Name: פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: למדו פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקנים בתפוקה גבוהה תוך שמירה על מידע מבני תלת-ממדי. השיטה מאפשרת זיהוי אפיטופים בקירות תאים צמחיים באמצעות נוגדנים מונוקלונליים ספציפיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות ל-ArrayJet על עצותיהם המקצועיות בנוגע לרובוטיקה של מיקרו-מערך. SS ו- JS רוצים להכיר בתמיכה מקרן היסוד 2022 (FF65/004), אוניברסיטת צ'יאנג מאי.

הבהרת המבנה וההתרחשות של גליקן באמצעות פרופיל פולימרי Microarray

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

טכניקת MAPP המתוארת כאן היא כיום שיטה מבוססת היטב לניתוח גליקנים. העקרונות הבסיסיים תוארו לראשונה בשנת 200711, אך הטכניקה עברה פיתוח מתמשך על מנת לנצל את החידושים האחרונים בטכנולוגיית מיקרו-מערך, פיתוח בדיקות מולקולריות והתקדמות בהבנתנו את הביוכימיה הגליקנית. באופן כללי, גליקנים, במיוחד פוליסכרידים, מאתגרים יותר לניתוח מאשר חלבונים ונוקלאוטידים בשל מורכבותם המבנית וההטרוגניות שלהם45, כמו גם העובדה שלא ניתן לרצף או לסנתז אותםבקלות 1. במקרים רבים, אין טכניקה אחת שיכולה לפענח את מורכבות הגליקן באופן חד משמעי; לכן, MAPP משמש לעתים קרובות עם שיטות אחרות. זוהי אחת הסיבות מדוע הכנת AIR נבחרת בדרך כלל כנקודת התחלה עבור MAPP, שכן AIR תואם לרוב שיטות ניתוח גליקן אחרות34, מה שמקל על ההשוואה הבאה של מערכי נתונים.
בשל הומוגניזציה של הדגימה לפני הכנת AIR, חלק מהמידע המרחבי הולך לאיבוד תמיד. עם זאת, כמו פוליסכרידים משוחררים ברצף מדגימות, נוכחות של אפיטופים בשברים המתקבלים מספק מידע על הארכיטקטורה המולקולרית ואת ההרכב של מדגםזה 17. לכן, בחירת משטר מיצוי מתאים היא קריטית להצלחת השיטה. פרמטרים מרובים קובעים את התאמת שיטת המיצוי: מבנה תאי, זמן, טמפרטורה, pH, לחץ, חוזק יוני של הממס ועדינות דגימת החלקיקים המוצקים49. מומלץ להשתמש במגוון של ממסים אגרסיביים יותר ויותר כדי למקסם את הסבירות למיצוי מוצלח של גליקנים המרכיבים ובניית תמונה קומפוזיציונית מייצגת של הדגימה. עבור רוב הדגימות, CDTA, NaOH וצלולאז מספיקים כדי להסיר אחסון שמקורו בצמחים ורב-סוכרים של דופן התא 33,50,51,52. עבור דגימות רקמה מסוימות, משטר מיצוי היברידי הכולל גם CaCl2, HCl ו- Na2CO3 הוכח כמוצלח53, בעוד שדגימות מיקרו-אצות ימיות עשויות לדרוש תוספת של חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA)10.
מיקרו-מערכים צריכים לכלול מגוון של תקני גליקן טהורים ומוגדרים שישמשו כבקרות חיוביות5. יש לשנות את התקנים הכלולים בהתאם לאופי המדגם. לאחר ההדפסה, יש לבחור GRMPs מתאימים. הדור של mAbs היברידי למבנים רב-סוכריים הוא מאתגר54; נוגדנים קושרי גליקן קשים להעלאה ויכולים להיות בעלי זיקה נמוכה55. למרבה המזל, ניתן לקבל בקלות יחסית מידע על רצף גנים עבור CBMs עבור ביטוי רקומביננטי4 והנדסה של סגוליות הקישור שלהם56,57. בעוד קטלוג מרשים של GRMPs פותח, כאשר רובם זמינים כיום ממקורות מסחריים, יחסית למגוון המבנים הגליקניים הקיימים בטבע, רק חלק קטן יוצרו ואופיינו בהצלחה58. זה יכול להגביל את היכולת לזהות ולהפלות בין מבנים מסוימים. מומלץ לבצע ניסוי חיטוט ראשוני באמצעות בדיקה אחת או שתיים המייצגות כל מבנה גליקן עיקרי הצפוי להיות נוכח, אשר ספציפיות הקישור מאופיינת היטב. בניסויי החיטוט הבאים, ניתן להרחיב את רשימת הגשושיות כדי לכסות טווח רחב יותר של גליקנים ולהעמיק במבנים עדינים.
למרות שזה שגרתי, הבטחת שטיפת מיקרו-מערכים ביסודיות לאחר כל שלב דגירה היא בסיסית להצלחת הליך החיטוט. הסרה לא יעילה של גשושיות שאינן קשורות באופן ספציפי עשויה לטשטש את התוצאה על ידי גרימת אות רקע גבוה בעקבות התפתחות צבע. במקרה זה, יש צורך לחזור על הליך חיטוט, החל microarray חדש. יתר על כן, יש לגעת במערכים במשורה ורק על ידי אחיזת הקצוות במלקחיים; קרום הניטרוצלולוז שביר וניזוק בקלות. פתרון פיתוח הצבע נאסף בסדקים וקמטים, וגורם לרוויית יתר, המעכבת ניתוח מערך.
MAPP מהיר, ניתן להתאמה ונוח. שיטה זו מתאימה לגליקנים מן החי, החיידקים או הצמחים שמקורם בכל מערכת ביולוגית או תעשייתית, כל עוד ניתן לחלץ אותם ולשתק אותם על ניטרוצלולוז, ועבורם יש בדיקות מולקולריות מתאימות. הנתונים המופקים מספקים תובנה מפורטת, כמותית למחצה, קומפוזיציונית, שלא ניתן להשיג בקלות באמצעות שיטות ניתוח גליקניות אחרות.

