metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (27), 19110-19119 (2014).</li>
<li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).</li>
<li>Jarrett, S. G., Rohrer, B., Perron, N. R., Beeson, C., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+mitochondrial+damage+in+retinal+cells+and+tissues+using+quantitative+polymerase+chain+reaction+for+mitochondrial+DNA+damage+and+extracellular+flux+assay+for+mitochondrial+respiration+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of mitochondrial damage in retinal cells and tissues using quantitative polymerase chain reaction for mitochondrial DNA damage and extracellular flux assay for mitochondrial respiration activity.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 227-243 (2013).</li>
<li>Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+alterations+in+mitochondrial+reserve+capacity%3B+a+means+to+predict+subsequent+photoreceptor+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).</li>
<li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+assays+for+evaluation+of+human+pancreatic+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function.</a> Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2008).</li>
<li>Doliba, N. M., Qin, W., Vinogradov, S. A., Wilson, D. F., Matschinsky, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+acutely+inhibits+acetylcholine-+but+not+GLP-1-stimulated+insulin+secretion+in+mouse+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid acutely inhibits acetylcholine- but not GLP-1-stimulated insulin secretion in mouse pancreatic islets.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 299 (3), E475-E485 (2010).</li>
</ol>

ל-I.R.S., M.G. ו-K.B יש קשרים פיננסיים עם EnTox Sciences, Inc. (Mercer Island, WA), היצרן/מפיץ של מערכת BaroFuse perifusion המתוארת במחקר זה. כל שאר המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

