Name: בדיקת תרופות מבוססות תאים למעכבי אוטופגיה הקשורים לפפטידאז ציסטאין 4B (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: חקור את תהליך האוטופגיה ואת תפקיד משפחת הפפטידאזים ATG4 בסרטן ובמחלות נוירודגנרטיביות באמצעות שיטת סקרינינג מבוססת לוציפראז. מחקר זה מסייע בפיתוח תרופות חדשות המכוונות למסלול זה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מימון ליבה של המועצה הבריטית למחקר רפואי ליחידת MRC-UCL University Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (מענק 2018RIF_15), ותוכנית UCL Therapeutic Acceleration Support Scheme, הנתמכת על ידי מימון מ- MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. הפלסמיד המקודד ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) התקבל מד"ר רובין קטלר (המחלקה לרפואה אנושית, בית הספר לרפואה בברלין).

ניתוח סינון בתפוקה גבוהה עבור מעכב אוטופגיה 4B ציסטאין פפטידאז

<ol><li>Kocaturk, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+molecular+target+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a molecular target for cancer treatment.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ATG4+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Targeting ATG4 in cancer therapy.</a> Cancers. 11 (5), 649(2019).</li>
<li>Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of autophagy.</a> EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).</li>
<li>Agrotis, A., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+ATG4B+as+drug+target+for+treatment+of+solid+tumours-the+knowns+and+the+unknowns%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns.</a> Cells. 9 (1), 53(2019).</li>
<li>Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting autophagy in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).</li>
<li>Kimmelman, A. C., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+tumor+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Autophagy and tumor metabolism.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).</li>
<li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+role+of+ATG4B+as+target+for+autophagy+inhibition+in+prostate+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).</li>
<li>Pengo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+kinases+and+phosphatases+that+regulate+ATG4B+activity+by+siRNA+and+small+molecule+screening+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148(2018).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delipidation+of+mammalian+Atg8-family+proteins+by+each+of+the+four+ATG4+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases.</a> Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).</li>
<li>Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8L%2FApg8L+is+the+fourth+mammalian+modifier+of+mammalian+Atg8+conjugation+mediated+by+human+Atg4B%2C+Atg7+and+Atg3%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3.</a> The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).</li>
<li>Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+of+human+ATG4+protease+isoforms+in+autophagy+and+LC3%2FGABARAP+processing+revealed+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells.</a> Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).</li>
<li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+family+LC3%2FGABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1%2FParkin+mitophagy+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).</li>
<li>Ketteler, R., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG4%3A+More+than+a+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATG4: More than a protease.</a> Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).</li>
<li>Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+roles+of+Atg4+proteases+from+autophagy+modulation+to+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy.</a> Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).</li>
<li>Fernández, ÁF., López-Otín, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+and+pathologic+relevance+of+autophagy+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The functional and pathologic relevance of autophagy proteases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).</li>
<li>Maruyama, T., Noda, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-regulating+protease+Atg4%3A+structure%2C+function%2C+regulation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition.</a> The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).</li>
<li>Ketteler, R., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+autophagy+by+luciferase+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Quantitation of autophagy by luciferase release assay.</a> Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).</li>
<li>Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+sensor+for+genome-wide+screens+of+intracellular+proteolytic+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage.</a> Genome Biology. 9 (4), 64(2008).</li>
<li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15, 14(2014).</li>
<li>Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+transgene+expression+in+primitive+hematopoietic+progenitor+cells+and+embryonic+stem+cells+efficiently+transduced+by+optimized+retroviral+hybrid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors.</a> Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר בדיקת גן דיווח מבוססת תאים לזיהוי מעכבי ATG4B. זיהוי פגיעות ראשוניות מבוסס על פעילות לוציפראז בטיפול בתאים המבטאים את מסגרת הקריאה הפתוחה באורך מלא של LC3B בין β-אקטין ל-dNGLUC. כמה יתרונות של בדיקה זו הם שזה רגיש, כמותי מאוד, ולא פולשני, כפי שהוא יכול לזהות dNGLUC מבלי לשקר את התאים. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט ליצירת קו תאים יציב וסינון ראשוני. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. 
ראשית, הפרוטוקול המתואר כאן השתמש בקו התאים PANC1, המציג יעילות טרנספקציה גבוהה ויכולת התפשטות...