גליקנים נמצאים בכל תחומי החיים ומפגינים גיוון חסר תקדים במבנה ובתפקוד בהשוואה למקרומולקולות אחרות1. עם זאת, בשל מורכבותם, השונות בביוסינתזה ובקשרים גליקוזידיים, ומיעוט השיטות המתאימות לניתוח מבנים גליקניים, הבנתנו את המגוון הזה במבנים ובפונקציות מוגבלת יחסית2.
טכניקות ניתוח גליקנים רבות הן הרסניות ומחייבות פירוק של גליקנים לחד-סוכרים המרכיבים אותם, מה שיכול לטשטש הקשרים תלת-ממדיים וביולוגיים רלוונטיים3. לעומת זאת, נוגדנים חד-שבטיים (mAbs), מודולים קושרי פחמימות (CBM), לקטינים, אגלוטינינים נגיפיים ודבקים מיקרוביאליים, הידועים ביחד כבדיקות מולקולריות מזהות גליקן (GRMPs)4, מזהים אפיטופים ספציפיים ונקשרים אליהם, וניתן להשתמש בהם ככלים לזיהוי ולהבחנה בין גליקנים בתוך מטריצות מורכבות מרובות גליקנים 5,6.
כאן, אנו מציגים פרופיל פולימרי microarray (MAPP), שיטה מהירה, רב-תכליתית ולא הרסנית לניתוח גליקן הישימה למגוון רחב של דגימות ביולוגיות. השיטה נועדה לספק טכנולוגיה חזקה ובעלת תפוקה גבוהה לניתוח גליקנים ממערכות ביולוגיות ותעשייתיות/מסחריות מגוונות. MAPP מאחד את ספציפיות הזיהוי של בדיקות מולקולריות מכוונות גליקן עם טכנולוגיית סינון microarray הניתנת לשכפול ובעלת ביצועים גבוהים כדי לאפשר פרופיל של אלפי אינטראקציות מולקולריות במקביל. התוצר של גישה זו הוא תובנה אבחנתית לגבי ההרכב והשפע היחסי של גליקנים בתוך מדגם או רקמה מעניינת.
MAPP יכול לשמש כשיטה עצמאית, עצמאית, או בשילוב עם טכניקות ביוכימיות אחרות, כגון מיקרוסקופ immunofluorescence 7,8,9 ו monosaccharide או ניתוח קישור10,11. ניתן להשתמש בטכניקה זו גם כדי למפות אפיטופים ספציפיים של GRMPs חדשים, באמצעות מערכים המודפסים עם תקני אוליגוסכריד טהורים ומוגדרים היטב מבחינה מבנית12. יתרון עיקרי של MAPP על פני שיטות אחרות, כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA), הוא התאימות שלה עם נפחי מדגם קטנים13,14. יתר על כן, MAPP מציע ניתוח תפוקה גבוהה משמעותית15 ומספק צורה יעילה של שימור דגימה, מכיוון שהדגימות המודפסות יבשות ויציבות כאשר הן משותקות על ניטרוצלולוז16.
הקשירה של GRMPs תלויה בדרך כלל בנוכחות של מספר שאריות סוכר רציפות היוצרות יחד אתר קשירה (אפיטופ) ייחודי למחלקה פוליסכרידית מסוימת (קסילן, מנאן, קסילוגלוקן וכו'). 17. לעומת זאת, שאריות הסוכר הבודדות (קסילוז, מנוז, גלוקוז) שמכומתות באמצעות רוב הטכניקות הביוכימיות, למשל הרכב חד-סוכרי או ניתוח מתילציה, יכולות להיות רכיבים של מחלקות פוליסכריד מרובות ולכן קשה להקצות אותן18.
MAPP פותח בתגובה לפער טכנולוגי, כלומר היכולת לנתח במהירות גליקנים מרובים ממגוון מקורות תוך שימוש בכמויות קטנות של חומר. MAPP מנצל את הרפרטואר הנרחב של GRMPs שפותחו ואופיינו במהלך שלושת העשורים האחרונים: 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. הפיתוח של MAPP היה תהליך איטרטיבי, עם הטכניקה להיות מעודן בהתמדה אופטימיזציה. כיום קיים גוף ספרות משמעותי המתאר את היישום של MAPP במערכות טבעיות ותעשייתיות שונות שבהן גליקנים ממלאים תפקידים מרכזיים 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. כאן, אנו מתארים את המצב הנוכחי של האמנות עבור MAPP.