בשל חשיבותה של הביו-אנרגטיקה בכל היבטי תפקוד התא ותחזוקת מרכיבי העין השונים, קיים צורך קריטי בשיטות לחקר ויסותה. בפרט, הרשתית העצבית ו- RPE תלויים בחילוף החומרים הן לייצור אנרגיה והן לאיתות תוך תאיובין-תאי 14,15,16,17. בגלל יכולת החמצון הגבוהה שלהן, רקמות מבודדות של העין אינן מתוחזקות היטב בתנאים סטטיים18,19 ולכן מחקר של רכיבים מבודדים של העין דורש מערכות זרימה שיכולות גם לשמור וגם להעריך תהליכים מטבוליים. מערכת הפלואידיקה פותחה כדי להפיק נתוני OCR ו-LPR ממגוון רחב של סוגי רקמות, ובמאמר זה הצגנו פרוטוקולים מפורטים שנמצאו כמניבים תוצאות אופטימליות.
הגורם העיקרי להפקת נתונים חזקים באמצעות מערכת הזרימה כולל שיווי משקל מראש של מדיה/חיץ מבוסס CO2 ב-39°C (כדי להבטיח שהפריפוזאט אינו רווי בגז מומס שירד מהגז במהלך הניסוי). בפרט, מדיה או חיץ KRB המאוחסנים ב -4 ° C יהיו רוויים ביחס ל -37 ° C וירדו מהגז במהלך הניסוי אם זמני טרום שיווי משקל אינם מספיקים. בנוסף, אסור שהרקמה המועמסת לתוך תאי הרקמה תעבור טראומה על ידי בידוד לא תקין של רקמה עקב קריעה או הפרדה לא מלאה של רקמה, או על ידי חשיפת רקמה בכמות נמוכה של חיץ מבוסס ביקרבונט לאוויר האטמוספרי למשך זמן רב מדי. בקרת הטמפרטורה, יציבות הזרימה והאמינות של זיהוי O2 הם בעלי שונות מועטה וגורמים אלה אינם תורמים באופן משמעותי לשיעור הכשלים.
למכשיר שמונה תעלות זרימה / תאי רקמה הפועלים בו זמנית המסופקים עם פריפוזט משני מאגרים, ארבעה תאי רקמה לכל מאגר. כדי לקבל את מסלולי הזמן המדויקים ביותר של OCR, עקומות קינטיות מתוקנות על ידי תאים שאינם עמוסים ברקמות. לפיכך, פרוטוקול ניסויי טיפוסי יכלול שתי קבוצות של שלושה תאי רקמה. פרוטוקולים באופן כללי מתחלקים לשתי קטגוריות: האחת היא פרוטוקולי תרכובת הבדיקה השונים בכל צד (למשל תרופה/רכב בצד אחד של MRM, ורק רכב בצד השני); השני הוא אותו פרוטוקול הזרקת תרכובת בדיקה משני צידי ה-MRM, אך מודל רקמות או רקמות שונה בכל צד של ה-MRM. במאמר זה, ההשפעות של אוליגומיצין ו-FCCP על הרשתית הושוו ל-OCR על ידי רקמות שלא נחשפו לתרכובות בדיקה כלשהן, ושתי רקמות הוערכו במקביל תחת אותו פרוטוקול ותנאים לזיהוי התנהגות ספציפית לרקמה. האחרון הודגם במחקר זה על ידי הצגת טווח דינמי מוגבר של קצב חילוף החומרים על ידי RPE-choroid-sclera ביחס לרשתית במקביל באותו ניסוי. דוחות אחרים תיארו מגוון רחב יותר של תכנוני מחקר, כולל מדידת ההשפעות המשתנות של רמות O2 על OCR ו- LPR, ותלות בריכוז של דלקים, תרופות ורעלים20,21. בנוסף, למרות שהגבלנו את הניתוח של שברים החוצה למדידת לקטט וחישוב של LPR, תוכן המידע של ניסוי גדל מאוד אם תרכובות מרובות וסוגים של תרכובות בשברים החוצה נבדקים כגון הורמונים, נוירוטרנסמיטרים, אותות תאיים, מטבוליטים שיכולים לצאת התאים20,22, 23.
ההעמסה של רשתית מבודדת או RPE-choroid-sclera היא פשוטה, ולאחר בידוד רקמות אלה פשוט ממוקמים בחלק העליון של חדרי הרקמה עם מלקחיים ומותר לשקוע למטה אל frit. תאי RPE בתרבית על תוספות מסנן מפתחים קיטוב מתאים וסמנים של בשלות RPE לאחר 4-8 שבועות בתרבית. אין זה ריאלי להסיר את RPE לאנליזה של תאים חיים לאחר חיבורו לקרום הטרנסוול, אם יש לשמור על בשלות וקיטוב RPE24. תא הפריפוזיה יכול להכיל רצועות של קרום הטרנסוול שנחתכות באזמל בזמן שהן שקועות בחיץ ומוחדרות במהירות לתאי הרקמה. למרות שחיתוך רצועות מסנן הוכנס למערכת סטטית24, אין שיטה אחרת להערכת סוגי תאים חשובים אלה. התגובות של תאי RPE היו מהירות ודינמיות יותר מאשר הרשתית או RPE-choroid-sclera, ככל הנראה בשל גישה מיידית של שני ההיבטים האפיקליים והבזאליים של תאי RPE שהוגדרו כשכבה אחת על תוספת הממברנה.
גורם נוסף המבטיח שלנתונים יש את האות הגבוה ביותר לרעש הוא בחירת היחס האופטימלי של הרקמה המוטענת לתאי הפריפיוז'ן ביחס לקצב הזרימה. מעט מדי רקמה ביחס לקצב הזרימה גורמת להפרש של ריכוז O2 מומס בין זרימה לזרימה החוצה שהוא קטן מאוד וקשה למדוד אותו בצורה אמינה. לעומת זאת, אם הזרימה איטית מדי, אז הריכוז של O2 הופך להיות כל כך נמוך כי הרקמה מושפעת היפוקסיה. עם זאת, זרימת נוזל מונעת לחץ גז יכולה להישמר בקצבי זרימה של עד 5 מ"ל / דקה הדורשים רק כמויות קטנות של רקמה למדידות OCR ו- LPR מדויקות. בניסויים המוצגים כאן, נעשה שימוש בכ-20 מ"ל/דקה/תעלה שהתאימו לרשתית אחת, לשני תאי RPE-choroid-scleras, או ל-360,000 תאי RPE. כדי למזער את השפעות המערכת המעכבות ומפזרות את חשיפת הרקמה לתרכובת הבדיקה המוזרקת, מסופקים גדלים מרובים של תאי הרקמה, כך שכמות הרקמה (וקצב הזרימה) מותאמים לגודל המתאים של החדר.
הנתונים מהניתוחים המוצגים במאמר זה יוצגו בשתי דרכים: גודל מוחלט ביחס לקצב, או שינויים חלקיים ביחס למצב יציב או קו בסיס. ההתמקדות הייתה בהמחשה של מדידת תגובות לתרכובות בדיקה. עם זאת, מערכת הפלואידיקה מתאימה היטב להעריך ולהשוות השפעות של טיפול ברקמות לפני ניתוח פריפוזיה כגון שינויים גנטיים. בדיקה אם טיפול שונה משליטה היא חזקה ביותר אם מנותחות השפעות הטיפול על תגובות מנורמלות של תרכובות בדיקה. אם הניתוח דורש סדרי גודל מוחלטים, הכוח הסטטיסטי של ניתוחי הדגימות המטופלות מראש הוא מקסימלי אם הערכתם והבקרות שלהם מתבצעות באותו ניסוי פריפיוז'ן.
למעט הבוחש, כל החלקים הבאים במגע עם נוזל מסופקים על ידי היצרן כחומרים מתכלים ועברו עיקור. אין לעשות שימוש חוזר בחלקים אלה, מכיוון שניסויים יאבדו מדי פעם עקב ניקוי לא שלם ומשטחים מזוהמים. המערכת בתחילת ההתקנה היא סטרילית. עם זאת, התקשורת מתווספת ל- MRM, ורקמות נטענות בתאים בתנאים לא סטריליים. מדדנו OCR במערכת שמורכבת מחלקים סטריליים, אך הניסוי עצמו מתבצע בתנאים לא סטריליים. לוקח בערך 14 שעות לחיידקים להצטבר עד כדי כך שיש OCR מדיד (תוצאות שלא פורסמו). אם משתמשים בפרוטוקולים שהם פחות מ -10 שעות בערך, אז הצטברות של חיידקים וכל ההשפעות הנובעות מהם יהיו זניחים.
חוקרים רבים משתמשים במכשירים שנועדו למדוד OCR תחת דגירה סטטית של שכבה אחת של תאים עם תפוקה גבוהה יחסית25,26. לעומת זאת, מכשיר הפלואידיקה שבדקנו ותיארנו במאמר זה שומר על הרקמה על ידי הבטחת אספקת O2 נאותה, שהיא קריטית למרחקי הדיפוזיה הגדולים יותר הנמצאים בדגימות רקמה. בנוסף, הוא מסוגל לאסוף שברים המאפשר הערכה של פרמטרים מרובים במקביל OCR אשר משפר מאוד את היכולת לחקור את היחסים ביניהם. לבסוף, ניתן לשלוט בריכוזי הגזים המומסים (כגון O 2 ו-CO 2), מה שמגדיל את משך הניסויים עם מדיה וחיץ מבוססי ביקרבונט, מה שמאפשר למשתמש לחקור את ההשפעות של O2. יש לציין, מגבלה עבור שתי המתודולוגיות היא חוסר היכולת לחקור את השטיפה של תרכובות בדיקה, פונקציונליות כי מערכות perifusion אחרים יש 4,27,28. שיקול נוסף בקביעת שיטת הניתוח האופטימלית הוא העובדה שמערכות פלואידיקה משתמשות ביותר מדיה ותרכובות בדיקה מאשר מערכות סטטיות. ההוצאה הנוספת ממוזערת עם מערכות הפלואידיקה הנוכחיות, אם כי בשל שיעורי הזרימה הנמוכים שניתן להשתמש במערכת.
בסך הכל, מתואר תיאור מפורט של הפרוטוקולים לביצוע ניסויים עם מכשיר זרימה/הערכה חדש. נתונים שנוצרו עם רשתית ו- RPE-choroid-sclera חזרו על תוצאות קודמות שהתקבלו עם מערכות שהן הרבה יותר קשות לשימוש (ולא זמינות). כמו כן הוכח כי המערכת יכולה לשמור ולהעריך תאי RPE המחוברים לממברנות טרנסוול, מודל תאי חשוב מאוד שלא נותח בעבר עם מערכות זרימה בשל שבריריות התאים. חלקיו העיקריים של הפרוטוקול מורכבים מזמן התקנה של 75 דקות, ואחריו תקופת שיווי משקל של 90 דקות והפרוטוקול הניסיוני שהופך אותו למתאים לשימוש שגרתי על ידי מעבדות שאינן מתמחות בהפעלת מערכות פלואידיקה. למרות שהתמקדנו במדידת התגובה החריפה של רקמה לבדיקת תרכובות, המערכת מתאימה מאוד להשוואת רקמות ממקורות שונים כגון מודלים של בעלי חיים או מודלים של תאים ששונו גנטית או עברו טיפולים/מצבים ניסיוניים. בנוסף, היקף הבדיקות שניתן לבצע על שברי הזרימה הוא רחב וכולל מטבוליטים, מולקולות איתות תאיות והורמונים / מוליכים עצביים המופרשים וכן אנליזה מרובת רכיבים הנוצרת על ידי ספקטרומטריית מסות על השברים כמו גם על הרקמה.