אוטופגיה היא תהליך מטבולי שמור המאפשר לתאים לשמור על הומאוסטזיס תוך-תאי ולהגיב ללחץ על ידי פירוק תוכן תאי מיושן, פגום או מיותר באמצעות ליזוזומים 1,2,3. בתנאים פתופיזיולוגיים מסוימים, תהליך זה פועל כתגובה תאית חיונית למחסור בחומרים מזינים ובחמצן, וכתוצאה מכך חומרים מזינים ושומנים ממוחזרים, המאפשרים לתאים להסתגל לצרכים המטבוליים שלהם 2,3,4. אוטופגיה זוהתה גם כתגובת עקה תאית הקשורה למספר מחלות, כגון הפרעות נוירודגנרטיביות, זיהום פתוגן וסוגים שונים של סרטן. תפקידה של אוטופגיה בסרטן מורכב ותלוי בסוג, בשלב ובסטטוס של הגידול. זה יכול לדכא גידולים באמצעות פירוק אוטופגי של תאים פגומים, אבל יכול גם לקדם את ההישרדות של גידולים מתקדמים על ידי שיפור הישרדות התאים במהלך תנאי עקה, כגון היפוקסיה, חסך תזונתי, נזק ציטוטוקסי 2,4,5,6.
מספר מחקרים הראו כי עיכוב אוטופגיה מספק יתרון כאסטרטגיה נגד סרטן. לפיכך, עיכוב של צעדים קריטיים, כגון היווצרות אוטופגוזום או איחוי שלה עם הליזוזום, יכול להיות שיטה יעילה לשליטה בסרטן 2,4,5,6. עדויות הולכות וגדלות הראו כי ATG4B מעורב במצבים פתולוגיים מסוימים, והוא זכה לתשומת לב כיעד פוטנציאלי נגד סרטן 2,3,4. לדוגמה, נצפה כי תאי סרטן המעי הגס והחלחולת וקולטן גורם גדילה אפידרמיס אנושי 2 (HER2) חיובי לתאי סרטן השד היו בעלי רמות ביטוי ATG4B גבוהות משמעותית מאשר תאים נורמליים סמוכים 2,4. בתאי סרטן הערמונית, עיכוב ATG4B הביא לרגישות ספציפית לקו תאים לכימותרפיה והקרנות7. לאחרונה, התגלו ראיות חזקות לכך שאדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) פגיעה במיוחד לעיכוב ATG4B. לדוגמה, במודל עכבר מהונדס גנטית, הוכח כי אובדן לסירוגין של תפקוד ATG4B מפחית את צמיחת הגידול PDAC ומגביר את הישרדות 3,4. בסך הכל, ATG4B מתבטא יתר על המידה בכמה סוגי סרטן, קשור להתקדמות הגידול, והוא קשור לעמידות לטיפול בסרטן 2,4,8.
לפרוטאזות ציסטאין ATG4 ביונקים יש ארבעה בני משפחה, ATG4A-ATG4D. חלבונים אלה מפגינים סלקטיביות מטרה מסוימת כלפי משפחת החלבוניםLC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 וייתכן שיש להם תפקידים נוספים שאינם קשורים לפעילות הפרוטאז שלהם 12,13. יתר על כן, ATG4 מתפקד בוויסות סוג חדש של שינוי לאחר תרגום, ATG8-ylation של חלבונים11,12. בעוד ATG4B והמצע העיקרי שלו LC3B הם הנחקרים ביותר, מתגבשת תמונה המצביעה על תפקיד מורכב עבור כל תת-משפחה בוויסות תהליכים אוטופגיים ולא אוטופגיים. הדבר מאושש עוד יותר על ידי רשת מורכבת של שינויים פוסט-תרגומיים המווסתים את פעילות ATG4B באמצעות זרחון, אצטילציה, גליקוזילציה וניטרוסילציה 9,10,11,12,13.
מספר מעכבי ATG4B ידועים פורסמו 2,4,14,15. בעוד אלה מתאימים ככלי מחקר, הפרופיל הפרמקודינמי שלהם, סלקטיביות או עוצמה עדיין מנעו מהם לפתח כמועמדים פרה-קליניים 4,16. באופן כללי, יש צורך דחוף לזהות תרכובות חזקות וסלקטיביות יותר. לעתים קרובות, התרכובות הן מעכבות ביוכימיות טובות של תפקוד החלבון, אך יעילותן בבדיקות מבוססות תאים נמוכה. ישנן בדיקות מרובות לניטור פעילות ATG4B, כולל שיטות ביוכימיות ובדיקות מבוססות תאים4. פיתחנו בעבר בדיקה פשוטה, מבוססת לומינסנציה ובעלת תפוקה גבוהה לניטור פעילות ATG4B בתאים 8,17. בדיקה זו משתמשת בחלבון לוציפראז מנסיך גאוסיה (GLUC) שהוא יציב ופעיל בסביבה החוץ-תאית ויכול להשתחרר באופן אינדוקטיבי מתאים בתגובה לפעילות פרוטאוליטית ATG4B18,19.
במבנה כתב זה, dNGLUC מקושר לשלד האקטין של תאים. ניתן להכניס מקשר ספציפי לפרוטאז בין עוגן β אקטין לבין dNGLUC, מה שהופך את ההפרשה לתלויה במחשוף של המקשר. השתמשנו במסגרת קריאה פתוחה באורך מלא של LC3B בין β-actin ו-dNGLUC, כדי להיות מסוגלים לנטר מחשוף LC3B17,18,19. למרות שמנגנון ההפרשה של dNGLUC אינו מובן היטב, הוא ספציפי לניטור פעילות ATG4B, אינו תלוי באוטופגיה כללית כפי שהיא מתרחשת בתאי נוקאאוט ATG5, ומתווך על ידי מנגנונים לא קונבנציונליים שאינם דורשים פפטיד אות קלאסי 4,18,19. השתמשנו בהצלחה בכתב זה כדי לסנן מולקולות קטנות וספריות siRNA, וזיהינו רגולטורים חדשים של פעילות ATG4B, כגון חלבון Akt קינאזות8. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לשימוש בכתב לוציפראז זה בפורמט סינון חצי אוטומטי, בתפוקה גבוהה.