<table><tbody><tr><td>1,3:1,4-&beta;-D-גלוקן, ליצ'נן (טחב איסלנדי)</td><td>Megazyme</td><td>P-LICHN</td><td></td></tr><tr><td>1,4-&beta;-D-Mannan</td><td>Megazyme</td><td>P-MANCB</td><td></td></tr><tr><td>384-well microtiter plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>M1686</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)</td><td>Melford</td><td>B74100-1.0</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>סיגמא</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>אלקליין פוספטאז AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-055-003</td><td></td></tr><tr><td>אלקליין פוספטאז AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-055-003</td><td></td></tr><tr><td>אלקליין פוספטאז AffiniPure Rabbit Anti-His Tag</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>300-055-240</td><td></td></tr><tr><td>Arabinoxylan (חיטה)</td><td>Megazyme</td><td>P-WAXYL</td><td></td></tr><tr><td>Array-Pro מנתח תוכנה</td><td>מדיה קיברנטיקה</td><td>גרסה 6.3</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus sp. צלולאז 5A (BCel5A)</td><td>NZYTech</td><td>CZ0564</td><td></td></tr><tr><td>BAM נוגדנים</td><td>SeaProbes</td><td>שונים</td><td></td></tr><tr><td>דיו ציור שחור (דיו הודי)</td><td>Winsor & Newton</td><td>GWD030</td><td></td></tr><tr><td>מודולי קשירת פחמימות</td><td>NZYTech</td><td></td> נוגדנים שונים <td></td></tr><tr><td>של CCRC</td><td>CarboSource</td><td>שונים</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma</td><td>319945</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>PHR1552</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא</td><td>1.11727</td><td></td></tr><tr><td>גלקטן (תפוח אדמה)</td><td>Megazyme</td><td>P-GALPOT</td><td></td></tr><tr><td>Galactomannan (חרוב)</td><td>Megazyme</td><td>P-GALML</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת גליצרול</td><td>Sigma</td><td>49781-5L</td><td></td></tr><tr><td>גומי tragacanth (קטניות)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1128</td><td></td></tr><tr><td>INCh נוגדנים</td><td>INRA</td><td>נוגדנים שונים</td><td></td></tr><tr><td>LM ו-JIM</td><td>PlantProbes</td><td>שונים</td><td></td></tr><tr><td>Marathon Argus Microarray מערך מדפסת</td><td>Jet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים חד שבטיים</td><td>Biosupplies אוסטרליה</td><td>שונים</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>Sigma</td><td>452882</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>ניטרו-כחול טטרזוליום (NBT)</td> <td>מלפורד</td><td>N66000-1.0</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת ניטרוצלולוזה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>88018</td><td></td></tr><tr><td>פקטין (דרגת מתיל אסטריפיקציה 46%)</td><td>Danisco</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ProClin 200</td><td>Sigma</td><td>48171-U</td><td></td></tr><tr><td>Rhamnogalacturonan (סיבים פקטיים של פולי סויה)</td><td>Megazyme</td><td>P-RHAGN</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מסתובב</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>88-861-050</td><td></td></tr><tr><td>שייקר מסתובב/נדנדה</td><td>אבקת</td> חלב דל שומן Cole-Parmer <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>מסנן Marvel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin</td><td>Costar Spin-X</td><td>8160</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי נירוסטה</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td></td></tr><tr><td>קסילן (עץ אשור)</td><td>מגה-זים</td><td>P-XYLNBE</td><td></td></tr><tr><td>, קסילוגלוקן (תמרהינדי)</td><td>מגה-זים</td><td>P-XYGLN</td><td></td></tr><tr><td>&בטא;-גלוקן (שיבולת שועל)</td><td>מגה-זים</td><td>P-BGOM</td><td></td></tr></tbody></table>