למערכות פריפיוז'ן יש היסטוריה ארוכה במדעי החיים. בפרט, לחקר תפקוד ההפרשה על ידי איונים, הם שימשו לאפיון הקינטיקה של הפרשת אינסולין בתגובה להפרשה1. בנוסף לאיסוף שברי זרימה לבדיקה עוקבת של הורמונים ומטבוליטים, שולבו חיישנים בזמן אמת, בעיקר לזיהוי צריכת חמצן 2,3,4. מאמצים נרחבים להבין טוב יותר מנגנונים המתווכים מחלות של העין הוגבלו על ידי מחסור בשיטות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית להערכת ויסות מטבולי וחוסר ויסות של המרכיבים המבודדים השונים של העין, כולל הרשתית, אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE)-choroid-sclera ותאי RPE בתרבית. מערכות סטטיות המיועדות לתאים בתרבית הותאמו לרקמה5, אך רקמה דורשת זרימה לצורך חמצון הולם. מערכות זרימה הצליחו למדוד באופן מדויק ומשכפל תגובות בזמן אמת בקצב צריכת החמצן (OCR) על ידי הרשתית ו- RPE-choroid-sclera, והרקמות נשארות יציבות מטבולית במשך יותר מ -8 שעות ומאפשרות פרוטוקולים אינפורמטיביים ביותר הכוללים תרכובות בדיקה מרובות 4,6,7,8,9 . עם זאת, הפעלת מערכות פלואידיקה דרשה באופן היסטורי מנגנון מותאם אישית וצוות טכני מיומן במתודולוגיות לא סטנדרטיות. מערכות כאלה לא אומצו כמתודולוגיה סטנדרטית ברוב המעבדות. BaroFuse היא מערכת פלואידיקה חדשה שפותחה ואינה מסתמכת על משאבות, אלא על לחץ גז כדי להניע זרימה דרך תעלות מרובות ותאי רקמות מרובים (איור 1). כל ערוץ מנוטר ברציפות עבור זיהוי תווים אופטי (OCR), והזרימה החוצה נאספת באמצעות אספן שברים מבוסס צלחת לבדיקה עוקבת של תוכן. חשוב לציין, תאי פריפיוז'ן הרקמה עבור המכשיר מתוכננים להכיל רקמות בגיאומטריות ובגדלים שונים.
לב המכשיר הוא מערכת הפלואידיקה, שבה הזרימה מועברת ממאגר אטום בלחץ דרך צינורות בקוטר פנימי קטן (ID) (התורמים את התנגדות הזרימה המשמעותית ביותר במעגל הנוזל) אל תאי רקמת הזכוכית המאחסנים את הרקמה. הלחץ למודול מאגר המדיה (MRM) מסופק על ידי וסתי לחץ נמוך ולחץ גבוה המחוברים לבלון גז המכיל תערובת גזים (בדרך כלל 21% O 2, 5% CO 2, איזון N2), והמאגר אטום מלמעלה על ידי מודול תא הפריפיוז'ן (PCM) המחזיק את מכלולי תאי הרקמה (TCAs). קצב הזרימה נשלט על ידי אורך ומזהה צינורות ההתנגדות והגדרת הלחץ של וסת לחץ נמוך. צינורות זרימה המחוברים לחלק העליון של תאי הרקמה מעבירים נוזל לכלי קיבול פסולת (שנשקל ברציפות לקביעה אוטומטית של קצב זרימה) או לבארות של צלחת בת 96 בארות הנשלטות על ידי קולט השברים. מערכת זיהוי O 2 מודדת את אורך החיים של צבע רגיש O2 הצבוע בחלק הפנימי של כל אחד מתאי רקמת הזכוכית במורד הזרם של הרקמה. מידע זה משמש לאחר מכן לחישוב רציף של זיהוי תווים אופטי (OCR). כל מערכת הפלואידיקה שוכנת במתחם מבוקר טמפרטורה ומיכל הגז, קולט השברים והמחשב הם המרכיבים העיקריים של המכשיר (איור 2A). לבסוף, תוכנה המפעילה את המכשיר משמשת לבקרה על פעולתו (כולל הכנה ותזמון של תרכובות בדיקה מוזרקות, מערכת מדידת זרימה ותזמון אספן שברים), כמו גם עיבוד וגרפים של נתוני OCR ומדידות משלימות אחרות.
במאמר זה אנו מתארים את הפרוטוקולים לשימוש במערכת הפלואידיקה כדי לשבור ולהעריך OCR וקצב ייצור לקטט (LPR) עבור רכיבים מבודדים שונים של העין. LPR הוא פרמטר המשקף קצב גליקוליטי המשלים מאוד את OCR, שבו הצמד מהווה את שני הענפים העיקריים של ייצור אנרגיה מפחמימות בתא10. מכיוון שהכנת הרקמה והטענתה לתאי הרקמה נלמדת בצורה הטובה ביותר על ידי צפייה בהליך, הסרטון יסייע להמחיש כמה מהשלבים הקריטיים המבוצעים במהלך ההתקנה והתפעול שאינם מועברים בקלות על ידי טקסט בלבד.
תיאור הפרוטוקול מחולק ל-8 חלקים המתאימים לשלבים שונים של הניסוי (איור 2B): 1. הכנה טרום-ניסויית; 2. הכנה/שיווי משקל של הפריפוסט; 3. הגדרת מכשיר; 4. שיווי משקל רקמות; 5. פרוטוקול ניסיוני; 6. שבירת מכשירים; 7. עיבוד נתונים; ו-8. בדיקות של שברים יוצאים.