<table><tbody><tr><td>50 ומיקרו; L טיפים חד פעמיים - לא מסוננים, טהורים, מקוננים 8 ערימות (מחסנית פסיבית)</td> <td>Tecan</td><td>30038609</td><td>מתלה חד פעמי 96 קצוות</td></tr><tr><td>BioTek MultiFlo</td><td>BioTek</td><td></td><td>מתקן בתפזורת</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-205904</td><td>מצע</td></tr><tr><td>קולומבוס תוכנת ניתוח תמונה</td><td>Perkin Elmer</td><td>גרסה 2.9.1</td><td>תוכנת ניתוח תמונה</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>הד מוסמך 384 בארות פוליפרופילן מיקרופלייט, שקוף, לא סטרילי</td><td>בקמן קולטר</td><td>001-14555</td><td>384PP צלחת</td></tr><tr><td>EnVision II</td><td>פרקין אלמר</td><td></td><td>קורא צלחות זוהר</td></tr><tr><td>אקספרס פיק ספרייה (96-well)-L3600-Z369949-100& L</td><td>Selleckchem</td><td>L3600</td><td>Selleckchem</td></tr><tr><td>FMK9A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-100522</td><td></td></tr><tr><td>Greiner FLUOTRAC 200 384 לוחות באר</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781076</td><td>צלחות 384 בארות מוצק-שחור</td></tr> תוכנת <tr><td>הדמיה</td><td>Perkin Elmer</td><td>גרסה 5.1</td><td>תוכנת הדמיה</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - תמיסה של 10 מ"ג/מ"ל במים</td><td>סדרת ThermoFisher</td><td>H3570</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>Labcyte Echo 550 עם תוכנת Echo Cherry Pick</td><td>Labcyte/Beckman Coulter</td><td></td><td>מתקן נוזלי אקוסטי בקנה מידה ננומטרי</td></tr><tr>מים<td>Milli-Q מים</td><td></td><td></td><td>נטולי יונים</td></tr><tr><td>Opera Phoenix מערכת הקרנה בעלת תוכן גבוה</td><td>פרקין אלמר</td><td></td><td>מיקרוסקופ אוטומטי</td></tr><tr><td>תמיסת פרפורמלדהיד 4% ב-PBS</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 384-well, שחור, שקוף אופטית-תחתית שטוחה, מטופל בתרבית רקמות, מכסים</td><td>Perkin Elmer</td><td>6057300</td><td>CellCarrier-384 Ultra PN</td></tr><tr><td>pMOWS-ActinLC3dNGLUC</td><td></td><td></td><td>התקבל מד"ר רובין קטלר (המחלקה לרפואה אנושית, בית הספר לרפואה בברלין)</td></tr><tr><td>זיהום פוליברן / מגיב טרנספקציה</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td>פוליברן</td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals</td><td>ThermoFisher</td><td>J61278.ME</td><td>Puromycin</td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 רובוט</td><td>Tecan</td><td></td><td>טיפול בנוזלים פלטפורמה רובוטית</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA TRANSFECTION Reagent Roche</td><td>Merck</td><td>6366244001</td><td>מגיב העברת DNA</td></tr></tbody></table>