פרופיל פולימר microarray (mapp) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) הוא גישה חזקה וניתנת לשחזור לקביעה שיטתית של ההרכב והשפע היחסי של גליקנים וגליקו-מצומדים במגוון דגימות ביולוגיות, כולל רקמות צמחים ואצות, חומרי מזון ודגימות אדם, בעלי חיים ומיקרוביאליים. טכנולוגיית Microarray מבססת את יעילותה של שיטה זו על ידי מתן פלטפורמת סינון ממוזערת בתפוקה גבוהה, המאפשרת לאפיין אלפי אינטראקציות בין גליקנים ובדיקות מולקולריות ספציפיות מאוד המכוונות גליקן במקביל, תוך שימוש בכמויות קטנות בלבד של אנליטים. הגליקנים המרכיבים אותם מופרדים כימית ואנזימטית, לפני שהם מופקים ברצף מהדגימה ומושתקים ישירות על קרומי הניטרוצלולוז. הרכב הגליקן נקבע על ידי חיבור של גשושיות מולקולריות ספציפיות המזהות גליקן למולקולות הנסחטות והמודפסות. MAPP משלים טכניקות ניתוח גליקן קונבנציונליות, כגון ניתוח חד-סוכר והצמדה וספקטרומטריית מסות. עם זאת, בדיקות מולקולריות זיהויות גליקן מספקות תובנה לגבי התצורות המבניות של גליקנים, אשר יכולות לסייע בהבהרת אינטראקציות ביולוגיות ותפקידים פונקציונליים.