<table><tbody><tr><td><דגימות ביולוגיות>חזקות</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J עכברים</td><td>Envigo Harlan (אינדיאנפוליס, אינדיאנה)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C2920L9795</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270G</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>לקטט&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>L6661</td><td></td></tr><tr><td>Oliigomycin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351L9795</td><td></td></tr><tr><td><תרבית תאים >חזקים וקצירת רקמות</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beuthanasia-D</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol, 390 מ"ג/מ"ל נתרן פנטוברביטל</td><td>Virbac</td><td>RXEUTHASOL</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>האנק' s תמיסת מלח חוצצת</td><td>GIBCO</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>קרבס רינגר ביקרבונט (KRB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J67795L9795</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>תרמו-פישר&nbsp;</td><td>#CB-40230</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>ROCKi&nbsp;</td><td>Selleck Chemicals</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>#25-200-072</td><td></td></tr><tr><td><חזק>אספקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בלוני גז: 21% O2/5% CO2/איזון N2</td><td>Praxair Distribution, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מסנני Transwell&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td><חזק>בדיקות מסחריות</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמפלקס ערכת בדיקת גלוקוז/גלוקוז אוקסידאז אדום</td><td>ThermoFisher</td><td>A22189</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז אוקסידאז מAerococcus viridans</td><td>Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה)</td><td>A22189L9795</td><td></td></tr><tr><td>לקטט אוקסידאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L9795</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaroFuse&nbsp; מערכת פריפוזיה רב-ערוצית</td><td>EnTox Sciences, Inc (מרסר איילנד, וושינגטון</td><td>דגם 001-08</td><td></td></tr><tr><td>סינרג'י 4 פלואורומטר</td><td>ביוטק (Winooski, VT)S4MLFPTA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

תחזוקה והערכה של סוגי רקמות ותאים שונים של העין באמצעות מערכת חדשנית של pumpless fluidics

Maintaining and Assessing Various Tissue and Cell Types of the Eye Using a Novel Pumpless Fluidics System