בדיקת תרופות מבוססות תאים למעכבי אוטופגיה הקשורים לפפטידאז ציסטאין 4b

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

עדויות הולכות וגדלות הראו כי שטף אוטופגי גבוה קשור להתקדמות הגידול ולעמידות לטיפול בסרטן. בדיקת חלבוני אוטופגיה בודדים היא תנאי מוקדם לאסטרטגיות טיפוליות המכוונות למסלול זה. עיכוב של פרוטאז אוטופגיה ATG4B הוכח כמגביר את ההישרדות הכוללת, דבר המצביע על כך ש- ATG4B יכול להיות מטרה פוטנציאלית לטיפול בסרטן. המעבדה שלנו פיתחה בדיקה סלקטיבית מבוססת לוציפראז לניטור פעילות ATG4B בתאים. עבור בדיקה זו, המצע של ATG4B, LC3B, מתויג במסוף C עם לוציפראז סודי מהקופפוד הימי Gaussia princeps (GLUC). כתב זה מקושר לשלד הציטופלזמה של האקטין ובכך שומר אותו בציטופלסמה של תאים כאשר הוא משוחרר. מחשוף בתיווך ATG4B גורם לשחרור GLUC על ידי הפרשה לא קונבנציונלית, אשר לאחר מכן ניתן לנטר על ידי קצירת supernatants מתרבית תאים כמתאם של פעילות ATG4B תאית. מאמר זה מציג את ההתאמה של בדיקה מבוססת לוציפראז זו לסינון אוטומטי בתפוקה גבוהה. אנו מתארים את זרימת העבודה והאופטימיזציה לניתוח מופתי של תפוקה גבוהה של פעילות ATG4B סלולרית.

בפרסום קודם8, השתמשנו בהצלחה בבדיקה זו כדי לסנן ספריות מולקולות קטנות וספריות siRNA וזיהינו רגולטורים חדשים של ATG4B. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול ואת התוצאות המייצגות של כתב luciferase זה בפורמט סינון חצי אוטומטי, תפוקה גבוהה. איור 8 מציג דוגמה לניתוח נתונים גולמיים הן עבור גרעיני תאים והן עבור לומינסנציה. תוצאה טיפוסית של מדידת הארה מתוארת באיור 8A. ניתן לראות את אות ההארה הבסיסית מ- DMSO בעמודה 1, ובנוכחות 10 מיקרומטר של מעכב ATG4B FMK...

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשימוש בבדיקת כתב מבוססת לוציפראז בפורמט סינון חצי אוטומטי, בתפוקה גבוהה.

בדיקת תרופות מבוססות תאים למעכבי אוטופגיה הקשורים לפפטידאז ציסטאין 4B

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...

המטרה העיקרית של המחקר במעבדה שלי היא להבין את הרגולציה של אוטופגיה ובמיוחד של פרוטיאן ציסטאין ATG4 ולהשתמש בידע הזה כדי לפתח מעכבי מולקולות קטנות המכוונים למסלול זה במיוחד למחלות כגון סרטן הלבלב. אנו משתמשים בתוכן גבוה, טכנולוגיות סינון בתפוקה גבוהה כדי לזהות מטרות לתרופות כמו גם מועמדים לתרופה, ואנו מתמקדים במשפחת פרוטאז ציסטאין ATG4 מכיוון שאנו חושבים שזו מטרה טובה מאוד לתרופות עבור סוגים שונים של סרטן. אנחנו חוקרים את בני משפחת ATG4 כבר די הרבה זמן.גילינו תגליות משמעותיות לגבי תפקוד לקוי של משפחת החלבונים והתאים האלה. זיהינו גם מנגנוני ויסות פוסט-תרגומיים חדשים של בני משפחת ATG4 וכיום אנו מפתחים מעכבי מולקולות קטנות וגם מפעילים של משפחות ATG4 למחלות כגון סרטן וניוון עצבי. אין הרבה בדיקות לניטור פעילות פרוטאז ATG4 בתאים.אז היינו בין הראשונים לפתח בדיקה מבוססת לוציפראז כדי לפקח על פעילות זו. והבדיקה שלנו היא די יוצאת דופן מכיוון שהיא משתמשת בביטוי מופרש, נניח, ולכן אנחנו לא צריכים רישיון לתאים ואנחנו יכולים להתאים את הפרוטוקול הזה בקלות לשיטות סינון בתפוקה גבוהה ואוטומציה במעבדה. התמקדנו בפרוטאז של חלבון ATG4 B כבר די הרבה זמן.יצרנו שורות תאי נוקאאוט של בני משפחת ATG4. זיהינו מנגנוני ויסות פוסט-תרגומיים חדשים של ATG4, ובסופו של דבר זיהינו גם כמה תרכובות חדשות של מולקולות קטנות שיכולות לעכב ואפילו להפעיל את פרוטאז ATG4 B. בעתיד, נרצה להמשיך את עבודתנו על בני משפחת ATG4.אנחנו חושבים שזה די הרבה דברים שכרגע לא ידועים ועדיין צריכים להיחשף. לדוגמה, האופן שבו חלבונים אלה מווסתים אוטופגיה בנוירונים אינו מובן כיום לחלוטין. ברצוננו גם למקד את עבודתנו בתיקוף של תרכובות מולקולות קטנות אלה שזיהינו ואולי להשתמש במפעילים במחלות נוירודגנרטיביות.