MAPP יושם כדי לקבוע את הרכב הגליקן של פסולת ביומסה חקלאית, הכוללת קליפות מנגו מכמה זנים צפון תאילנדיים, עיסת דובדבנים Coffea arabica ופסולת עיבוד פולי קפה, ורקמת שורש, גבעול ועלים מכל שחור תאילנדי, Allium sativum var. ophioscorodon. מספר פוליסכרידים ממקור צמחי משמשים בתעשיית המזון כמרכיבים פונקציונליים42,43. לפיכך, מטרת הניסוי הייתה להסיק האם חומרי פסולת אגרו-תעשייתיים נפוצים ובלתי מנוצלים כיום עשויים לספק מקור לרב-סוכרים טהורים בעלי ערך מוסף.
חומר AIR משמש באופן שגרתי להכנת דגימות המיועדות לניתוח גליקן44. ישנם מספר יתרונות לשימוש ב- AIR; טיפול בממסים מסיר ביעילות CAZymes אנדוגניים, מטבוליטים, סוכרים קטנים, שומנים ופיגמנטים, וכתוצאה מכך דגימות מועשרות ברב-סוכרים וחלבונים מבניים34. יתר על כן, ייצור AIR הוא דרך מהירה ויעילה להגדיל את תוחלת החיים של הדגימה, מכיוון שהוא יציב בחום וניתן לאחסן אותו במשך מספר שנים.
שלושה שברים מעורבים של גליקנים המרכיבים הופקו ברצף מחומר AIR צמחי באמצעות CDTA, NaOH וצלולאז. CDTA chelates Ca2+ יונים, המאפשרים הסרה של Ca2+ crosslinked de-esterified pectins מדפנות תאי צמח45. תנאים בסיסיים מאפשרים בעיקר המיצלולוז, כגון מנאן, קסילן ו-β-גלוקן, להשתחרר עקב שיבוש קשרי המימן וספוניפיקציה של קשרי אסטר בין מיקרופיברילים של תאית והמיצלולוז, לבין ליגנין והמיצלולוז, בהתאמה46. אנדו-1,4-β-גלוקנאז רקומביננטי מ-Bacillus spp. שימש לפירוק אזורים אמורפיים של מיקרופיברילי התאית המבנית, תוך שחרור שאריות גליקנים הקשורים לתאית בתוך דפנות התא47. למרות ששיטה זו מפרידה למעשה גליקנים לשלוש קבוצות רחבות אלה, יש לציין כי הדגימות אינן טהורות; מעצם טבעה של שיטת המיצוי, המיצלולוז, אם קיים בדגימה, יחולץ באופן בלתי נמנע ולאחר מכן יזוהה בדרגות שונות בשברים CDTA וצלולאז. כמו כן, חלק מפקטין יזוהה במיצוי NaOH אם קיים בדגימה.
רובוט הדפסת מיקרו-מערך פיאזואלקטרי ללא מגע שימש לשיתוק שברי גליקן שחולצו על ניטרוצלולוז באמצעות חיבור לא קוולנטי11, ויצר 300 מיקרו-מערכים זהים. תקני גליקן מוגדרים (טבלה 1) נכללו גם במיקרו-מערכים המודפסים כבקרות חיוביות (איור 5). פרופיל האיגוד של MAPP המתקבל עבור תקני הגליקן שנבחרו מתאים לספציפיות אפיטופית שדווחה בעבר. לדוגמה, LM21 הציג קשירה חזקה לרב-סוכרים מרובים של המן (גלקטומנן וגלוקומנן), בעוד LM22 הציג קשירה חלשה בלבד לגלקטומנן25. באופן דומה, LM19 קשור באופן מועדף להומוגלקטורונן48 דה-אסטרי ו-LM15 קשור לקסילוגלוקן זרעי תמרינדי23.
השפע היחסי של 16 אפיטופים, שאבחנו פוליסכרידים לא צלולוזיים של דופן תא הצמח, זוהו על-ידי חיבור של נוגדנים חד-שבטיים מכווני גליקן (טבלה 2) לתמציות מודפסות (איור 6). רוב הגליקנים שחולצו זוהו בתוך מקטע NaOH בסיסי. אותות קשירה חזקים נרשמו עבור mAbs LM10 ו-LM11, המייצגים קסילן/ארבינוקסילן, בתוך הקליפות של כל זני המנגו שנבדקו. בתוך דגימות השום, LM10 ו-LM11 נקשרו באופן מועדף לתמצית רקמת שורש (Garlic R) והציגו קשירה חלשה בלבד לתמצית רקמת העלה (Garlic L). LM19, המייצג הומוגלקטורונן מתיל-אסטרי חלקית או לא אסטרי, נקשר בחוזקה לחלק מתמציות זני המנגו (אאוקרונג וטלבנאק), אך נקשר רק חלש, או שלא ניתן היה להבחין בקשירה שלו, בזנים אחרים (צ'וקאנאן, מאמקמדאנג, מאהצ'אנוק ונגה). בנוסף, LM19 נקשר רק לשברים של עיסת הקפה ולא נקשר לחומר פסולת עיבוד פולי הקפה, שבעבר חשבו שהוא מורכב מפקטין קפה מטוהר למחצה (נתונים שלא פורסמו).