מודלים רבים במבחנה המשמשים לחקר תפקוד רקמות וביולוגיה של התא דורשים זרימה של מדיה כדי לספק חמצון הולם ותנאי תא אופטימליים הדרושים לשמירה על תפקוד וכדאיות. לשם כך, פיתחנו מערכת תרביות זרימה רב-ערוצית כדי לשמור על רקמות ותאים בתרבית ולהעריך ברציפות תפקוד וכדאיות על ידי חיישנים בתוך השורה ו/או אוסף של שברי זרימה. המערכת משלבת חישה אופטית רציפה בת 8 ערוצים של קצב צריכת חמצן עם קולט שברים מובנה כדי למדוד בו זמנית את קצב הייצור של מטבוליטים והפרשת הורמונים. למרות שהוא מסוגל לתחזק ולהעריך מגוון רחב של מודלים של רקמות ותאיים, כולל איונים, שרירים והיפותלמוס, כאן אנו מתארים את עקרונות הפעולה שלו ואת ההכנות/פרוטוקולים ניסיוניים שבהם השתמשנו כדי לחקור ויסות ביואנרגטי של רשתית עכבר מבודדת, אפיתל פיגמנט רשתית עכבר (RPE)-choroid-sclera, ותאי RPE אנושיים בתרבית. חידושים בתכנון המערכת, כגון זרימת נוזל ללא משאבה, הפיקו פעולה פשוטה מאוד של מערכת זרימה רב ערוצית. מוצגים סרטונים ותמונות הממחישים כיצד להרכיב, להכין את המכשיר לניסוי ולטעון את המודלים השונים של רקמות/תאים לתוך תאי הפריפיוזיה. בנוסף, מתוארים ונדונים קווים מנחים לבחירת תנאים לניסויים ספציפיים לפרוטוקול ולרקמות, כולל קביעת יחס קצב זרימה לרקמה נכון לקבלת תנאי תרבית עקביים ויציבים וקביעות מדויקות של קצב הצריכה והייצור. השילוב של תחזוקת רקמות אופטימלית והערכה בזמן אמת של פרמטרים מרובים מניב מערכי נתונים אינפורמטיביים ביותר שיהיו שימושיים מאוד למחקר בפיזיולוגיה של העין ולגילוי תרופות לטיפול בראייה לקויה.