cell-based-drug-screening-for-inhibitors-autophagy-related-4b

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Autophagy היא תהליך בכל מקום שמאפשר לתאים לבזות ולמחזר חלבונים ואת האברונים. אנו מיישמים מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתקדם כדי להמחיש ולכמת קטנים, אבל שינויים מהותיים, פיסיים הקשורים לאינדוקציה של autophagy, כולל הקמת וההפצה של autophagosomes וlysosomes, ומיזוגם בautolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

כדי לנטרל את הפצת הפתוגן, תאי מארח לארגן מחדש את שלד התא שלהם למדר חיידקים ולגרום autophagy. זיהום Shigella שימוש של תאי רקמת תרבות, מארח וגורמי הפתוגן שבבסיס תהליך זה זוהה ואופיין. תוך שימוש במודלי דג הזברה של זיהום Shigella, התפקיד של מולקולות ומנגנונים גילו נחקרים in vivo.

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

מוצגים כאן שתי שיטות מחקר של אינטראקציה עם נוגדן מבוססי חלבון: immunofluorescence ו- immunoprecipitation. טכניקות אלה מתאימים ללמוד הפיזי אינטראקציות בין חלבונים עבור גילוי הרומן מרכיבי הסלולר איתות המסלולים, הבנה חלבון דינמיקה.<br...

חקר אינטראקציות חלבון במחקר Autophagy

Mitophagy, התהליך של פינוי נפגע המיטוכונדריה, הוא הכרחי עבור תחזוקה מיטוכונדריאלי הומאוסטזיס ובריאות. מאמר זה מציג חלק mitophagy האחרונה שיטות זיהוי תאים אנושיים, Caenorhabditis elegansועכברים.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

כאן מתואר פרוטוקול המאומת היטב ופשוט למדידת נפח פעילות פחמיות autophagic בתרבית של תאים. השיטה מבוססת על לכימות שחלקן של לקטט דהידרוגנאז (LDH) בחלקים תא sedimentable, לעומת סה כ רמות LDH הסלולר.

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

נייר זה משתמש assay המבוססות על זרימת-cytometry לספריות מסך של מעכבי כימיים לצורך זיהוי מעכבי ו המטרות שלהם להשפיע על איתות לקולטן T-cell. ניתן להרחיב את השיטות המתוארות כאן גם עבור הקרנות תפוקה גבוהה.

זיהוי של מתווכים של קולטן תא T איתות באמצעות הקרנת הסרט מעכב כימי ספריות

פרוטוקול מפורט ליצירת מיקרומערכים של חלבון אנושי מורכב באמצעות הקרנת מעכבי הסרט מוצג.

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

במחקר זה, אנו מציגים מעכב-ו siRNA אסטרטגיות מבוססות להתערב השטף האוטומטי הזרע בנגיף הרפס סוג 1 (HSV-1)-הנגועים מונוציט הנגזרים התאים הדנדריטים.

siRNA אלקטרופורציה כדי לווסת את החלונות האוטומטיים בווירוס הרפס סוג 1-מונוציט הנגזר מונולוייט תאים דנדריטים

מטרת פרוטוקול זה היא לקבוע רמות אוטופגיות בסרטן הלבלב ובתאי אסינר בלבלב באמצעות אימונופלואורסנציה LC3 וכימות נקודות LC3.

הערכת רמות אוטופגיה בשני מודלים שונים של תאי לבלב באמצעות LC3 immunofluorescence

חקור את תהליך האוטופגיה ואת תפקיד משפחת הפפטידאזים ATG4 בסרטן ובמחלות נוירודגנרטיביות באמצעות שיטת סקרינינג מבוססת לוציפראז. מחקר זה מסייע בפיתוח תרופות חדשות המכוונות למסלול זה.

בדיקת תרופות מבוססות תאים למעכבי אוטופגיה הקשורים לפפטידאז ציסטאין 4B

גלה סרטונים נוספים