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig01.jpg"> איור 1: שלבים ניסיוניים עיקריים בשיטת MAPP. (A) הדגימות עוברות הומוגניות ליצירת אבקות עדינות. (B) הדגימות ההומוגניות מעובדות כדי לבודד את ה-AIR שלהן. (C) הגליקנים המרכיבים מופקים ברצף באמצעות משטר מיצוי מותאם. (D) שברי הגליקן, הדיו וה-GSB שחולצו מועברים ללוחות של 384 בארות, בהתאם לפריסת הלוחות, להדפסה על ניטרוצלולוז. (E) המיקרו-מערכים המודפסים נבדקים עם GRMPs נבחרים. (F) קשירת GRMP לשברי הגליקן המודפסים מכומתת ומנותחת לפני הצגת הנתונים כמפת חום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig02.jpg"> איור 2: דוגמה לפריסת לוחות של 384 בארות עבור דגימה, דיו וטעינת GSB עם ארבעה דילולים לכל דגימת גליקן/תקן שחולץ. צבעים שונים מציינים דוגמאות הנובעות מגיבי מיצוי שונים, בעוד שגוונים שונים מייצגים דילול סדרתי. המספר הראשון בקוד מייצג את מספר המדגם, ואילו מספר הסיום מייצג את מספר הדילול (D1 מציין דילול אחד, D2 מציין דילול שניים וכן הלאה). לדוגמה, דגימת גליקן מסומנת היטב '12D3' מייצגת דגימת גליקן 12, דילול שלוש. יש לחלק את לוחות הבאר לשמונה חלקים זהים הכוללים שישה טורים ושמונה שורות. החלק הראשון של הלוח הראשון צריך להכיל דיו ומאגר בלבד ולהיות דומה לפריסת הלוח לדוגמה. לאחר מכן ניתן לטעון דגימות גליקן שחולצו לחלקי הצלחת הבאים בהתאם לפריסת הצלחת. אין לטעון ריאגנטים שונים לאותו קטע צלחת. אם אין מספיק דגימות כדי למלא קטע שלם, מלא את כל הבארות הנותרות באותו קטע בחיץ; אל תשאירו בארות ריקות. אם נדרשים לוחות מרובים, המקטע הבא לאחר טעינת כל הדגימות צריך להכיל שלוש עמודות מתחלפות של דיו ו- GSB - ייתכן שסעיף זה לא יהיה סעיף שמונה, בהתאם למספר הדגימות המודפסות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig03.jpg"> איור 3: ייצוג סכמטי של תכנון מיקרו-מערך מודפס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig04.jpg"> איור 4: מיקרו-מערכים מייצגים. (A) ללא כריכה. (B) אות האיגוד מוסתר על-ידי אות רקע גבוה. (C) צביעה כללית כחולה/סגולה עקב רוויית יתר עם NBT/BCIP. (ד) חיטוט פגום עקב ריכוז מצע גבוה. (ה) הדפסה פגומה עקב ראש הדפסה לא נקי. (F) קשירה חזקה למספר מועט של דגימות. (G) קשירה חזקה לדוגמאות רבות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig05.jpg"> איור 5: קשירת נוגדנים חד-שבטיים לתקני גליקן מוגדרים, כלולה כדי לאמת את תהליך ההדפסה והחיטוט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig06.jpg"> איור 6: MAPP של גליקנים שהופקו מפסולת ביומסה חקלאית. הדגימות כוללות פסולת עיסת קפה (עיסת קפה ופקטין קפה), קליפות מנגו ממספר זנים תאילנדיים (AO, Aokrong; כו, קם; RD, Rad; CH, Chokanan; MA, Mamkamdang; TL, Talabnak; מ"ה, מחחנוק; NG, Nga) ועלי שום שחור (Garlic L), גבעול (Garlic S), פקעת (Garlic BG) ושורשים (Garlic R), באמצעות CDTA, NaOH וצלולאז (Bacillus spp. cellulase 5A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: תקני פוליסכריד מסחריים מוגדרים המשמשים בניתוח MAPP כבקרות חיוביות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443_Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 2: נוגדנים חד-שבטיים מכווני גליקן שנבחרו לחקירת מיקרו-מערכי גליקן צמחיים שחולצו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443_Table%202.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) היא טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לניתוח הרכב גליקנים בדגימות ביולוגיות.