כדי להמחיש את הרזולוציה של הנתונים שנוצרו מרכיבים מבודדים של העין, OCR ו- LPR נמדדו עם שלושה סוגי רקמות (רשתית, RPE-choroid-sclera, ותאי RPE) בעקבות פרוטוקול נפוץ (מבחן מאמץ מיטוכונדריאלי10; איור 10, איור 11 ואיור 12). כמות הרקמה המשמשת עבור כל רקמה מוצגת בטבלה 1. הנתונים עובדו וטופלו בגרפים באמצעות חבילת התוכנה שפותחה עבור מערכת פלואידיקה. הכנת הרשתית ו-RPE-choroid-sclera היא פשוטה יחסית ואורכת פחות מ-20 דקות לכל סוג רקמה. OCR היה קבוע בזמן שהוזרקו תרכובות הבדיקה, מה שמצביע על בריאות ותפקוד יציבים של הרקמה ותומך בתוקף השיטה (איור 10). לאחר שאומתו עבור כל סוג רקמה, לא מצאנו צורך להריץ בקרות שבהן לא מוזרקות תרכובות בדיקה לכל ניסוי. בהתאם לנתונים שהתקבלו באמצעות שיטות פריפיוז'ן קונבנציונליות יותר 6,8,13, OCR ירידה בתגובה לאוליגומיצין ועלייה ב- OCR בתגובה ל- FCCP. שינויים ב-LPR היו בכיוון ההפוך מאלה שנצפו עבור OCR: אוליגומיצין הגביר את LPR, אשר לאחר מכן ירד (אך רק מעט) בתגובה ל-FCCP (איור 11). כדי להשוות את המובהקות הסטטיסטית של ההשפעה של כל תרכובת בדיקה רציפה, בוצעו בדיקות t (אשר מחושבות באופן אוטומטי על ידי התוכנה המצורפת למכשיר). מכיוון שמטרת המאמר הייתה לתאר כיצד לבצע את השיטה, מספר ההעתקים שנשאו לא תמיד היה גבוה מספיק כדי לייצר מובהקות סטטיסטית. עם זאת, באופן כללי, כאשר מספר העותקים המשוכפלים היה 3 או יותר, ההשפעות של FCCP ואוליגומיצין הן על OCR והן על LPR היו משמעותיות.
תאי RPE לא נותחו בעבר עם מערכות זרימה, אך הגיבו באופן דומה לתאי RPE-choroid-sclera (בהתאם לדעה שחלק גדול של OCR נובע מתאי RPE; איור 11). דוגמאות אלה מדגישות את יכולתה של המערכת לשמור על כדאיות הרקמה כפי שהיא משתקפת ביציבות של OCR בתעלות הבקרה, ואת יחס האות לרעש הגבוה עבור שינויים ב-OCR בסדר גודל המושרה על ידי אוליגומיצין ו-FCCP, שהיה יותר מ-100 ל-1. בנוסף, ניתן להשתמש במבדקים של שברי זרימה כדי לתאם את קצב הקליטה או הייצור של מגוון רחב של תרכובות המתחלפות עם הנוזל החוץ תאי המשלימות את OCR (במקרה זה, LPR). תכונות אלה של המכשיר אפשרו כימות מדויק של הבדלים אופייניים בתגובות הרקמה בין סוגי רקמות שבוצעו במקביל. OCR על ידי RPE-choroid-sclera ותאי RPE רגישים באופן עקבי יותר לאוליגומיצין מאשר רשתית (איור 11 ואיור 12), אם כי עבור RPE-choroid-sclera משך החשיפה ל-FCCP לא היה ארוך מספיק כדי להגיע למצב יציב. נקודה שיש לקחת בחשבון התעוררה בעת שימוש ב- DMSO כממס. בריכוזים גבוהים יותר, (0.2%) DMSO השפיע באופן חולף על OCR על ידי הרשתית (ככל הנראה משקף השפעה של שינוי בלחץ האוסמוטי שנגרם על ידי השפעת DMSO על חדירות הממברנה).
בהתבסס על ההנחה ש-KCN מעכב לחלוטין את הנשימה על ידי פעולתו הישירה על ציטוכרום c אוקסידאז, OCR בסוף החשיפה ל-KCN מוגדר ל-0 וכל ערכי ה-OCR מחושבים על בסיס השינוי ביחס לערך KCN. OCR יכול להתרחש ללא תלות בשרשרת הנשימה ובציטוכרום c אוקסידאז. עם זאת, גודל התרומה הזו ל-OCR הכולל הוא בדרך כלל לא יותר מאחוזים בודדים (הנתונים לא מוצגים) ומשך הזמן הממושך שבו הרקמה נחשפת ל-KCN מבטיח שמצעים של אוקסידאזים שאינם חלק משרשרת הובלת האלקטרונים הידלדלו.
ניתוח סטטיסטי ניסויים בודדים הוצגו כפי שמצוין באיורים, אך עם ערוצים מרובים שהיו ממוצעים. הנתונים הוצגו בגרפים כממוצע ± שגיאת התקן (SE; מחושב כ-SD/√n).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2.jpg"> איור 1. סכמטי של מערכת הפלואידיקה/הערכה. המרכיבים העיקריים כוללים את המארז, רכיבי בקרת טמפרטורה, מערכות פלואידיקה ותאי רקמות, ויסות לחץ הגז בחלל הראש מעל פריפוזאט, ניטור אספן שברים / קצב זרימה, וגלאי O2 . קיצורים: MRM = מודול מאגר מדיה, PCM = מודול תא היתוך, TCA = מכלולי תאי רקמות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig02.jpg"> איור 2. (A) תמונה של המרכיבים העיקריים של המכשיר. המרכיבים העיקריים כוללים מיכל גז (וסתי לחץ), מארז, אספן שברים ומחשב. (B) תרשים זרימה ניסיוני המציג את קטגוריות השלבים העיקריות ואת הזמן שנדרש להשלמתן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig03.jpg"> איור 3. מבט על MRM. ה-MRM מוצג עם תוספת MRM (משמאל) ומוטות ערבוב (מימין) הממוקמים בתחתית תוספות ה-MRM (ממוקמות בכל צד של מחיצת MRM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig04.jpg"> איור 4. הרכבת צינורות וטיהור מכלול צינורות ב- MRM. (A) בדיקת מכלול צינורות הזרקה מורכבים ומכלול צינורות טיהור המחוברים ליציאות ב-MRM. (ב-ג) מכלול ההזרקה של תרכובת הבדיקה ומכלול צינורות הטיהור (B) ממוקמים בחריץ בחזית המארז (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig05.jpg"> איור 5. הפעלת בקר הטמפרטורה MRM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig06.jpg"> איור 6. תאי רקמות ומיכל גז. מיקום גלאי O2 על מעמד הגלאי (התומך גם ב-MRM וב-PCM), ומיקום הרצועה סביב הסנפירים של ה-PCM המסייעים לאבטח את תאי הרקמה במקומם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig07.jpg"> איור 7. (A) וסתי לחץ גבוה ונמוך במיכל הגז. (ב-ג) צינור טיהור. צינור הטיהור מאפשר למרווח הראש ב-MRM להתנקות מהאוויר ולהתמלא בגז ממיכל האספקה. תמונות המציגות צינור טיהור פתוח (B) וצינור טיהור סגור (C). מכלול ההזרקה של תרכובת הבדיקה נשאר סגור לאורך תהליך הטיהור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig08v3.jpg"> איור 8. תא הרקמה ומערך היציאה. (A) מידות קרום הטרנסוול לאחר חתיכתו לשלוש רצועות ברוחב שווה. (B) תמיכה בזרימה מרובת צינורות. (C) תמיכה מרובת צינורות המוציאה החוצה הממוקמת על שפת המארז עם מתאמי הצינור ליד תאי הרקמה. (D) תמונה של מכלולי צינורות זרימה המחוברים לתאי הרקמה. (ה) תצלום אוויר של המתחם ללא מכסה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig08largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig09.jpg"> איור 9. הזרקת תרכובת ב-MRM. הזרקת תרכובת בדיקה דרך פתח ההזרקה לתוך MRM באמצעות מזרק 5 מ"ל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig09large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig10.jpg"> איור 10. עקומות OCR ו-LPR בתגובה לתרכובות בדיקה. OCR ו- LPR על ידי רשתית מבודדת מעכברים (רשתית אחת / ערוץ) בתגובה לנוכחות או היעדר (בקרה) של תרכובות בדיקה כפי שצוין. כל עקומה היא הממוצע של 6 עותקים משוכפלים מניסוי יחיד (קווי שגיאה הם SE; ערכי p מחושבים על ידי ביצוע מבחני t זוגיים המשווים ערכי מצב יציב עבור כל סוכן בדיקה לזה של סוכן הבדיקה הקודם). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig11.jpg"> איור 11. עקומות זיהוי תווים אופטי (OCR). OCR על ידי RPE-choroid-sclera ורשתית שבודדה מעכברים (רשתית אחת או 2 RPE-choroid-sclera/channel) שנמדדו במקביל בתגובה לתרכובות הבדיקה כפי שצוין. נתונים הם הממוצע של עותקים משוכפלים מניסוי יחיד (n = 2 ו- 4 עבור RPE-choroid-sclera ורשתית בהתאמה; ערכי p מחושבים על ידי ביצוע בדיקות t זוגיות המשווה ערכי מצב יציב עבור כל סוכן בדיקה לזה של סוכן הבדיקה הקודם). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig11large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig12.jpg"> איור 12. עקומות OCR ו-LPR מתאי RPE. OCR ו- LPR מתאי RPE המחוברים לממברנות טרנסוול שנחתכו לרצועות והועמסו לתאי הפריפוזיה. נתונים הם הממוצע של עותקים משוכפלים מניסוי יחיד (n = 3, עם 1.5 ממברנות לערוץ (360,000 תאים לערוץ); ערכי p מחושבים על ידי ביצוע בדיקות t זוגיות המשווה ערכי מצב יציב עבור כל סוכן בדיקה לזה של סוכן הבדיקה הקודם). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig12large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>רקמה/תא</td>
			<td>סכום/ערוץ</td>
			<td>קצב זרימה: מ"ל/דקה</td>
		</tr><tr><td>רשתית (עכבר)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.025</td>
		</tr><tr><td>RPE-choroid-sclera (עכבר)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.02</td>
		</tr><tr><td>תאי RPE על ממברנות Transwell</td>
			<td>360,000 תאים (4 x 1/3 רצועות מסנן)</td>
			<td>0.016</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1. מפרטי הפעלה מומלצים לרקמות שונות.
תרשים משלים 1. ייצוג גרפי של עיצוב ניסיוני. עיתוי והרכב החשיפה לתרכובות בדיקה, ועיתוי איסוף השברים. תוספת ריכוז (Conc Inc) היא השינוי בריכוז שיש ליישם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
תרשים משלים 2. ממשק משתמש בעת ההפעלה. ממשק המשתמש של חלון ההפעלה של תוכנת הזיהוי O 2 המנטרת את ה- O2 בתאי הרקמה המוכנסים ל- PCM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig2.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
תרשים משלים 3. ממשק משתמש עבור הגדרות ניסוי. ממשק משתמש להזנת מידע ניסיוני (משמאל) ובחירת מועדים לאיסוף שברי זרימה (מימין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig3.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
תרשים משלים 4. ממשק המשתמש של דף ההזרקה. דף הזרקה המחשב את נפחי ההזרקה בהתבסס על ריכוזי תרכובת הבדיקה הרצויה והנפח שנותר ב-MRM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig4.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 1: שיטות להכנת דגימת רקמות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