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...

המחקר שלנו מתמקד בפונקציות ובמבנים של גליקנים מורכבים במערכות ביתיות, תעשייתיות ומסחריות מגוונות. שיפורים נוספים בטכנולוגיית microarray ללא מגע והיכולת שלנו לגשת במהירות למידע רצף עבור מודולי קשירת פחמימות מגדילים את יכולתנו להדפיס ולחקור מיקרו-מערכים גליקניים. גליקנים מאתגרים למחקר בשל ההטרוגניות המבנית שלהם, המורכבות והשונות בביוסינתזה.שיטות ניתוח גליקנים רבות מחייבות פירוק של גליקנים לחד-סוכרים המרכיבים אותם. MAPP מציעה פלטפורמת ניתוח גליקן רב-תכליתית השומרת הרבה מהמידע התלת-ממדי המבני החשוב.

microarray-polymer-profiling-mapp-for-high-throughput-glycan-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תיאור של ההיווצרות של הפולימר microarray באמצעות טכניקת photopolymerization על שבב. אפיון משטח התפוקה הגבוהה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, מדידות זווית מגע מים, ספקטרוסקופיה Photoelectron רנטגן ושעה של ספקטרומטריית טיסה משנית יון המוני וassay מצורף תא גם תאר.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור microarray תפוקה גבוהה מרובב נוגדנים עם שיטת הזיהוי lectin כי ניתן להשתמש פרופיל glycosylation של חלבונים מסוימים. פרוטוקול זה כולל ריאגנטים אמינים חדשים מפחית באופן משמעותי את הזמן, עלויות, ציוד מעבדה דרישות לעומת בהליך הקודם.

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

Assay microarray sialoglycan ניתן להשתמש כדי להעריך נוגדנים נוגדי Neu5Gc ב sera האדם, מה שהופך אותו assay אבחון תפוקה גבוהה פוטנציאל לסרטן ומחלות כרוניות אחרות מתווך דלקת כרונית.

פרופילינג נגד Neu5Gc IgG ב Sera האדם עם Assay Microarray Sialoglycan

עבודה זו מציגה את הפוטנציאל של טכנולוגיית מערך (PGA) glycan המודפס על הניתוח של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים.

מערך Glycan המודפס: טכניקה רגישה לניתוח של הרפרטואר של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים

פרוטוקול זה מפרט את שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה, טכנולוגיית אומיקס משולבת המציעה תובנות מקיפות על הגליקופרוטאום ההטרוגני במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות הדרושות להבנה טובה יותר של הגליקוביולוגיה של סרטן.

גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות 

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשחרור O-גליקנים ממוצין, והתפלה, פרמתילציה וניתוח לאחר מכן באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF.

פרופיל של מוצין O-גליקנים פרמתילציה באמצעות ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה בלייזר בעזרת מטריצה

בפרוטוקול זה, הגן ביטוי שמרים...

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

שיטה פשוטה, מהירה לקביעת פוטנציאל saccharification של מספר גדול של דגימות ביומסה הצמח מתואר. הפלטפורמה אוטומטיים לניתוח זה כרוך בהכנה של ביומסה הצמח לניתוח ב 96 צלחות היטב את הביצועים הבאים של הידרוליזה המקדים, וכימות של סוכרים שוחרר.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

acylation הידרוקסיל '2 סלקטיבית תפוקה גבוהה נותח על ידי הארכה תחל (SHAPE) מנצל כימי רומן חיטוט טכנולוגיה, שעתוק לאחור, אלקטרופורזה נימים ותוכנות לחיזוי מבנה משנית כדי לקבוע את המבנים של RNAs מכמה מאה עד כמה אלף נוקלאוטידים ברזולוציה נוקלאוטיד יחידה.

חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה

למדו פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקנים בתפוקה גבוהה תוך שמירה על מידע מבני תלת-ממדי. השיטה מאפשרת זיהוי אפיטופים בקירות תאים צמחיים באמצעות נוגדנים מונוקלונליים ספציפיים.

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה

גלה סרטונים נוספים