ניתוח בזמן אמת של רקמות חיות מניב נתונים פונקציונליים ומכניסטיים חשובים. מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים והמשתנים הקריטיים כדי להבטיח ייצור מדויק וניתן לשחזור של נתונים על ידי מערכת זרימה רב-ערוצית חדשנית ונטולת משאבות, השומרת ומעריכה מגוון רחב של מודלים של רקמות ותאיים.

תחזוקה והערכה של סוגי רקמות ותאים שונים של העין באמצעות מערכת חדשנית של Pumpless Fluidics

Many in vitro models used to investigate tissue function and cell biology require a flow of media to provide adequate oxygenation and optimal cell ...

המכשירים הנפוצים ביותר המשמשים למדידת צריכת חמצן אינם תומכים באיסוף סימולטני של שברים יוצאים. זה קריטי גם לבדוק את זרימת הדם כדי להתאים את חילוף החומרים עם תפקוד הרקמות. המדידה של הטכנולוגיה יכולה להעריך טוב יותר את המנגנונים התאיים המתווכים את תפקוד הרקמה ואת המחלה.האתגר המרכזי במדידת צריכת חמצן ורקמות חיות הוא אספקת חמצן מספקת לשמירה על כדאיות הרקמה ותפקודה. זה מושג בצורה הטובה ביותר עם מערכות זרימה. ניצול לחץ גז במקום משאבות פריסטלטיות סטנדרטיות מפשט מאוד את ההליך וגם מבטל היווצרות בועות.התועלת של מדידה מטבולית טובה רק כמו יכולתה לכמת ולשכפל את התוצאות. הפרוטוקול שלנו ממנף את השילוב של קצב זרימה מבוקר במדויק עם זיהוי יציב לכל החיים של חמצן מומס הן בזרימה והן ביציאה. גישה זו יכולה לפתור שינויים בצריכת החמצן אפילו של אחוזים בודדים.התהליכים הביוכימיים המתווכים את תפקוד הרשתית הם תוצאה של יחסי הגומלין המטבוליים בין רקמות שונות של העין. היכולת של מערכת הזרימה שלנו להעריך סוגי רקמות מרובים עם גיאומטריות מגוונות מאפשרת לחקור את התכונות המהותיות הייחודיות של כל סוג תא ואת הפונקציות המתואמות שלהם. מחלות רבות מהן סובלת העין נגרמות כתוצאה מפגיעה במסלולים המטבוליים ובאיתות.אנו מתמקדים במדידת צריכת החמצן ושחרור תוצרי לוואי מטבוליים על ידי רקמות העין על מנת לאפיין, להבין ולטפל בהתפתחות מחלות רשתית וניוון.

maintaining-assessing-various-tissue-cell-types-eye-using-novel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

המכשיר microfluidic perifusion איון פותחה להערכת הפרשת אינסולין הדינמי של איים רבים דימות פלואורסצנטי סימולטני של זרם סידן שינויים אפשריים המיטוכונדריה.

Multi-פרמטרית Perifusion איילט מערכת בתוך התקן Perifusion Microfluidic

פרוטוקול זה משכפל את זרימת דם פיזיולוגית או פתולוגי במבחנה כדי לסייע בקביעת תגובת תא בפתולוגיות מחלה. על ידי החדרת לחץ דעיכת הקאמרית במורד הזרם של משאבת דם, זרימת דם בכלי הדם ברחבי ניתן סכמה והוטלה על monolayer של האנדותל של כלי דם או תרבות משותפת כוזב.

במבחנה הדגם של פיזיולוגי ופתולוגיים זרימת דם עם בקשה לחקירות של שיפוץ תא דם

נוכחי במבחנת מודלים להערכת עדשות מגע (CLS) ויישומים אחרים הקשורים עין מוגבלים קשה. הפלטפורמה העינית הציגה מדמת זרימה מדמיעה פיזיולוגית, נפח מדמיע, חשיפה לאוויר ובלאי מכאני. מערכת זו היא תכליתית מאוד יכולה להיות מיושמת שונה במבחנת מנתח עם CLS.

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Ocular כדי לבדוק עדשות מגע

פרוטוקול צעד אחר צעד גמישה, תקופה ארוכה ניטור התהליך של שיפוץ כלי הדם והשפלה לגרדום בתרבות בזמן אמת של מתכלה פולימריים מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם עם גירוי פועמת באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית מתואר כאן.

ניטור לא הורסות של פיתוח מתכלה מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

אנו מתארים ומפרטים את השימוש במערכת האוטונומית הטרנסלמינרית. מערכת זו משתמשת במגזר האחורי האנושי כדי לווסת באופן עצמאי את הלחץ בתוך המקטע (תוך עיני) וסביב עצב הראייה (תוך גולגולתי) כדי ליצור שיפוע לחץ טרנסלמינארי המחקה תכונות של נוירופתיה אופטית גלאוקומטית.

מודל מערכת אוטונומית טרנסלמינארית לאפנולציה של לחץ תוך עיני ותוך גולגולתי במקטעים האחוריים של התורם האנושי

מטרת פרוטוקול זה היא להסביר ולהדגים את התפתחותו של מודל מיקרופלואידי תלת מימדי (3D) של רקמת לב אנושית מיושרת מאוד, המורכבת מקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע במשותף עם פיברובלסטים לבביים (CFs) בתוך הידרוג'ל ביומימטי, מבוסס קולגן, ליישומים בהנדסת רקמת לב, הקרנת תרופות ומידול מחלות.

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

פציעות עיניים גלובוס פתוח עלולות ללכת מטופל במשך ימים מרובים בתרחישים כפריים או צבאיים רלוונטיים, וכתוצאה מכך עיוורון. טיפולים נדרשים כדי למזער את אובדן הראייה. כאן, אנו מפרטים מודל פציעה גלובוס פתוח תרבות איברים. עם מודל זה, טיפולים פוטנציאליים לייצוב פציעות אלה ניתן להעריך כראוי.

פלטפורמת תרבות איברים מגזריי חיצוני למעקב אחר פציעות גלובוס פתוח וביצועים טיפוליים

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במיקרונדוסקופיית לייזר קונפוקלית סיבים אופטיים (CLM) כדי לחקור באופן לא פולשני את ההתפלגות המרחבית-זמנית של ליפוזומים בעין לאחר הזרקה תת-ימית.

Spatio-Temporal In Vivo הדמיה של מערכות אספקת תרופות עיניות באמצעות מיקרונדוסקופיה לייזר קונפוקל קונפוקלי פיברופטים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור והפעלה של מערכת מיקרופלואידית החושפת תאי אנדותל להיפרגליקמיה אוסצילטורית מסונכרנת ולמתח גזירה פועם. גישה זו מספקת מודל פיזיולוגי רלוונטי לחקר תפקוד לקוי של אנדותל סוכרתי. פרוטוקול זה מאפשר מדידה כמותית של לחץ חמצוני ותגובות תאי אנדותל.

מערכת מיקרופלואידית למידול תפקוד לקוי של האנדותל תחת מאמץ גזירה פיזיולוגי פועם והיפרגליקמיה אוסצילטורית

ספקטרוסקופיית ראמאן היא טכניקה מתאימה ללא מגע, תווית ללא ניתוח של תאים חיים, רקמות מהונדסות בונה רקמות מקומיות. מקור ספציפיים טביעות אצבעות ספקטרלית ניתן להפיק נותחו באמצעות ניתוח רב משתני.

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

למדו שיטה חדשנית לניתוח מטבולי בזמן אמת של רקמות עין באמצעות מערכת פלואידיקס רב-ערוצית ללא משאבה. השיטה מאפשרת מדידה מדויקת של צריכת חמצן ותוצרי לקטט בתאי רשתית ואפיתלית פיגמנט רטינלית.

תחזוקה והערכה של סוגי רקמות ותאים שונים של העין באמצעות מערכת חדשנית של Pumpless Fluidics

גלה סרטונים נוספים